紅色諾卡氏菌高產菌的ARTP誘變選育與發酵條件優化

陳洲琴,張祝蘭,楊煌建,程 賢,嚴凌斌,連云陽,2*

(1.福建省微生物研究所,福建 福州 350007;2.福建省新藥(微生物)篩選重點實驗室,福建 福州 350007)

紅色諾卡氏菌細胞壁骨架(Nocardiarubracell wall skeleton,N-CWS)是由諾卡氏菌酸、阿拉伯半乳聚糖和黏肽組成的高分子聚合物[1-2]。N-CWS具有免疫調節活性,通過增強體內巨噬細胞、T細胞和NK細胞等多種免疫細胞的活性激活機體免疫功能,誘生LAK細胞和腫瘤壞死因子,對腫瘤細胞生長有明顯的抑制作用[3-6];還可以通過調節人體自身免疫系統,增強宮頸局部免疫功能,逆轉低度宮頸細胞學異常,對宮頸HPV感染等臨床治療效果良好[7-10]。此外,N-CWS對促進血管生成和皮膚創面愈合效果顯著,具有免疫活性高、副作用小的特點[11-13],在臨床上已應用于免疫性疾病、腫瘤、體外炎癥、婦科疾病、HPV感染、皰疹病毒感染的治療,具有廣闊的應用前景。常壓室溫等離子體(ARTP)誘變體系通過射頻輝光放電產生各種高能活性離子,使細胞壁和細胞膜的通透性發生改變,損傷細胞內的DNA,引起菌株突變。與化學誘變和紫外誘變等方法相比,ARTP誘變對微生物的遺傳物質損傷機制具有多樣性,因而具有突變率高、技術安全性高等獨特優勢。目前,已有相關研究利用ARTP誘變技術進行菌種選育工作,并且取得了顯著效果[14-21]。NocardiarubraFIM-PO8作為N-CWS產業化菌種,存在產量低等問題。鑒于此,作者以NocardiarubraFIM-PO8為出發菌株,采用ARTP技術進行誘變,經篩選獲得遺傳較穩定的Nocardiarubra高產菌株,并通過單因素實驗和正交實驗優化高產菌株的發酵工藝。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

出發菌株:NocardiarubraFIM-PO8,保藏于福建省微生物研究所。

葡萄糖,秦皇島驪驊;酵母粉,安琪酵母;蛋白胨,仙游三和;牛肉膏、瓊脂粉,廣東環凱;其它試劑均為分析純。

ARTP-M型常壓室溫等離子體誘變育種儀,無錫源清天木生物科技有限公司;1360B型超凈工作臺,北京亞泰科隆儀器技術有限公司;MIR-253型恒溫培養箱,日本三洋公司;ZQZY-CF8E型振蕩培養箱,上海知楚儀器有限公司;Allegra X-15R型離心機,BECKMAN公司。

1.2 培養基

斜面培養基:蛋白胨1.0%,牛肉膏0.3%,NaCl 0.5%,瓊脂2.0%,pH值7.2。

種子培養基:葡萄糖1.0%,酵母粉1.0%,純水配制,pH值7.2。

發酵培養基:葡萄糖1.0%,酵母粉1.0%,純水配制,pH值7.2。

1.3 培養方法

菌株活化:將甘油保存的菌種轉接至斜面培養基上,置于32 ℃恒溫培養箱中培養5～7 d至斜面孢子成熟,取出,4 ℃下保存。

種子液制備:將活化菌株接種至種子培養基中,于32 ℃、230 r·min-1振蕩培養36～42 h,得到種子液。

發酵培養:將種子液以0.5%的接種量轉接至發酵培養基中,于32 ℃、230 r·min-1振蕩培養120 h,收集菌體。

菌體細胞濃度(PMV,即離心后沉淀物與發酵液的比例)的測定:取10 mL發酵液,4 000 r·min-1離心10 min,棄上清液,計算菌體細胞濃度。

1.4 生長曲線的繪制

將種子液接種至100 mL/500 mL的發酵培養基中,以未接種的發酵培養基作為空白對照;將發酵液置于恒溫搖床上,于32 ℃、230 r·min-1振蕩培養,每隔6 h取樣測定菌體細胞濃度;以時間為橫坐標、菌體細胞濃度為縱坐標,繪制NocardiarubraFIM-PO8的生長曲線。

