吡咯喹啉醌連續發酵工藝初探

趙子剛,金明義,劉露,張葵

(北大醫藥重慶大新藥業股份有限公司,重慶,400714)

吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinine,PQQ)是目前已知催化效率最高的氧化還原輔酶[1],最早在細菌細胞中發現[2],隨后的研究表明其在哺乳動物體內起到很重要的作用[3-4],日本的研究者認為PQQ符合維生素的特征,主張將其列為一種新的B族維生素[5]。目前的研究發現,PQQ具有促進細胞增殖[6]、促進神經生長因子合成[7]、抗氧化作用[8-9]、保護大腦[10]、保護心臟[11]、保護肝臟[12-13]、抑制淀粉樣蛋白原纖化[14]等多種生理功能。目前的研究還沒有發現動物和人類能夠自身合成PQQ,可以認為動物和人類體內的PQQ都來源于細菌,但是動物和人類的腸道細菌不能合成PQQ或者合成量極少,無法滿足自身需要,因此,動物和人類都需要從食物中攝取PQQ。因其具有多種積極的生理作用,PQQ已被美國FDA和歐盟食品安全局批準為一種安全的膳食補充劑[15],具有良好的開發前景。

PQQ的生產方法主要有化學合成法和微生物發酵法,其中,化學合成法是早期使用的生產方法,因其反應步驟多,生產成本高,現在已被淘汰。目前PQQ的生產方法主要是微生物發酵法,能大量合成PQQ的微生物主要有甲基桿菌屬(Methylobacterium)、甲基單胞菌屬(Methylomonas)、食甲基菌(Methylovorus)、黃色桿菌屬(Xanthobacter)、生絲微菌屬(Hyphomicrobium)等。而發酵工業上應用較多的是以生絲微菌屬(Hyphomicrobium)作為生產菌種,以甲醇作為發酵碳源,以補料分批發酵法作為常用的發酵方法[16-17]。有學者通過發酵動力學的研究表明,生絲微菌發酵產PQQ屬于生長部分偶聯型發酵,較長的穩定期有利于提高PQQ的產量;生絲微菌分批培養過程的甲醇消耗動力學模型表明,甲醇大部分用于菌體生長,少部分用于PQQ合成,極少部分用于維持菌體的自身代謝需求,致使菌體生長穩定期很短,PQQ產量較低,分批補料培養過程中應該控制菌體的生長速率[18]。

因為生絲微菌發酵產PQQ屬于生長部分偶聯型發酵,PQQ的生物合成都會伴隨著菌體生長,菌體生長由少到多是一個連續不斷的過程,菌體濃度會不斷增加,因此PQQ補料分批發酵法穩定期較短,制約了PQQ發酵產量的進一步提高。根據生絲微菌生長部分偶聯型發酵產PQQ的特點,可以考慮用連續發酵的方法來提高其發酵產量,趙子剛等[19]開創性的使用了半連續發酵的方法生產PQQ,維持菌體濃度在合適的范圍,延長了穩定期,提高了PQQ發酵產量。本文將進一步研究采用單級連續發酵法生產PQQ的方法。

1 材料與方法

1.1 菌種

生絲微菌(Hyphomicrobiumsp.)DSM1869,北大醫藥重慶大新藥業股份有限公司保藏菌種。

1.2 培養基配方

基礎發酵培養基配方:(NH4)2SO43.0 g/L,NaH2PO4·12H2O 3.0 g/L,K2HPO41.4 g/L,MgSO4·7H2O 1.0 g/L,CaCl2·2H2O 21 mg/L,ZnSO4·7H2O 15.75 mg/L,FeSO4·7H2O 5.25 mg/L,MnSO4·4H2O 3.15 mg/L,CuSO4·5H2O 0.525 mg/L,NaCl 1.05 mg/L,(NH4)6Mo7O24·4H2O 21 μg/L,KI 21 μg/L,CoCl2·6H2O 21 μg/L,H3BO321 μg/L。

斜面培養基配方:在基礎發酵培養基配方中添加20 g/L的瓊脂,配制好后滅菌,冷卻到60 ℃左右,再加入20 mL/L的甲醇搖勻,擺成斜面冷卻待用。

種子培養基配方:將基礎發酵培養基滅菌后添加10 mL/L的甲醇即為種子培養基。

1.3 儀器與設備

GUJS-5型發酵罐、GUJS-50型發酵罐,鎮江東方生物工程設備技術有限責任公司;UV2400型紫外可見分光光度計,上海舜宇恒平科學儀器有限公司;SBA-40D型生物傳感分析儀,山東省科學院生物研究所;LC-2010CHT型高效液相色譜儀,島津公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 種子培養

