新疆白喉烏頭中4種生物堿的分離鑒定及含量測定

曹星星,古麗達力·賽里克,趙翡翠

(1.新疆醫科大學第四臨床醫學院,新疆 烏魯木齊 830000;2.新疆醫科大學附屬中醫醫院,新疆 烏魯木齊 830000;3.新疆維吾爾自治區中藥炮制研究重點實驗室,新疆 烏魯木齊 830000;4.新疆維吾爾自治區名老中醫藥專家傳承工作室,新疆 烏魯木齊 830000)

白喉烏頭為毛茛科烏頭屬植物白喉烏頭(AconitumleucostomumWorosch)的干燥根,主要分布在新疆、甘肅西北部以及東北地區[1]?！豆_克醫志》記載,白喉烏頭味辛、苦、熱,有大毒,具有祛風散寒、消腫止痛、通經活絡等功效,在治療風濕類疾病方面具有獨特療效[2]。白喉烏頭化學成分中生物堿含量最高,其中高烏甲素約占總生物堿的40%[3]。高烏甲素的氫溴酸鹽是臨床常用的非成癮性鎮痛藥[4],因此,白喉烏頭可作為生產高烏甲素的新植物原料[5]。白喉烏頭含有烏頭屬植物常見的雙酯型生物堿,其可能是白喉烏頭的藥效成分和毒性成分[6],因此,有必要對白喉烏頭中生物堿成分和含量進行研究。

鑒于此,作者采用硅膠柱層析、硅膠柱色譜法等手段對白喉烏頭的95%乙醇提取物中的化學成分進行分離純化,通過1HNMR、13CNMR對分離得到的4種生物堿的結構進行鑒定,并采用HPLC法測定其含量,為白喉烏頭植物資源的開發利用提供依據。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

白喉烏頭藥材,2022年采自新疆伊寧地區,經新疆醫科大學附屬中醫醫院藥學部李永和主任中藥師鑒定為毛茛科烏頭屬植物白喉烏頭(AconitumleucostomumWorosch)的干燥塊根。

硅膠,青島海洋化工有限公司;ODS反相硅膠,日本Fuji Silysia公司;石油醚、乙酸乙酯、三乙胺、二氯甲烷,天津致遠化學試劑有限公司;HSGF254薄層硅膠板,煙臺華陽新材料科技有限公司;95%乙醇、鹽酸,西安化學試劑廠;乙腈,賽默飛世爾(中國)科技有限公司;氨水,四川西隴科學有限公司。

Waters2695型高效液相色譜儀,美國Waters公司;Direct-QTM5型超純水儀,Millipore公司;SK3300LH型超聲清洗器,上?？茖С晝x器有限公司;旋轉蒸發儀,上海亞榮生化儀器廠;AG-135型電子分析天平,上海梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2 白喉烏頭生物堿的分離純化

取20 kg白喉烏頭藥材,粉碎,過3號篩,用95%乙醇冷浸提取4次,每次7 d,過濾除去殘渣,減壓濃縮,得到浸膏。將浸膏用2%HCl溶液混懸,用石油醚萃取脫脂,水相用氨水調節pH值為4,二氯甲烷萃取3次,合并二氯甲烷萃取液,減壓濃縮,得到稠狀浸膏257 g。

將稠狀浸膏拌樣后,進行硅膠柱層析分離,流動相為石油醚-乙酸乙酯-二乙胺(體積比10∶1∶0.5),每次收集1 000 mL,將第7～11次收集的洗脫液合并,減壓濃縮,結晶,干燥,得到化合物WF-1(113 mg),通過薄層色譜法和高效液相色譜法確定其為單一化合物,其HPLC純度達到96%;將第21～40次收集的洗脫液合并,減壓濃縮,浸膏拌樣后經硅膠柱色譜分離,流動相為石油醚-乙酸乙酯-二乙胺(體積比10∶1∶0.5),每次收集100 mL,將第18～22次收集的洗脫液合并,減壓濃縮,結晶,干燥,得到化合物WF-2(188 mg),通過薄層色譜法和高效液相色譜法確定其為單一化合物,其HPLC純度達到98%;將第41～60次收集的洗脫液合并,減壓濃縮,結晶,干燥,得到化合物WF-3(21 g),通過薄層色譜法和高效液相色譜法確定其為單一化合物,其HPLC純度達到98%;將第73～114次收集的洗脫液合并,減壓濃縮,浸膏拌樣后經ODS反相硅膠柱分離,流動相為乙腈-水(0～20 min,20%乙腈;20～60 min,20%乙腈～45%乙腈;60～90 min,45%乙腈;90～150 min,45%乙腈～80%乙腈),每次收集100 mL,將第53～114次收集的洗脫液合并,結晶,干燥,得到化合物WF-4(7.5 mg),通過薄層色譜法和高效液相色譜法確定其為單一化合物,其HPLC純度達到96%。

