尿素包合法提純亞麻籽油中α-亞麻酸工藝的優化研究*

郝文來，郝 健

（深圳市誠致生物開發有限公司，廣東 深圳 518000）

亞麻籽（linseed）是草本植物亞麻的種子，紅棕色的果實外觀并且具有獨特的堅果風味[1，2]。亞麻籽的種植已有5000 多年的歷史，廣泛分布在世界各地，品質上等的亞麻籽一般生在寒帶地區，例如加拿大的西北部等，在我國種植區域主要分布在甘肅、陜西、內蒙古、山西、黑龍江以及新疆等省份。亞麻籽的應用非常廣泛，可以用于加工面包、酸奶或者谷物食品中，深受消費者喜愛。亞麻籽以其自身豐富的營養成分逐漸引起了世界眾多學者的關注，關于它的研究也越來越深入。亞麻籽中含有約40%各類油脂、28%多種膳食纖維、20%蛋白質和氨基酸,剩余12%的水分和灰分[3，4]。大量的實驗研究和臨床表現證實了亞麻籽對于人體健康和各項機能提升大有裨益，尤其是對于孕婦、嬰幼兒、“三高”人士。其主要的功效有降低血脂、減輕心臟負荷、促進大腦發育、改善便秘、改善腎功能等，亞麻籽油的功效更是被人稱為“深海魚油”[4-6]。

亞麻籽油中含有豐富的多不飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸以及包合脂肪酸，其中α-亞麻酸（ALA）的含量可以占到亞麻籽油的53%[7]。Ω-3 多不飽和脂肪酸以α-亞麻酸為母體，是組成人體細胞結構的重要成分，也是細胞進行正常新陳代謝必不可少的營養成分，是人體所必須的脂肪酸。亞麻籽油中的α-亞麻酸含量遠高于其他的核桃油、花生油、大豆油等植物油，對于很多素食者而言，亞麻籽油成為了身體獲取Ω-3 多不飽和脂肪酸的一個非常重要的途徑[4，8]。

現階段，對α-亞麻酸的分離方法有很多種，常見的主要有色譜柱法、分子蒸餾法以及尿素包合法等[3，9-11]。色譜柱法主要用于少量的樣品分離和測試，對于大規模的放大生產實驗非常局限。分子蒸餾法容易造成產品純度不夠，產品中雜質混合較多，大大影響產品品質。尿素包合法具有投資小、工藝簡單的優勢，非常適用于α-亞麻酸提純[4，5，12，13]。本文就以尿素包合法對提純亞麻籽油中的α-亞麻酸開展工藝研究。α-亞麻酸提取率最高可達81%。

1 實驗部分

1.1 原料、試劑和儀器

亞麻籽油（一級 錫林郭勒盟紅井源油脂有限責任公司），產品符合GB/T 8235-2019 涉及的特征指標、質量等級指標及污染物限量等。

α-亞麻酸標準品（99.50% 北京譜析標準技術有限公司）；甲醇、乙酸，色譜純，上海國藥供應有限公司；石油醚（沸程60～90℃AR 東莞市大偉化工有限公司）；無水乙醇、KOH、HCl 溶液、甲醇、無水Na2SO4、尿素，均為分析純，鄭州博邦化工產品有限公司。

1200 型高效液相色譜儀（匹配兼容安捷倫的索福達M100 蒸發光散射檢測器 安捷倫）；R-1005 型旋轉蒸發儀（濟南禾普儀器設備有限公司）；MS204S型電子天平（梅特勒托利多）；SHJ-A6 型恒溫水浴鍋（常州市億能實驗儀器廠）；DHG-9070A 型電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；SHZ-95B 型循環水式真空泵配套抽濾漏斗等抽濾系統（上海予華儀器設備有限公司）；錐形瓶、燒杯等玻璃陶瓷儀器（泰州市辰陽教學儀器有限公司）等。

1.2 實驗方法

1.2.1 亞麻籽游離脂肪酸的制備 首先，制備濃度為1mol·L-1的KOH-乙醇溶液，然后將亞麻籽油與其按照1∶5 的體積比進行混合，在80℃的恒溫水浴鍋中回流45min，在冷卻至室溫的混合液中加入一定量的去離子水進行溶解，之后加入石油醚對其中不能皂化的部分萃取除去。取分層后的下層溶液，使用濃度為20%的HCl 溶液對其進行酸化處理，并將溶液pH 值調節至2～3，然后將石油醚緩慢加入溶液中，同時開始攪拌混勻，再將溶液移至分液漏斗，待其充分靜置分層。分層后，將上層的有機相溶液從分液漏斗中倒出，對下層的溶劑繼續使用石油醚連續萃取至少3 次，將多次萃取的有機相合并待用。用5%的NaCl 水溶液對有機相洗至中性，再加入無水Na2SO4脫除有機相中所含有的水分，在溫度為55℃的條件下通過對濾液進行旋蒸，對其中的石油醚進行充分回收，最終從亞麻籽油中得到混合脂肪酸。