將保藏的生絲微菌菌種接種于斜面培養基,在29～31 ℃的培養箱中培養144～192 d;從斜面接種到種子瓶,種子瓶在29～31 ℃、250 r/min的搖床上培養40～48 h;將種子瓶中的種子液按照1%的比例接種到5 L種子罐中,種子罐裝量為3 L,種子罐的培養條件:罐溫29～31 ℃,通氣量3 L/min,攪拌轉速200 r/min,培養周期40～48 h。

1.4.2 補料分批發酵培養

將種子罐中的種子液按照10%的比例接種到50 L發酵罐中,發酵罐初始裝量為30 L,補料分批發酵的培養條件:罐溫29～31 ℃,通氣量1 200～1 800 L/h,攪拌轉速100～600 r/min,通過調整通氣量和攪拌轉速控制發酵液中的溶氧值在30%以上,通過補氨水控制發酵液的pH值在6.8～7.0,發酵周期264 h。補料分批發酵的補甲醇工藝:發酵罐接種后就開始用蠕動泵連續補料甲醇,每隔8 h取樣用生物傳感分析儀測定發酵液中的甲醇含量,根據測得的甲醇含量調整蠕動泵的補料速度,將發酵液中的甲醇質量濃度控制在0.1～1.0 g/L。

1.4.3 單級連續發酵培養

在補料分批發酵進行到一定階段時,轉到單級連續發酵,用蠕動泵以一定的速率分別補入甲醇、氨水和基礎發酵培養基,同時用蠕動泵以一定的速率從罐底部的放料閥門連續放料,收集放料的發酵液送去提取工序。調整各補料和放料的速率,保持發酵罐體積不變,即實現單級連續發酵培養。

1.5 分析方法

1.5.1 發酵液中菌體濃度的檢測

因為PQQ的發酵培養基由甲醇、可溶性的無機鹽和微量維生素組成,無色透明,另外PQQ的發酵菌種生絲微菌為球狀細菌,所以檢測發酵液在一定波長下的光密度值即可代表發酵液中的菌體濃度。如有必要將發酵液樣品適當稀釋,以純水作為對照,用分光光度計測定其在波長600 nm下的光密度值(OD600)。

1.5.2 發酵液中PQQ質量濃度的檢測

發酵液中PQQ質量濃度的檢測采用高效液相色譜法,將發酵液樣品5 000 r/min離心10 min,取上清液用0.22 μm的微孔濾膜過濾,濾液進樣HPLC測定。色譜條件為,色譜柱:Waters XBridge C18 Column(4.6 mm×150 mm,5 μm);流動相:甲醇(A)-水(B,用三氟乙酸調節pH值至1.0);洗脫條件(表1);流速1.0 mL/min;柱溫25 ℃;檢測波長365.8 nm;進樣量10 μL[20]。

表1 洗脫條件Table 1 Elution conditions

2 結果與分析

2.1 PQQ補料分批發酵

PQQ補料分批發酵實驗中發酵液初始體積為30 L,發酵264 h結束發酵放罐,放罐發酵液的發酵單位為1 588 mg/L,放罐體積約35 L,共消耗碳源甲醇6 620 mL。每天的發酵單位、OD600值和補料的甲醇體積如表2所示。

2.2 PQQ補料分批發酵的過程分析

將表2中的發酵單位、OD600值繪制成發酵增長曲線,如圖1所示。整個補料分批發酵的周期較長,共264 h,發酵前期(0～120 h),菌體生長較慢,消耗了大量的時間用于將菌體增殖到較高的濃度;發酵中期(120～192 h),發酵液OD600值達到40左右時,發酵單位的增長速度是最快的;發酵后期(192～264 h),發酵液OD600值增加到50以上后,發酵單位增長逐漸停滯。

表2 PQQ補料分批發酵每天OD600值、發酵 單位和碳源甲醇補料量Table 2 Date of PQQ fed-batch fermentation

PQQ補料分批發酵PQQ產量和甲醇消耗量,如圖2所示。在發酵前期和后期,PQQ的生產效率低,而且甲醇單耗較高;在發酵中期144～192 h,PQQ的生產效率高,同時甲醇單耗最低。PQQ發酵生產的原料成本主要來自于甲醇,如果能將發酵周期中144～192 h的發酵液最佳生產狀態延長,不僅能夠提高PQQ生產效率,還將降低碳源甲醇的單位消耗,從而降低生產成本。