1.3 白喉烏頭生物堿含量的測定

1.3.1 對照溶液的制備

精密稱取8-去氧刺烏頭堿、異刺烏頭堿、高烏甲素、冉烏頭堿對照品適量,用乙腈配制成質量濃度分別為1.99 mg·mL-1、2.15 mg·mL-1、4.00 mg·mL-1、4.10 mg·mL-1的混合對照溶液,再梯度稀釋,配制成6種不同濃度的混合對照溶液:含0.039 8 mg·mL-18-去氧刺烏頭堿、0.043 0 mg·mL-1異刺烏頭堿、0.080 0 mg·mL-1高烏甲素、0.082 0 mg·mL-1冉烏頭堿的混合對照溶液;含0.199 0 mg·mL-18-去氧刺烏頭堿、0.215 0 mg·mL-1異刺烏頭堿、0.402 4 mg·mL-1高烏甲素、0.410 0 mg·mL-1冉烏頭堿的混合對照溶液;含0.318 4 mg·mL-18-去氧刺烏頭堿、0.344 0 mg·mL-1異刺烏頭堿、0.643 8 mg·mL-1高烏甲素、0.656 0 mg·mL-1冉烏頭堿的混合對照溶液;含0.477 6 mg·mL-18-去氧刺烏頭堿、0.516 0 mg·mL-1異刺烏頭堿、0.965 8 mg·mL-1高烏甲素、0.984 0 mg·mL-1冉烏頭堿的混合對照溶液;含0.636 8 mg·mL-18-去氧刺烏頭堿、0.688 0 mg·mL-1異刺烏頭堿、1.287 7 mg·mL-1高烏甲素、1.312 0 mg·mL-1冉烏頭堿的混合對照溶液;含0.796 0 mg·mL-18-去氧刺烏頭堿、0.860 0 mg·mL-1異刺烏頭堿、1.609 6 mg·mL-1高烏甲素、1.640 0 mg·mL-1冉烏頭堿的混合對照溶液。

1.3.2 供試溶液的制備

精密稱取白喉烏頭藥材粉末約5 g,加入適量氨水密閉,浸潤后加入適量無水乙醇,稱定質量;超聲提取30 min 后,再次稱定質量,并用無水乙醇補足,過濾,濾液揮干;殘渣用2%HCl溶液調節pH值至2,再用氨水調節pH值至11;用二氯甲烷萃取3次,合并萃取液,揮干,殘渣用乙腈溶解并定容至5 mL容量瓶中,過濾,濾液即為供試溶液[7]。

1.3.3 色譜條件

XBridgeTM-C18生物堿專用色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)[8];流動相為乙腈(A)-0.5%氨水(B),梯度洗脫,洗脫程序:0～45 min,30%A～60%A;45～80 min,60%A～80%A;80～90 min,80%A～90%A;檢測波長235 nm;流速0.7 mL·min-1;柱溫30 ℃;進樣量10 μL。該色譜條件下,對照溶液與供試溶液的HPLC圖譜呈現良好的分離度(圖1)。

（6）“煤改氣”和建設新增配電網。根據熱力和電力需求，支持業主或第三方投資主體因地制宜的以天然氣分布式能源實施“煤改氣”工程。優先支持擁有分布式電源的企業在投資建設新增配電網。在新增配電網的區域，應運行天然氣分布式能源新建微電網和配電網實現就近直供。