1.2.2 亞麻籽α-亞麻酸尿素包合方法 稱量一定質量尿素和一定體積的乙醇，充分混合溶解，將一定濃度的尿素-乙醇溶液按照特定比例與已制備的亞麻籽油脂肪酸混合，置于60℃水浴鍋中充分攪拌混合直至呈現透明狀態。隨后，在不同包合溫度下設定不同時間進行包合反應。連接真空泵及抽濾設備，對混合液進行抽濾處理以分離出其中的尿素結晶包合物，并得到剩余濾液。將一定量的石油醚加入到剩余濾液中，并用10%的HCl 調節濾液的pH 值至2～3，加入一定量的去離子水，保證萃取充分，分層取出有機相，多次重復萃取過程，將得到的有機相合并。將合并的有機相用5% NaCl 多次清洗，直至pH 值呈中性，用一定量的無水Na2SO4脫除去有機相殘留的水分，在溫度為50℃的條件下，對有機相進行旋蒸，以獲取高濃度的α-亞麻酸。。

1.2.3 單因素實驗 依據1.2.2 中的提取方法，分別對尿素溶液與脂肪酸體積比、包合溫度、包合時間、尿素溶液濃度等多組變量因素進行實驗研究，分析每個變量因素對α-亞麻酸提純率的影響。

1.3 α-亞麻酸含量測定

1.3.1 色譜條件

色譜柱及其參數 C18色譜柱填料，250mm×2.6mm，填充顆粒直徑5μm。

流動相參數 甲醇∶1%乙酸溶液體積比為90∶10，流動速率為1mL·min-1；色譜柱溫度為30℃；檢測波長為205nm；進樣量為20μL。

蒸發光散射檢測儀參數 索福達M100，載氣流速為2L·min-1，漂移管溫為75℃。

1.3.2 α-亞麻酸標準曲線 精確稱取10mg α-亞麻酸于10mL 容量瓶中，并用甲醇溶液定容到容量瓶刻度線，此時標準α-亞麻酸溶液濃度為1mg·mL-1。然后分別用移液槍移取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、3.0 mL 標準α-亞麻酸溶液于10mL 的容量瓶中，再用甲醇溶液定容至容量瓶刻度線，得到α-亞麻酸溶液濃度分別為0.01、0.002、0.04、0.06、0.08、0.1、0.2、0.3 mg·mL-1的標準溶液。將標準溶液進行液相色譜測定，用濃度和α-亞麻酸色譜圖峰強度進行作圖，通過Origin 9.1 進行擬合，擬合數據見表1和圖1，擬合方程：Y=1.563X+330.658，相關系數R2=1，X 為標準α-亞麻酸溶液濃度，Y 為峰面積。

圖1 標準α-亞麻酸溶液濃度和峰面積線性擬合Fig.1 Standards α-Linear fitting of concentration and peak area of α-linolenic acid solution

表1 標準α-亞麻酸溶液濃度和峰面積關系Tab.1 Relationship between concentration and peak area of standard α-linolenic acid solution

1.4 α-亞麻酸含量測定

使用梅特勒托利多分析天平準確稱取待測樣品0.1000g 加入到100mL 錐形瓶中，加入0.5mol·L-1的堿性甲醇溶液30mL，震蕩均勻，將錐形瓶封存嚴密，在60℃水浴鍋條件下對混合液充分震蕩40min，保證其充分混合。將錐形瓶取出，靜置冷卻至室溫，滴加一定量的HCl 溶液將pH 值調節至中性，將溶液整體轉移至250mL 容量瓶中，用色譜純度甲醇定容備用。移液管精確移取1.00mL 上述溶液至10mL 容量瓶并用色譜純甲醇定容，用10mL 注射器吸取一定量的溶液，通過過濾膜后將液體打入進樣瓶。在上述制定的色譜設備和參數條件下，對樣品進行液相色譜測定和分析。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗

2.2.1 混合脂肪酸與尿素溶液體積比對α-亞麻酸提取率的影響 采用尿素-乙醇濃度為0.9mol·L-1，包合溫度為-20℃，包合時間20h，考察脂肪酸和尿素的體積比分別為1∶5、1∶25、1∶45、1∶65、1∶85 對提純α-亞麻酸的影響，結果見圖2。

圖2 脂肪酸與尿素溶液體積比對α-亞麻酸提取率的影響Fig.2 Effect of the volume of fatty acid to urea solution on the extraction rate of α-linolenic acid

由圖2 可見，隨著脂肪酸與尿素溶液的體積比增大，α-亞麻酸的提取率先增大后減小，脂肪酸和尿素的體積比1∶5、1∶25、1∶45、1∶65、1∶85 分別對應10%、62%、75%、60%、49%的提取率。當脂肪酸與尿素的體積比為1∶45 時，α-亞麻酸的的提取率最大，為75%。當脂肪酸與尿素體積比過小時，脂肪酸反應不完全，脂肪酸過量，α-亞麻酸提取率過低。當脂肪酸和尿素的體積比過大，尿素過量影響與脂肪酸的包埋效果，從而也會影響α-亞麻酸的提取率。因此，綜合考慮，確定最佳的脂肪酸和尿素溶液體積比為1∶45。