1.5 ARTP誘變

菌懸液的制備:取NocardiarubraFIM-PO8轉接至斜面培養基上,32 ℃恒溫培養6～8 d,用生理鹽水洗下斜面培養基上的菌體,混勻后,用擦鏡紙過濾,得到菌懸液,稀釋使其濃度在105～106CFU·mL-1范圍內。

ARTP誘變時間的確定:取10 μL菌懸液均勻涂布于金屬載片表面,用鑷子將其轉移至載物臺上,ARTP誘變參數:以純氦氣為工作氣體,電源功率為110 W,工作氣流量為10 L·min-1,處理距離為2 mm,誘變時間分別為5 s、10 s、15 s、30 s、45 s、60 s、90 s、120 s、180 s。ARTP誘變處理后,將金屬載片轉移至裝有1 mL生理鹽水的離心管中,振蕩洗脫,將新的菌懸液按10-1～10-6稀釋度依次稀釋,涂布于固體培養皿上,32 ℃培養6～7 d。培養3 d后對平板菌落進行計數,計算致死率[14]。

突變株的分離與篩選:選擇致死劑量適宜的誘變時間對NocardiarubraFIM-PO8菌懸液進行ARTP誘變處理,得誘變菌懸液,按10-1～10-6稀釋度依次稀釋,選取10-4、10-5、10-6等3個稀釋度的菌懸液,分別涂布于分離培養基上培養;將長出的單菌落轉接至斜面培養基上,培養7 d后,用接種環接種至種子培養基中,于32 ℃、230 r·min-1培養32～48 h,得到種子液;將種子液以2%的接種量轉接至發酵培養基中,于32 ℃、230 r·min-1培養3～5 d,收集橙紅色發酵液,離心后水洗,得到赤紅球菌濕細胞,比較不同單菌落培養的菌體細胞濃度。

突變株的遺傳穩定性:將篩選出的突變株FIM-PO8-16斜面(F0)連續傳代6次(F1～F6),經搖瓶發酵后,測定菌體細胞濃度。

1.6 發酵培養基優化

1.6.1 單因素實驗

在發酵培養基中分別添加可溶性淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、甘油作為碳源,其它條件不變,500 mL三角瓶中裝料量為100 mL,每個三角瓶中接入0.5%的種子液,于32 ℃、230 r·min-1振蕩培養72 h,測定發酵液中菌體細胞濃度,篩選發酵培養基的適宜碳源。

在發酵培養基中分別添加黃豆粉、酵母粉、花生餅粉、棉籽粉、蛋白胨作為氮源,其它條件不變,按上述方法測定發酵液中菌體細胞濃度,篩選發酵培養基的適宜氮源。

1.6.2 正交實驗

根據單因素實驗結果,選擇酵母粉(A)、葡萄糖(B)、蛋白胨(C)、糊精(D)為考察因素,以菌體細胞濃度為評價指標,設計L9(34)正交實驗優化發酵培養基組分。

1.7 發酵條件優化

將新鮮的FIM-PO8-16斜面孢子接種于優化發酵培養基中,采用單因素實驗考察種子液菌齡(18 h、24 h、30 h、36 h、42 h)、初始pH值(6.0、6.4、6.8、7.2、7.6)、接種量(0.5%、1.0%、2.0%、5.0%、10.0%)、裝料量(40 mL/500 mL、60 mL/500 mL、80 mL/500 mL、100 mL/500 mL、120 mL/500 mL)、轉速(150 r·min-1、200 r·min-1、230 r·min-1、250 r·min-1、280 r·min-1)、發酵溫度(26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃)對FIM-PO8-16菌體細胞濃度的影響。