1.冉烏頭堿 2.高烏甲素 3.異刺烏頭堿 4.8-去氧刺烏頭堿

2 結果與討論

2.1 化合物的結構鑒定

化合物WF-1:分子式為C32H44N2O7;1HNMR(400 MHz,CDCl3),δ:1.6(t,J=7.2 Hz,3H,NCH2CH3),2.3(3H,s,NHC(O)CH3),3.3～3.4(3H,s,-OCH3),3.8(t,1H,14-H),7.1～7.5(t,J=7.7 Hz,2H,Ar-H),7.9～8.7(d,J=6.4 Hz,1H,Ar-H),11.1(1H,s,NHC(O)CH3);13CNMR(101 MHz,CDCl3),δ:84.4(C-1),26.9(C-2),32.1(C-3),84.3(C-4),46.2(C-5),29.3(C-6),46.5(C-7),74.1(C-8),45.4(C-9),37.3(C-10),25.1(C-12),49.7(C-13),84.2(C-14),42.5(C-15),82.6(C-16),61.4(C-17),57.9(C-19),115.8(C-1′),141.6(C-2′),120.3(C-3′),134.4(C-4′),122.4(C-5′),131.0(C-6′),13.5(NCH2CH3),25.4(NHC(O)CH3),48.9(NCH2CH3),56.6(16-OCH3),56.2(1-OCH3),57.8(14-OCH3),167.4(C(O)C6H4C(O)CH3),169.1(NCOCH3)。以上數據與文獻[9]報道基本一致,故鑒定化合物WF-1為8-去氧刺烏頭堿。

化合物WF-2:分子式為C32H44N2O8;1HNMR(400 MHz,CDCl3),δ:2.3(3H,s,NHC(O)CH3),3.3～3.5(3H,s, -OCH3),7.1(t,J=7.7 Hz,2H,Ar-H),7.5(t,1H,Ar-H),7.9(d,J=8.0 Hz,1H,Ar-H),8.7(d,J=6.4 Hz,Ar-H),11.1(1H,s,NHC(O)CH3);13CNMR(101 MHz,CDCl3),δ:86.5(C-1),26.9(C-2),33.4(C-3),82.6(C-4),47.7(C-5),35.9(C-6),84.3(C-7),76.4(C-8),50.8(C-9),50.1(C-10),51.6(C-11),28.9(C-12),45.1(C-13),83.8(C-14),37.2(C-15),84.2(C-16),62.8(C-17),57.8(C-19),115.8(C-1′),141.7(C-2′),120.3(C-3′),134.4(C-4′),122.3(C-5′),131.0(C-6′),25.6(C-2″),14.4(NCH2CH3),31.9(NCH2CH3),54.4(16-OCH3),56.3(1-OCH3),56.4(14-OCH3),168.0(C(O)C6H4C(O)CH3)。以上數據與文獻[10]報道基本一致,故鑒定化合物WF-2為異刺烏頭堿。

化合物WF-3:分子式為C32H44N2O8;1HNMR(400 MHz,CDCl3),δ:1.1(t,J=7.2 Hz,3H,NCH2CH3),2.3(3H,s,NHC(O)CH3),2.7(-COCH3),3.3～3.4(3H,s,-OCH3),7.1(t,J=7.7 Hz,2H,Ar-H),7.3(s,1H,Ar-H),7.9(d,J=8.0 Hz,1H,Ar-H),8.7(d,J=6.4 Hz,Ar-H),11.1(1H,s,NHC(O)CH3);13CNMR(101 MHz,CDCl3),δ:84.2(C-1),26.2(C-2),31.9(C-3),84.6(C-4),48.6(C-5),26.8(C-6),47.6(C-7),75.6(C-8),78.6(C-9),49.8(C-10),50.9(C-11),24.1(C-12),36.3(C-13),90.1(C-14),44.9(C-15),82.9(C-16),61.5(C-17),55.5(C-19),115.8(C-1′),141.8(C-2′),120.1(C-3′),134.5(C-4′),122.3(C-5′),131.2(C-6′),25.6(NCOCH3),56.1(16-OCH3),56.6(1-OCH3),57.9(14-OCH3),167.4(C(O)C6H4C(O)CH3),169.0(NCOCH3)。以上數據與文獻[11]報道基本一致,故鑒定化合物WF-3為高烏甲素。