2.2.2 尿素-乙醇溶液濃度對α-亞麻酸提取率的影響 采用脂肪酸和尿素溶液體積比為1∶45，包合溫度為-20℃，包合時間20h，考察尿素-乙醇溶液濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mol·L-1對α-亞麻酸提取率的影響，結果見圖3。

圖3 不同尿素-乙醇溶液濃度對α-亞麻酸提取率的影響Fig.3 Effect of different urea ethanol solution concentrations on the extraction rate of α-linolenic acid

由圖3 可見，隨著尿素-乙醇溶液濃度增大，α-亞麻酸提取率先增大后減小，尿素-乙醇溶液濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mol·L-1，α-亞麻酸的提取率分別為50%、59%、65%、69%、78%、73%、66%，當尿素-乙醇溶液濃度為1.0mol·L-1時，α-亞麻酸提取率最大，為78%。當尿素-乙醇溶液濃度較低時，尿素含量較少，尿素的溶解性好，因此，隨著尿素-乙醇溶液濃度增大，α-亞麻酸提取率增大，當尿素-乙醇溶液超過1mol·L-1后，溶液幾乎呈現飽和狀態，當尿素-乙醇濃度繼續增加，尿素溶解率下降，從而影響包合效果，造成α-亞麻酸提取率下降。因此，綜合考慮，確定最佳尿素-乙醇溶液濃度為1.0mol·L-1。

2.2.3 包合溫度對α-亞麻酸提取率的影響 采用脂肪酸和尿素溶液體積比為1∶45，包合時間20h，尿素-乙醇溶液濃度為1mol·L-1，考察包合溫度-25、-15、-5、10、15、20、35℃對提純α-亞麻酸的影響，結果見圖4。

圖4 不同包合溫度對α-亞麻酸提取率的影響Fig.4 Effect of different inclusion temperatures on the extraction rate of α-linolenic acid

由圖4 可見，隨著包合溫度的增加，α-亞麻酸提取率下降，包合溫度-25、-15、-5、10、15、20、35℃分別對應α-亞麻酸提取率為79%、78%、70%、62%、57%、50%。當溫度超過-15℃后，α-亞麻酸提取率迅速下降，溫度為25℃時，α-亞麻酸提取率僅為50%?？梢钥闯鰷囟仍降驮接欣谀蛩氐陌?，但溫度過低，一方面能耗增加，另一方面實驗室常用的冰箱冷藏溫度僅為-20℃，因此，綜合考慮，確定最佳包合溫度為-15℃。

2.2.4 包合時間對α-亞麻酸提取率的影響 采用脂肪酸和尿素體積比為1∶45，包合溫度-15℃，尿素-乙醇溶液濃度為1mol·L-1?？疾彀蠒r間12、18、24、30、36、42、48、54、60、66、72h 對提純α-亞麻酸的影響，結果見圖5。

圖5 不同包合時間對α-亞麻酸提取率的影響Fig.5 Effect of different inclusion time on the extraction rate of α-linolenic acid

由圖5 可見，隨著包合時間的增加，α-亞麻酸提取率先增大后減小，包合時間12、18、24、30、36、42、48、54、60、66、72 h 對應的α-亞麻酸提取率為58%、67%、81%、76%、71%、67%、63%、62%、62%、61.8%、62%。當包合時間為24 h 時，α-亞麻酸提取率最大，為81%。當包合時間超過24h 后，α-亞麻酸提取率下降，但當時間超過48h 后，α-亞麻酸提取率維持不變。因此，綜合考慮，確定最佳包合時間為24h。

2.3 α-亞麻酸液相色譜圖分析

以脂肪酸和尿素溶液體積比為1∶45、包合溫度為-15℃、包和時間24h、尿素-乙醇溶液濃度為1mol·L-1對亞麻酸進行提純。α-亞麻酸的液相色譜圖見圖6。

圖6 α-亞麻酸的液相色譜圖Fig.6 Liquid chromatography of α-linolenic acid

α-亞麻酸在12.5min 出峰，符合α-亞麻酸的出峰位置。

3 結論

（1）以亞麻籽油為原料，α-亞麻酸為提取目標產物，采用單因素法研究了不同脂肪酸與尿素溶液體積比、尿素-乙醇溶液濃度、包合溫度、包合時間對α-亞麻酸提取率的影響，優化了α-亞麻酸提取工藝，并采用液相色譜對提純的α-亞麻酸進行了表征。

（2）實驗結果表明，最佳實驗條件下，濃度為1mol·L-1的尿素-乙醇溶液、脂肪酸與尿素溶液的體積比為1∶45、包合溫度為-15℃、包合時間為24h 時，α-亞麻酸提取率最高可達81%。

（3）通過液相色譜對提純的α-亞麻酸進行表征，α-亞麻酸在12.5min 出峰，符合α-亞麻酸的出峰位置。