圖2 PQQ補料分批發酵PQQ產量和甲醇消耗量Fig.2 PQQ yield and methanol consumption of PQQ fed-batch fermentation

2.3 PQQ連續發酵

根據以上對PQQ補料分批發酵的分析考慮用連續發酵的方式來延長最佳生產狀態,綜合考慮,以補料分批發酵168 h時為連續發酵的起點(發酵液OD600值40.5,PQQ的質量濃度為1 022 mg/L),通過計算稀釋率用蠕動泵以一定的速率連續補入甲醇、氨水和基礎發酵培養基,同時用蠕動泵以一定的速率從發酵罐底部連續放出發酵液。

在連續發酵過程中,底物的補加速率會顯著影響菌體的生長和產物的生產,因此稀釋率是連續發酵的一個重要影響因素。在PQQ補料分批發酵中,發酵后期PQQ的產量下降,甲醇轉化率也下降,分析有兩個可能的原因,一個可能的原因是由于菌體不停增殖,菌體濃度過高導致菌體衰亡,造成PQQ的生產能力下降;另一個可能的原因是由于產物PQQ的質量濃度不斷增高引起了反饋抑制,造成PQQ的生產能力下降。針對這兩個可能的原因,就有兩種稀釋率方案,一種是恒濁法的稀釋率,即維持發酵液菌體濃度(OD600值)恒定,以延緩菌體衰老;另一種是產物恒化法的稀釋率,即維持發酵液中產物PQQ的質量濃度(發酵單位)恒定,以解除產物反饋抑制。

2.3.1 恒濁法連續發酵

PQQ的恒濁法連續發酵培養中,先沿用補料分批發酵工藝將發酵液培養到168 h,再轉為恒濁法連續發酵培養,即通過額外補料基礎發酵培養基對發酵液進行稀釋,使發酵液中菌體濃度保持恒定。補料總速率按照以下步驟計算:

首先按照表2中的數據計算補料分批發酵在144～192 h的菌體比生長速率,近似為168 h時的菌體比生長速率,如公式(1)所示:

(1)

式中:μ,比生長速率,h-1;x,發酵液的OD600值;t,發酵時間,h。

由于要使菌體濃度維持恒定,則單級恒濁法連續發酵中,菌體的比生長速率和稀釋率相等[21],如公式(2)所示:

(2)

式中:D,稀釋率,h-1;F,料液流速,L/h;V,培養體積,L。

補料分批發酵到168 h時,發酵液體積為34.2 L,因此可以計算恒濁法的補料總速率,如公式(3)所示:

F=D×V=0.008 7 h-1×34.2 L=0.297 L/h

(3)

恒濁法連續發酵實驗前期的工藝與補料分批發酵完全相同,到168 h時補碳源甲醇的速率為37.5 mL/h,補氨水的速率為3.5 mL/h,因此在恒濁法連續發酵開始時補甲醇和補氨水的速率不變,另外以256 mL/h的速率用蠕動泵連續補基礎發酵培養基到罐中,以297 mL/h的速率用蠕動泵從罐底連續放料,連續發酵312 h后,PQQ的日產量下降明顯,于是結束連續發酵放罐。發酵總過程持續了480 h,共消耗碳源甲醇15 960 mL,恒濁法連續發酵過程中OD600值和發酵單位增長情況如圖3所示。

圖3 PQQ恒濁法連續發酵中發酵液OD600值 和發酵單位增長曲線Fig.3 OD600 and PQQ concentration curve of PQQ turbidostat

PQQ恒濁法連續發酵PQQ產量和甲醇消耗量,如圖4所示。

圖4 PQQ恒濁法連續發酵PQQ產量和甲醇消耗量Fig.4 PQQ yield and methanol consumption of PQQ turbidostat

2.3.2 恒化法連續發酵

本文中的PQQ恒化法連續發酵培養,是將發酵液中的產物PQQ質量濃度保持恒定,先沿用補料分批發酵工藝將發酵液培養到168 h,再轉為恒化法連續發酵培養,即通過額外補料基礎發酵培養基對發酵液進行稀釋,使發酵液中PQQ質量濃度保持恒定。補料總速率按照以下步驟計算:

先按照表2中的數據計算補料分批發酵在144～192 h階段的比產物生成速率,近似為168 h時的比產物生成速率,如公式(4)所示:

(4)

式中:μρ,比產物生成速率,h-1;ρ,發酵液中產物PQQ的質量濃度,mg/L;t,發酵時間,h。

要維持發酵液中PQQ的質量濃度恒定,則單級恒化法連續發酵中的稀釋率應等于比產物生成速率,如公式(5)所示:

(5)

式中:D,稀釋率,h-1;F,料液流速,L/h;V,培養體積,L。

補料分批發酵到168 h時,發酵液體積為34.2 L,因此可以計算出恒化法的補料總速率,如公式(6)所示:

F=D×V=0.013 4 h-1×34.2 L=0.458 L/h

(6)

恒化法連續發酵實驗前期的工藝也與補料分批發酵完全相同,到168 h時補碳源甲醇的速率為37.5 mL/h,補氨水的速率為3.5 mL/h,因此在恒化法連續發酵開始時補甲醇和補氨水的速率不變,另外以417 mL/h的速率用蠕動泵連續補基礎發酵培養基到罐中,以458 mL/h的速率用蠕動泵從罐底連續放料,連續發酵312 h后,發酵液OD600值下降較多,PQQ的日產量逐漸降低,于是結束連續發酵放罐,發酵總過程持續了480 h共消耗碳源甲醇15 370 mL,恒化法連續發酵過程中OD600值和發酵單位增長情況如圖5所示。

圖5 PQQ恒化法連續發酵中發酵液OD600值和 發酵單位增長曲線Fig.5 OD600 and PQQ concentration curve of PQQ chemostat

PQQ恒化法連續發酵PQQ產量和甲醇消耗量,如圖6所示。

圖6 PQQ恒化法連續發酵PQQ產量和甲醇消耗量Fig.6 PQQ yield and methanol consumption of PQQ chemostat

2.3.3 三種發酵方法的對比

將PQQ的補料分批發酵和恒濁法、恒化法連續發酵的發酵總產量和甲醇總消耗量列于表3中。

根據表3中的數據,得出3種發酵方法的生產效率和甲醇平均轉化率,如圖7所示。

表3 三種發酵方法的發酵產量和甲醇消耗量Table 3 PQQ yield and methanol consumption of 3 types of fermentation

圖7 PQQ 3種發酵方法的生產效率和甲醇轉化率的對比Fig.7 PQQ productivity and methanol conversion ratio of 3 types of fermentation

2種PQQ連續發酵方法的生產效率和甲醇平均轉化率都遠高于PQQ補料分批發酵,其中又以恒濁法連續發酵更優。在恒濁法連續發酵過程中,發酵單位可以達到比分批發酵高的多,說明在補料分批發酵過程中,發酵后期阻礙發酵單位繼續增長的主要原因是菌體濃度累積的過高,造成菌體衰亡,而發酵產物PQQ的反饋抑制則是次要原因。在恒化法連續發酵過程中,由于稀釋率過大,發酵液OD600值一直在下降,即菌體濃度下降,影響了產PQQ效率。因此用恒濁法連續發酵生產PQQ,可以維持合適的菌體濃度,大大延長了穩定期,從而維持了較高的產PQQ效率,又有部分解除產物抑制的效果,是較優的PQQ發酵方法。

3 結論與討論

PQQ補料分批發酵過程中,菌體增殖的問題是貫穿始終的,發酵前期需要等待菌體緩慢增殖,該階段菌體濃度還比較低,所以產PQQ效率也很低;發酵中期,菌體增殖到了合適的濃度,產PQQ效率也達到了高峰;到了發酵后期,由于菌體持續增殖,過高的菌體濃度造成菌體衰亡過快,產PQQ效率又迅速下降;綜合來看,PQQ補料分批發酵中,穩定期較短,高效產PQQ期較短,造成整體生產效率較低。

本研究發現,以0.008 7 h-1的稀釋率進行PQQ恒濁法單級連續發酵,能夠較長時間維持發酵液合適的菌體濃度,延長了穩定期,從而較長時間維持PQQ的高效生產期,大幅提升了整體生產效率。與補料分批發酵相比,該恒濁法連續發酵可以提高PQQ的生產效率(80.7%),同時還提高了底物甲醇的轉化率(36.5%),具有良好的工業應用前景。