化合物WF-4:分子式為C32H44N2O9;1HNMR(400 MHz,CDCl3),δ:1.1(t,J=7.2 Hz,3H,NCH2CH3),2.3(3H,s,NHC(O)CH3),3.3～3.5(3H,s, -OCH3),7.1(t,J=7.7 Hz,2H,Ar-H),7.5(t,1H,Ar-H),7.9(d,J=8.0 Hz,1H,Ar-H),8.7(d,J=6.4 Hz,Ar-H),11.2(1H,s,NHC(O)CH3);13CNMR(101 MHz,CDCl3),δ:83.5(C-1),26.7(C-2),30.2(C-3),84.3(C-4),38.1(C-5),31.7(C-6),85.5(C-7),77.9(C-8),78.5(C-10),48.9(C-11),51.3(C-12),25.9(C-13),32.4(C-14),90.1(C-15),36.6(C-16),82.7(C-17),63.2(C-18),51.4(C-19),115.7(C-1′),141.7(C-2′),120.3(C-3′),134.4(C-4′),122.4(C-5′),131.1(C-6′),14.7(NCH2CH3),25.6(NCOCH3),49.7(NCH2CH3),55.2(1-OCH3),56.3(16-OCH3),58.0(14-OCH3),167.5(C(O)C6H4C(O)CH3),169.1(NCOCH3)。以上數據與文獻[12]報道基本一致,故鑒定化合物WF-4為冉烏頭堿。

2.2 HPLC方法學考察

2.2.1 線性關系

按1.3.1方法配制不同質量濃度的混合對照溶液,按1.3.3色譜條件進樣測定,以質量濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制標準曲線,擬合得8-去氧刺烏頭堿回歸方程:y=8260390x+240534.97326,R2=0.9998;異刺烏頭堿回歸方程:y=9484970x+544257.31881,R2=0.9991;高烏甲素回歸方程:y=9083110x+415698.1657,R2=0.9994;冉烏頭堿回歸方程:y=6402480x+504987.8623,R2=0.9990。表明,8-去氧刺烏頭堿質量濃度在0.039 8～0.796 0 mg·mL-1范圍內、異刺烏頭堿質量濃度在0.043 0～0.860 0 mg·mL-1范圍內、高烏甲素質量濃度在0.080 0～1.609 6 mg·mL-1范圍內、冉烏頭堿質量濃度在0.082 0～1.640 0 mg·mL-1范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

2.2.2 精密度

取8-去氧刺烏頭堿、異刺烏頭堿、高烏甲素、冉烏頭堿質量濃度分別為0.477 6 mg·mL-1、0.516 0 mg·mL-1、0.965 8 mg·mL-1、0.984 0 mg·mL-1的混合對照溶液,按1.3.3色譜條件連續進樣測定6次,計算4種生物堿含量的RSD值分別為2.05%、1.78%、1.98%、1.68%,表明儀器的精密度較高。

2.2.3 重復性

精密稱取6份白喉烏頭藥材,按1.3.2方法制備供試溶液,按1.3.3色譜條件進樣測定,記錄8-去氧刺烏頭堿、異刺烏頭堿、高烏甲素、冉烏頭堿的峰面積,測得8-去氧刺烏頭堿的平均含量為0.028 mg·g-1,RSD值為2.39%;異刺烏頭堿的平均含量為0.118 mg·g-1,RSD值為1.25%;高烏甲素的平均含量為1.051 mg·g-1,RSD值為1.86%;冉烏頭堿的平均含量為0.565 mg·g-1,RSD值為1.07%,表明該方法的重復性較好。

2.2.4 穩定性

精密稱取白喉烏頭藥材粉末5 g,按1.3.2方法制備供試溶液,按1.3.3色譜條件進樣測定,分別在0 h、4 h、6 h、14 h、20 h、24 h 進樣并記錄色譜峰面積,計算8-去氧刺烏頭堿、異刺烏頭堿、高烏甲素、冉烏頭堿峰面積的RSD值分別為2.01%、1.38%、1.78%、1.69%,表明供試溶液在24 h內穩定性良好。

