乳酸菌發酵西蘭花的代謝組學分析及其對蘿卜硫素含量的影響

侯菲翔,蔡燕雪,肖珊,王波,陳璇,王際輝*

1(大連工業大學 生物工程學院,遼寧 大連,116034)2(東莞理工學院 生命健康技術學院,廣東 東莞,523808)

西蘭花(Brassicaoleraceavar.italica)屬于十字花科植物中的蕓薹屬甘藍種,也稱綠花菜、青花菜等[1],因營養價值很高,被譽為“蔬菜之王”。原產于歐洲地中海意大利一帶,19世紀末傳入中國,現已成為我國消費者喜愛的蔬菜之一。西蘭花中還富含多種生物活性成分(如多酚類化合物、類黃酮、異硫氰酸鹽等),因此具有較強的抗氧化活力[2]。

由于代謝組學可發現樣品間的細微差別,故可對乳酸菌發酵食品的成分進行定性或定量分析。目前,關于非靶向代謝組學應用于硒酸鹽處理西蘭花芽[3]、環境光亮對西蘭花代謝組學的影響[4]、西蘭花小花創傷應激的分子機制[5]均有報道,但關于非靶向代謝組學研究乳酸菌發酵西蘭花前后組分變化情況仍不明晰。

蘿卜硫素(sulforaphane)是一種異硫氰酸鹽,是最有前景的具有抗癌活性的天然植物活性物質之一[6],蘿卜硫素可以激活醌還原酶或谷胱甘肽硫轉移酶等II型解毒酶,達到失活部分致癌基因的效果,最終發揮抗癌作用[7],同時蘿卜硫素也具備較強的抗氧化、抗肥胖、抗糖尿病等活性[8]。

在完整的西蘭花組織中,硫代葡萄糖苷與黑芥子酶被嚴格分開,只有組織細胞被破壞時才會相互接觸,因此蘿卜硫素等異硫氰酸鹽的生成對于植物來說是一種主動的防御機制,所產生的植物次級代謝產物對破壞其細胞正常結構的動物或病菌等都能夠產生一定的生理毒性[9]。阻礙蘿卜硫素生成的主要原因有:(1)傳統烹飪及冷凍對西蘭花內黑芥子酶的熱失活;(2)表皮特異硫蛋白(epithiospecifier protein,ESP)的存在使得生西蘭花中硫代葡萄糖苷降解后更加傾向于轉向生物活性很低的蘿卜硫素腈;(3)蘿卜硫素本身不穩定且受熱易降解[10]。

針對這些問題,前人主要提出兩種思路:一種是在西蘭花育苗時提高前體物硫代葡萄糖苷的含量,進而增加蘿卜硫素的轉化量,如使用富硒肥、鹽離子、光照等外源性脅迫方式[11];另一種是在加工過程中改變酶活或添加保護劑等以減少蘿卜硫素的降解,提高其穩定性[12]。雖然它們都在一定程度上被動地保留了蘿卜硫素的含量,但仍然存在無法主動促進西蘭花生成更多蘿卜硫素的局限性。

本研究從西蘭花中篩選內源乳酸菌對西蘭花泥進行發酵,并對發酵前后西蘭花的基本營養指標進行測定,通過非靶向代謝組學技術,研究了代謝產物的種類和豐度并篩選出顯著性差異代謝物,最后分析了乳酸菌發酵對蘿卜硫素含量的影響。本課題的開展為明確乳酸菌發酵西蘭花過程中的組分變化情況及其在新型功能性食品領域的應用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

西蘭花選購于東莞市農貿市場,經鑒定品種為Brassicaoleraceavar.italica。MRS(de Man, Rogosa, and Sharpe)肉湯培養基、MRS瓊脂培養基,廣東環凱微生物科技有限公司;細菌基因組DNA提取試劑盒,北京索萊寶科技有限公司;BCA蛋白濃度檢測試劑盒,上海碧云天生物技術有限公司;3,5-二硝基水楊酸,上海源葉生物科技有限公司;蘿卜硫素標準品(≥90%,HPLC)、甲醇、乙酸胺、甲酸、甲醇、乙腈,美國Sigma公司;其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

ZQZY-78BV培養箱,上海知楚儀器有限公司;Spark酶標儀,瑞士TECAN有限公司;PB9590破壁機,中國奧克斯集團有限公司;AB Triple TOF 6600質譜儀,美國AB SCIEX公司;ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱,美國Waters公司;CV200冷凍濃縮機,北京艾吉姆科技有限公司;Agilent 1250 Infinity II高效液相色譜,美國Agilent公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 西蘭花內源乳酸菌的篩選

