Sitravatinib聯合Niraparib對黏膜黑色素瘤細胞系增殖、凋亡和自噬的影響及其機制

胡子衿，孔 燕，吳曉雯，郭 倩，郭 軍

北京大學腫瘤醫院暨北京市腫瘤防治研究所 黑色素瘤與肉瘤內科惡性腫瘤發病機制及轉化研究教育部重點實驗室，北京 100142

黑色素瘤(melanoma)起源于黑色素細胞,是一種惡性程度極高的腫瘤,黏膜黑色素瘤(mucosal melanoma,MM)是其中一種起源于黏膜上皮的亞型,在亞洲人群中占比高達39.6%,具有獨特的遺傳學特性,對免疫治療應答率低,預后差[1],尋找新的治療手段成為提高患者生存質量和延長生存時間的關鍵。

Sitravatinib是一種新型小分子抗血管生成藥物,在多種實體瘤中顯示出了良好的療效[2]。Niraparib是一種多聚(腺苷二磷酸[ADP]-核糖)聚合酶抑制劑[poly(adenosine diphosphate[ADP]-ribose) polyme-rase inhibitor,PARPi],主要通過抑制PARP的催化活性,導致同源重組修復(homology-dependent recombination repair,HRR)缺陷的腫瘤無法修復DNA雙鏈損傷,達到合成致死作用,臨床上廣泛用于治療BRCA1/2突變的腫瘤亞型[3]。

臨床前研究證實,抗血管生成藥物主要通過誘導腫瘤微環境低氧和抑制血管內皮生長因子受體3(vascular endothelial growth factor receptor 3, VEGFR3)兩種方式來下調HRR水平[4-5],為其與PARP抑制劑聯合使用提供了理論支持。在卵巢癌中,已經證實了抗血管生成藥物聯合PARP抑制劑相較于單藥可以提高無BRCA1/2突變患者的生存率[6]。而在黑色素瘤中兩者聯合使用的研究鮮有報道,本研究擬探討Sitravatinib聯合Niraparib在黏膜黑色素瘤細胞系中的藥效及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑

人陰道黏膜來源黑色素瘤細胞系(human vaginal maligant melanoma cell line)HMVⅡ、二甲亞砜(Sigma-Aldrich公司);人外陰黏膜黑色素瘤腹股溝淋巴結轉移病灶來源細胞系GAK(JCRB公司);F10、F12培養基、胎牛血清、雙抗、胰蛋白酶(Gibco公司);PBS(北京索萊寶科技有限公司);Sitravatinib、Niraparib(Selleck公司);RNA提取試劑盒(艾瑞科生物公司);反轉錄試劑盒、Western blot loading buffer(TaKaRa公司);RT-qPCR試劑(Toyobo公司);Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒、CCK-8細胞增殖與毒性檢測試劑盒(Dojindo公司);引物由北京天一輝遠生物科技有限公司設計合成;兔抗cleaved caspase-3多克隆抗體、兔抗cleaved PARP多克隆抗體、兔抗LC3A/B單克隆抗體、兔抗Beclin-1單克隆抗體(CST公司);兔抗輻射敏感蛋白51(radiation sensitive protein 51, RAD51)單克隆抗體和兔抗γ-H2AX單克隆抗體(Abcam公司);PVDF膜與化學發光試劑(Millipore公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與CCK8法測定細胞活力:將HMVⅡ和GAK從液氮中復蘇,培養于F10、F12培養基中(含10%胎牛血清和1%雙抗),置于37 ℃、5% CO2孵箱中培養至增殖期,待細胞貼壁至匯合度70%～80%,使用胰蛋白酶消化后常規傳代。將HMVⅡ和GAK接種于96孔板內(6×103～8×103個/孔),設置一定的Sitravatinib與Niraparib藥物濃度梯度,24 h后更換相應藥物濃度的新鮮培養基,培養48 h后測定各孔在450 nm波長處的吸光度值(A),以A值代表細胞活力,繪制曲線計算半數抑制濃度(half maximal inhibitory concentration, IC50)。根據IC50設計兩種藥物不同的濃度組合,在96孔板中培養48 h后測定A值,使用Compu Syn模型評價Sitravatinib和Niraparib對兩種細胞系的聯合指數(conbination index,CI),CI<1時兩藥有協同效應,CI=1時兩藥有加性效應,CI>1時兩藥有拮抗效應[7]。