2.2.5 加標回收率

精密稱取白喉烏頭藥材粉末5 g,按1.3.2方法制備供試溶液,分別加入4種不同質量濃度的8-去氧刺烏頭堿、異刺烏頭堿、高烏甲素、冉烏頭堿混合對照溶液,按1.3.3色譜條件進樣測定,計算加標回收率,結果見表1。

表1 8-去氧刺烏頭堿、異刺烏頭堿、高烏甲素、冉烏頭堿的加標回收率

2.2.6 樣品測定

分別精密稱取5.002 0 g、5.003 8 g、5.002 3 g白喉烏頭藥材,按1.3.2方法制備供試溶液,按1.3.3色譜條件進樣平行測定3次,計算白喉烏頭中8-去氧刺烏頭堿、異刺烏頭堿、高烏甲素、冉烏頭堿的含量,結果見表2。

表2 樣品測定結果(n=3)

由表2可知,3批白喉烏頭藥材中8-去氧刺烏頭堿、異刺烏頭堿、高烏甲素、冉烏頭堿的平均含量分別為0.026 mg·g-1、0.124 mg·g-1、1.143 mg·g-1、0.561 mg·g-1,其中高烏甲素的含量最高。

2.3 討論

近年來,新疆干旱加劇,草場過度放牧,導致天然草原退化嚴重,可食用草很難生長,毒害草白喉烏頭卻大范圍擴張蔓延,牲畜誤食后常出現中毒或死亡現象[13],對新疆草原生態系統和地方畜牧業造成嚴重危害[14]。每年秋季,新疆地區需投入大量人力、物力防除雜草,或者采用大量除草劑防除雜草,對新疆草場造成污染[15]。將白喉烏頭作為一種藥用植物資源進行開發利用,變毒為寶,具有重要意義。

從白喉烏頭中分離得到4種生物堿,分別是8-去氧刺烏頭堿、異刺烏頭堿、高烏甲素、冉烏頭堿,其中異刺烏頭堿是首次從該植物中分離得到,為白喉烏頭中生物堿成分的深入研究提供了依據。4種生物堿的含量測定中,高烏甲素的含量最高,分離得到高烏甲素單體21 g。

高烏甲素為C18-二萜生物堿的典型代表[16],是我國首創的非成癮性鎮痛藥,常用于臨床緩解癌痛和術后鎮痛[17],高烏甲素的衍生物氫溴酸高烏甲素聯合阿片類藥可以更好地緩解患者神經病理性癌痛,減少阿片類藥的用量,降低阿片類藥帶來的不良反應,是治療神經病理性癌痛安全有效的辦法[18]。白喉烏頭中高烏甲素的分離及含量測定為白喉烏頭作為非成癮性鎮痛藥物的原料藥材開發提供了依據。

3 結論

采用硅膠柱層析、硅膠柱色譜法等手段從白喉烏頭的95%乙醇提取物中分離得到了4個二萜生物堿,分別鑒定為:8-去氧刺烏頭堿、異刺烏頭堿、高烏甲素、冉烏頭堿,其中異刺烏頭堿為首次從白喉烏頭中分離得到。采用HPLC法同時測定了白喉烏頭中8-去氧刺烏頭堿、異刺烏頭堿、高烏甲素、冉烏頭堿的含量,HPLC圖譜中各成分色譜峰清晰,分離度較好,穩定性和精密度等方法學考察均符合要求,3批白喉烏頭藥材中8-去氧刺烏頭堿、異刺烏頭堿、高烏甲素、冉烏頭堿的平均含量分別為0.026 mg·g-1、0.124 mg·g-1、1.143 mg·g-1、0.561 mg·g-1,其中高烏甲素的含量最高。該方法穩定可行,操作簡便,可用于白喉烏頭中成分的測定和質量控制,為白喉烏頭的資源化利用及質量標準制定奠定了基礎。