乳酸菌的篩選參考文獻[13],取西蘭花的花頂2 cm部分切出并收集100 g,加入到250 mL滅菌MRS肉湯培養基中,于37 ℃下孵育24 h。完成后取適量按10倍稀釋法稀釋至10-5CFU/g,取200 μL稀釋液轉移至滅菌MRS瓊脂培養基中并于37 ℃下孵育24 h。取平板上10個單菌落在另一滅菌MRS瓊脂培養基上劃線培養,分別對其命名為BrocLAB1-BrocLAB10,重復2次后得到純種菌并凍藏。

1.3.2 菌種鑒定

將菌液進行細胞破碎,隨后提取菌種基因組DNA并送至廣東美格基因科技有限公司進行菌種鑒定。PCR擴增目的片段后使用引物8F和16SR對片段進行Sanger測序并拼接。拼接好后的序列與NCBI的NT庫進行BLAST比對。

1.3.3 西蘭花發酵

取西蘭花的花頂2 cm部分,按每300 g西蘭花加入200 mL滅菌水的比例加入破壁機破壁75 s,取出西蘭花泥并混勻。取250 g西蘭花泥于250 mL藍蓋試劑瓶中,加入選定菌種菌液使其濃度為108CFU/g,分別發酵0、12、24、36、48、60 h后立即停止,隨機分裝至透明真空袋后分別于4、-20和-80 ℃下貯存。

1.3.4 總蛋白含量

總蛋白含量使用BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型)完成。停止發酵后取2 mg發酵西蘭花凍干粉溶解于1 mL體積分數為80%甲醇得到2 mg/mL 懸濁液,700 r/min下振蕩20 min后取20 μL上清液與200 μL BCA工作液于37 ℃下反應20 min。隨后在酶標儀內562 nm波長處觀察吸光值。以牛血清蛋白(bovine serum albumin, BSA)為標準品繪制標準曲線y=0.913 8x+0.092 4,R2=0.998 4,結果表示為BSA當量(mg BSA/g DW)。

1.3.5 總還原糖含量

總還原糖的測定方法為3,5-二硝基水楊酸法并在前人的研究方法[14]基礎上加以修改。停止發酵后取5 mg發酵西蘭花凍干粉溶解于1 mL 80%甲醇得到5 mg/mL懸濁液,700 r/min振蕩20 min后取200 μL上清液與200 μL DNS試劑混合并沸水浴加熱5 min,隨后將其稀釋至原來的1/10并在酶標儀內觀察波長540 nm處吸光值。以葡萄糖為標準品繪制標準曲線y=0.360 7x+0.051 2,R2=0.998 9,結果表示為葡萄糖當量(mg Glucose/g DW)。

1.3.6 非靶向代謝組學

未發酵和發酵48 h的西蘭花樣品送至上海中科新生命生物科技有限公司進行非靶向植物代謝組學分析。具體檢測步驟參考文獻[15]如下:發酵西蘭花樣品在4 ℃條件下解凍,隨后選取不同處理組發酵西蘭花樣品至預冷的溶劑中[V(甲醇)∶V(乙腈)∶V(水)=2∶2∶1],渦旋混勻后在4 ℃下超聲波30 min,隨后在-20 ℃下靜置20 min后離心(10 000 r/min、4 ℃、20 min),上清液干燥后備用。分析時使用100 μL溶液[V(乙腈)∶V(水)=1∶1]渦旋復溶并離心(10 000 r/min、4 ℃、15 min),上清液進樣。

色譜分析使用C18色譜柱分離,柱溫40 ℃,流速0.4 mL/min,進樣量2 μL,流動相A:25 mmol/L乙酸胺+體積分數為0.5%甲酸的水溶液,流動相B:甲醇。梯度洗脫程序如下:0～0.5 min,5% B;0.5～10.0 min,5%～100% B;10.0～12.0 min 100% B;12.0～ 12.1 min,100%～5% B;12.1～16.0 min 5% B。隨機順序自動連續進樣,環境溫度4 ℃。

西蘭花樣品一級和二級質譜的采集和分析通過質譜儀參考文獻[15]進行。ESI源分離條件如下:Ion Source Gas1 60,Ion Source Gas2 60,Curtain gas(CUR)30,樣本溫度600 ℃,IonSapary Voltage Floating(ISVF)±5 500 V(正負兩種模式),TOF MSm/z掃描范圍60～1 000 Da,產物離子m/z掃描范圍25～1 000 Da,TOF MS掃描累積時間0.20 s/spectra,產物離子掃描累積時間0.05 s/spectra。二級質譜采用數據依賴型采集(information dependent acquisition,IDA)獲得,并且采用高靈敏度模式,去族電壓為±60 V(正負兩種模式),裂解電壓為(35±15) eV。IDA設置如下:Exclude isotopes within 4 Da,Candidate ions to monitor per cycle為10。