2 結果與討論

2.1 Nocardia rubra FIM-PO8的生長曲線(圖1)

圖1 Nocardia rubra FIM-PO8的生長曲線Fig.1 Growth curve of Nocardia rubra FIM-PO8

由圖1可知,培養初期,菌體大量生長;24 h時菌體進入生長對數期;54～90 h時為菌體生長穩定期,菌體細胞濃度穩定;90 h后菌體進入衰亡期,由于培養基中營養成分不足以維持菌體生存,菌體細胞濃度下降。

2.2 ARTP誘變效果

2.2.1 ARTP誘變時間的選擇

ARTP誘變時間對NocardiarubraFIM-PO8致死率的影響如圖2所示。

圖2 ARTP誘變時間對Nocardia rubra FIM-PO8致死率的影響Fig.2 Effect of ARTP mutagenesis time on lethality of Nocardia rubra FIM-PO8

由圖2可知,NocardiarubraFIM-PO8致死率與ARTP誘變時間之間存在明顯的劑量效應關系,致死率隨誘變時間的延長先逐漸升高而后趨于穩定,誘變45 s時其致死率為73.1%;誘變90 s后菌落完全不生長。因此,最佳ARTP誘變時間為45 s。

2.2.2 突變株的篩選

以NocardiarubraFIM-PO8為出發菌株(菌體細胞濃度為2.91%),誘變處理45 s后的菌懸液經梯度稀釋涂布于分離培養基上,挑選92株單菌落進行發酵,以出發菌株的菌體細胞濃度為100%,計算突變株的相對菌體細胞濃度,結果見表1。

表1 突變株初篩結果

由表1可知,21株為正突變菌株(相對菌體細胞濃度在110%以上),其正突變率為22.83%。取初篩菌株進行二級搖瓶發酵復篩,其中FIM-PO8-16、FIM-PO8-37、FIM-PO8-69等3株突變株具有較高的菌體細胞濃度,相對菌體細胞濃度分別為175.9%、133.1%、157.3%,其中突變株FIM-PO8-16菌體細胞濃度最高,比出發菌株FIM-PO8提高了75.9%,突變效果顯著。

2.2.3 高產突變株的遺傳穩定性

菌種的遺傳穩定性是實現工業化生產的一個重要因素。突變株在傳代過程中若遺傳性狀不穩定,會導致篩選到的高產菌株傳代培養多次后發酵產能下降[22-23]。對突變株FIM-PO8-16連續傳代6次,經搖瓶發酵后測定菌體細胞濃度。以生長良好的原代菌株F0的菌體細胞濃度為100%,測得F1、F2、F3、F4、F5、F6代的相對菌體細胞濃度分別為102.1%±1.5%、101.2%±1.3%、100.5%±2.0%、100.8%±2.3%、99.4%±2.6%、93.9%±2.1%。表明突變株FIM-PO8-16傳5代發酵后菌體細胞濃度無明顯影響,菌體細胞濃度基本穩定,其遺傳較為穩定。

2.3 發酵培養基優化

2.3.1 發酵培養基組分的篩選

碳源對菌體的生長速率和細胞濃度都有很大影響,因此,選擇適宜的碳源進行菌絲體增殖培養顯得尤為重要[23]。氮源更是微生物生長所必需的營養物質[15]。發酵培養基碳源和氮源對突變株FIM-PO8-16菌體細胞濃度的影響如圖3所示。

圖3 發酵培養基碳源(a)和氮源(b)對突變株FIM-PO8-16菌體細胞濃度的影響Fig.3 Effects of carbon source(a) and nitrogen source(b) in fermentation medium on cell concentration of mutant strain FIM-PO8-16

由圖3a可知,分別以可溶性淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖和甘油為碳源時均可促進菌體生長;其中以糊精、葡萄糖為碳源時,效果更顯著,與對照組相比,菌體細胞濃度分別提高了460.0%和520.0%。

由圖3b可知,分別以黃豆粉、酵母粉、花生餅粉、棉籽粉和蛋白胨為氮源時均可促進菌體生長;其中以酵母粉、蛋白胨為氮源時,效果更顯著,與對照組相比,菌體細胞濃度分別提高了471.4%和435.7%。