通過使用ProteoWizard和MSDAIL軟件,將原始數據由RAW格式轉換為mz XML格式、對齊峰位置、校正保留時間并提取峰面積,隨后依次進行結構鑒定、數據預處理、數據質量評價和分析。

1.3.7 蘿卜硫素含量

參考文獻[13]的方法。取5 g發酵西蘭花,與5 mL去離子水振蕩混合并超聲波處理5 min,加入20 mL乙酸乙酯,于4 ℃、8 000 r/min下離心10 min,收集上清液后向沉淀再加入15 mL乙酸乙酯再離心,收集上清液于室溫下冷凍濃縮。完成后加入250 μL體積分數為30%的乙腈,過0.22 μm有機尼龍微孔濾膜并加入到帶襯管的2 mL棕色色譜進樣瓶中待測。

色譜分析采用C18色譜柱分離,柱溫30 ℃,流速0.3 mL/min,進樣量5 μL,流動相A:0.1%甲酸溶液,流動相B:0.1%甲酸乙腈溶液,等度洗脫程序為0.0～10.0 min,20% B。

1.3.8 數據處理

所有實驗數據為重復實驗平均值,至少3次重復,單因素方差分析使用SPSS 27.0軟件,均值比較測試方法為LSD并通過Waller-Duncan進行顯著性分析,不同字母表示差異顯著(P<0.05),所有數據由OriginPro 2023進行作圖,實驗結果通過平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 菌種篩選與西蘭花發酵產品特性

前期通過對西蘭花內生菌篩選,共選出10株西蘭花內源乳酸菌進行16S rDNA片段擴增測序,并在NCBI上進行BLAST比對。物種注釋鑒定結果:BrocLAB1、BrocLAB3～9為植物乳桿菌(Lactiplantibacillusplantarum),BrocLAB2～4、BrocLAB10則為戊糖乳桿菌(Lactiplantibacilluspentosus)。進一步根據生長曲線、產酸與耐酸曲線,最終在兩種物種各挑1株優良菌種,BrocLAB1和BrocLAB10來進行后續發酵實驗(表1)。

表1 篩選的西蘭花內源乳酸菌的物種注釋結果Table 1 Species annotation of selected endogenous lactic acid bacteria in broccoli

2.2 總蛋白與總還原糖含量

西蘭花發酵過程中的總蛋白含量變化如圖1所示,未發酵的西蘭花樣品總蛋白含量為(96.1±13.6) mg BSA/g DW。隨著發酵時間的增加,西蘭花總蛋白含量略有下降,但整體呈波動狀態,特別在發酵60 h后為(82.6±8.7) mg BSA/g DW,發酵前后總蛋白含量整體變化不明顯(P>0.05)。

圖1 發酵后西蘭花總蛋白含量的變化Fig.1 Changes in total protein content of broccoli after fermentation

進一步研究發酵前后西蘭花總還原糖含量變化,如圖2所示。發酵前西蘭花的總還原糖含量為(180.0±16.2) mg Glucose/g DW,與文獻報道結果一致[16]。發酵后,西蘭花樣品的總還原糖含量顯著下降,這可能是因為還原糖被用于乳酸菌的生長和乳酸的生成[17]?？梢杂^察到發酵24 h后總還原糖含量急劇下降至(57.6±4.8) mg Glucose/g DW,而在48 h后又緩慢降至(51.6±5.9) mg Glucose/g DW,這說明乳酸菌只在最開始的24 h內迅速消耗糖類物質。

2.3 代謝組學鑒定與差異分析

非靶向代謝組學能對樣本中各類代謝物進行分析,測定各代謝物的含量、表征代謝物分子的表現型并對比不同樣品組間的概況[3],能有效體現出生物體內的代謝水平。通過匹配數據庫中代謝物的基本信息,包括分子質量、保留時間以及二級碎裂譜圖,對西蘭花樣品代謝物結構進行鑒定,等級均在Level 2以內。發酵西蘭花樣品中共鑒定出977種代謝物,其中正離子模式鑒定到的代謝物589種,負離子模式388種。合并正離子模式和負離子模式下的所有代謝產物,并統計其分類后發現占比最高的前3個分別是脂質和脂類化合物、有機酸及其衍生物、有機雜環化合物(表2)。同樣有研究發現,通過戊糖片球菌發酵西蘭花汁后有49.47%的非揮發性代謝物被分類為脂質和脂類化合物分子[18]。

表2 正、負離子模式下鑒定到的發酵西蘭花 樣品中的代謝物分類Table 2 Metabolite classification identified in fermented broccoli samples in positive and negative ion modes.