2.3.2 發酵培養基組分優化

在單因素實驗的基礎上,設計L9(34)正交實驗優化發酵培養基組分,因素與水平見表2,結果分析見表3。

表2 正交實驗的因素與水平

表3 正交實驗結果

根據正交設計助手軟件分析,按極差R值確定各因素對菌體細胞濃度影響的大小順序為:酵母粉(A)>葡萄糖(B)>糊精(D)>蛋白胨(C),最佳發酵培養基配方組合為A3B3C1D2,即酵母粉2.5%、葡萄糖2.5%、蛋白胨0.5%、糊精1.0%。

2.4 發酵條件優化(圖4)

圖4 種子液菌齡(a)、初始pH值(b)、接種量(c)、裝料量(d)、轉速(e)、發酵溫度(f)對FIM-PO8-16菌體細胞濃度的影響

由圖4a可知,隨著種子液菌齡的增加,菌體細胞濃度逐漸升高,當種子液菌齡為30 h時,菌體細胞濃度最高;當種子液菌齡超過30 h后,菌體細胞濃度降低。因此,選擇種子液菌齡為30 h。

培養基的初始pH值對菌體的生長有重要的影響,合適的pH值能縮短菌體的延滯期,使菌體較快地進入對數生長期。由圖4b可知,初始pH值在6.4～7.2范圍內時,菌體能較好生長,菌體細胞濃度逐漸升高;當初始pH值為7.2時,菌體細胞濃度最高;繼續增大初始pH值,菌體細胞濃度降低。因此,選擇初始pH值為7.2。

由圖4c可知,隨著接種量的增加,菌體細胞濃度逐漸升高,當接種量為2.0%時,菌體細胞濃度最高;繼續增加接種量,菌體細胞濃度整體降低。綜合考慮,選擇接種量為2.0%。

由圖4d可知,隨著裝料量的增加,菌體細胞濃度逐漸升高,當裝料量為100 mL時,菌體細胞濃度最高;繼續增加裝料量,菌體細胞濃度迅速降低。因此,選擇500 mL三角瓶中裝料量為100 mL。

由圖4e可知,隨著轉速的升高,菌體細胞濃度逐漸升高,當轉速為230 r·min-1時,菌體細胞濃度最高;繼續提高轉速,菌體細胞濃度降低。因此,選擇轉速為230 r·min-1。

微生物只能在適宜的溫度范圍內生長,溫度過高或過低,均不利于微生物生長和繁殖。由圖4f可知,隨著發酵溫度的升高,菌體細胞濃度逐漸升高,當發酵溫度為32 ℃時,菌體細胞濃度最高;繼續升高發酵溫度,菌體細胞濃度降低。因此,選擇發酵溫度為32 ℃。

2.5 發酵條件驗證

在最優發酵條件下,對突變株FIM-PO8-16進行5次搖瓶發酵實驗,以優化前發酵條件為對照,測得菌體細胞濃度平均值為8.31%,較對照組(5.12%)提高了62.30%,說明在優化發酵條件下該突變株的菌體細胞濃度顯著提高,且優化發酵條件重復性良好。

3 結論

以NocardiarubraFIM-PO8為出發菌株,采用ARTP技術進行誘變,經篩選獲得遺傳較穩定的Nocardiarubra高產菌株FIM-PO8-16,其菌體細胞濃度比出發菌株提高了75.9%。并通過單因素實驗和正交實驗優化了突變株FIM-PO8-16的發酵工藝,確定最佳發酵培養基組分為:酵母粉2.5%、葡萄糖2.5%、蛋白胨0.5%、糊精1.0%;最佳發酵條件為:種子液菌齡30 h、初始pH值7.2、接種量2.0%、裝料量100 mL/500 mL、轉速230 r·min-1、發酵溫度32 ℃。在此條件下,FIM-PO8-16菌體細胞濃度達到8.31%。該研究對N-CWS的高效制備具有重要意義。