單變量統計分析結合多維統計分析是代謝組最常使用的一種組間顯著性差異代謝物的篩選方法。對西蘭花樣品中基于單變量統計分析方法檢測到的所有代謝產物進行差異性分析,差異改變倍數(Fold Change,FC)取log2,采用火山圖的形式按照FC>1.5或FC<0.67,P<0.05的標準篩選差異代謝物,結果顯示,與Raw相比,發酵48 h后的西蘭花內共鑒定出327個下調代謝物和162個上調代謝物,結果如圖3-a所示。進一步對發酵西蘭花組間進行正交偏最小二乘分析。每個分析模型均通過了置換檢驗且Q2>5,選取變量權重值大于1、P<0.05的差異代謝物為顯著性差異代謝物,如圖3-b所示。從結果可以發現,在所有的上調代謝物中,具有顯著性差異代謝物有山梨醇、L-3-苯基乳酸、3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)丙酸、丙氨酰苯丙氨酸、新綠原酸、山柰酚、L-乳酸、色氨酸、琥珀酸等;多次出現的下調顯著性差異代謝物有L-蘋果酸、泛糖苷、鳥苷、葡萄糖酸、尿苷、古龍酸、D-葡萄糖等。山梨醇被發現能提高蔬菜的貨架期[19]并發現發酵后顯著上調。L-乳酸則是乳酸菌的主要產物,有報道指出乳酸菌能消耗大量蘋果酸并生成乳酸[20],結果發現發酵后L-乳酸上調,而L-蘋果酸為下調。山萘酚具有抗氧化和抗炎的效果[21],并發現發酵后為上調的顯著性差異代謝物。有報道指出古龍酸是西蘭花中的一種酚酸類化合物[22],并發現它在發酵后下調,這與文獻報道的結果相符[23]。

對顯著性差異代謝物進行層次聚類分析并繪制熱圖,其結果如圖3-c所示,圖中不同色塊顏色表示對應代謝物的相對表達量,聚在不同簇內的代謝物具有不同的表達模式,這可能由于西蘭花在發酵前后,乳酸菌的發酵作用導致部分功能差異化,進而激發了不同的代謝過程或細胞通路,最終引起代謝產物的差異。

為了進一步直觀地體現出各代謝產物的轉換關系,圖3-d展示了相關性系數|r|>0.8且P<0.05的代謝物分子對。圖中外圈上不同顏色的短弧線分別表示代謝產物所屬化學分類,內圈起點代表各顯著性差異代謝物的種類和數量,相連接的線條表示各個代謝物之間的轉換關系相關性。從結果可以發現,相較于未發酵的西蘭花樣品,經過乳酸菌發酵后的部分代謝產物產生了顯著的轉化情況,這充分說明發酵過程對于西蘭花的代謝途徑具有明顯的改變作用,這種改變可以促進具有功能性的小分子產生更高的表達,賦予發酵食品更多的功能特性。

a-代謝產物火山圖;b-顯著性差異種類;c-聚類分析;d-代謝產物轉換情況

2.4 蘿卜硫素含量

根據蘿卜硫素檢測標準曲線(y=8.862 5x+8 865.8,R2=0.988 0),分別測定未發酵西蘭花的蘿卜硫素含量為(869.1±56.1) μg/mL,這個結果略高于文獻報道的(724.61±8.24) μg/mL[24],這可能是品種的差異造成的。西蘭花樣品發酵48 h后含量為(1 768.9±12.9) μg/mL,含量顯著提高到未發酵樣品的203.53%(P<0.01)。蘿卜硫素是硫代葡萄糖苷的分解產物,推測蘿卜硫素含量的增加可能是由于西蘭花在乳酸菌發酵過程中蘿卜硫素轉化率的提高所致。硫代葡萄糖苷根據反應條件和其結構,經歷復雜的酶促和非酶促反應轉化為各種產物。在黑芥子酶作用下,硫代葡萄糖苷解離生成葡萄糖和不穩定的糖苷配基,隨后發生Lossen重排反應分別生成異硫氰酸酯、腈類和其他降解產物[25]。乳酸菌發酵過程中,環境pH值由于乳酸的產生導致下降,這可能是有利于蘿卜硫素產量提高的一個原因[25]。此外,也可能由于內源微生物細胞壁降解酶的作用,在非發酵組織中不能正常反應的硫代葡萄糖苷得以釋放最終轉化為蘿卜硫素[13]。

3 結論

本研究利用內源乳酸菌對西蘭花泥進行發酵,對比了發酵前后基本營養指標,結果發現蛋白質含量基本不變,總還原糖含量顯著下降;使用非靶向代謝組學技術,共鑒定出977種代謝物,其中代謝物化學分類占比最高的為脂質和脂類化合物,明確了發酵對西蘭花代謝產物豐度的影響;最后測定西蘭花中蘿卜硫素在乳酸菌發酵后顯著提高至未發酵樣品的2倍。本研究的開展為拓展西蘭花發酵產品在功能性食品中的開發應用提供參考。