1.2.2 實驗的分組處理:將對數期的HMVⅡ和GAK接種于6孔板(3×105個/孔),培養24 h后將細胞隨機分為4組:control組,Sitravatinib組(2 μmol/L),Niraparib組(20 μmol/L)和聯合用藥組(Sitravatinib和Niraparib濃度分別為2 μmol/L和20 μmol/L),培養48 h。

1.2.3 細胞集落形成實驗檢測黑色素瘤細胞的增殖能力:藥物處理后收集各組細胞,充分混懸細胞,使用臺盼藍染色法計數細胞。將細胞接種于12孔內(1～2×103個/孔),置于37 ℃、5% CO2孵箱中培養。當培養皿中出現肉眼可見的集落形成時,終止培養。棄去上清液,PBS清洗3次,加入1～2 mL 4%多聚甲醛4 ℃固定細胞15 min。棄去固定液,PBS清洗3次,每孔加入1 mL結晶紫水溶液20 min,棄去染液,PBS清洗數次。晾干后將培養皿倒置拍照。

1.2.4 流式細胞測量術檢測藥物對黑色素瘤細胞凋亡水平的影響:藥物處理48 h后,收集各組細胞,使用臺盼藍染色法計數細胞。加入500 μL PBS輕輕吹打混勻細胞,4 ℃ 1 000 r/min離心3 min,去除上清液,每組加入1×anniexin V binding buffer,制成1×106/mL的細胞懸液(不少于500 μL),取100 μL加入1.5 mL 離心管中,加入5 μL anniexin V-FITC和5 μL PI solution,室溫避光孵育15 min,加入400 μL 1×anniexin V binding buffer,在1 h內檢測細胞凋亡水平。

1.2.5 Western blot檢測目的基因的蛋白質表達水平:藥物處理48 h后提取各組總蛋白質,使用BCA法測定各組蛋白質濃度,Western blot具體方法詳見文獻[8]。使用ImageJ軟件分析蛋白質條帶吸光度值,蛋白質的相對表達水平用目的蛋白質和內參蛋白GAPDH條帶的吸光度值比值表示,使用Graphpad Prism9軟件進行可視化。

1.2.6 RT-qPCR檢測目的基因的mRNA表達水平:藥物處理48 h后提取細胞內RNA,按照反轉錄試劑盒內說明書完成反轉錄實驗后進行RT-qPCR實驗。RT-qPCR步驟請見文獻[8] 。以GAPDH為內參基因,目的基因的mRNA的相對表達量根據Ct值計算2-ΔΔCt,使用Graphpad Prism9軟件進行數據可視化。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 Primer sequences used for RT-qPCR

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 Sitravatinib與Niraparib具有協同抑制作用

兩種藥物在HMVⅡ、GAK中單藥IC50值(圖1A)。依據單藥IC50設計兩藥聯合濃度梯度,根據A值計算CI值(圖1B),兩種藥物在特定濃度下可對細胞增殖發揮協同抑制作用。進一步,選擇Sitravatinib(2 μmol/L)和Niraparib(20 μmol/L)進行后續實驗。

A.IC50 of Sitravatinib and Niraparib in mucosal melanoma cell lines; B.combination index (CI) in HMVII and GAK cells at different drug concentrations (μmol/L).

2.2 Sitravatinib與Niraparib聯合治療抑制黏膜黑色素瘤細胞增殖

藥物處理48 h后,聯合組較單藥組顯著抑制HMVⅡ和GAK細胞集落形成(P<0.05或P<0.01或P<0.001)(圖2A, B)。

Sitravatinib.2 μmol/L; Niraparib.20 μmol/L;A.combination therapy inhibited colony formation ability in cells; B.data analysis of colony formation assay in cells; *P<0.05,**P<0.01 compared with control.

2.3 Sitravatinib與Niraparib聯合治療促進黏膜黑色素瘤細胞凋亡

與單藥組相比, 聯合組處理48 h后顯著提高了細胞凋亡比例(P<0.01或P<0.001)(圖3A);聯合組細胞凋亡標志物cleaved caspase-3與cleaved PARP的蛋白表達水平顯著升高(圖3B),caspase-3 mRNA表達水平明顯升高(圖3C)(P<0.001)。

Sitravatinib.2 μmol/L; Niraparib.20 μmol/L; A.effect of combination therapy on apoptosis of HMVⅡ and GAK cells was detected by flow cytometry; B, C.expression of apoptosis-related biomarkers were detected by Western blot and RT-qPCR; *P<0.05 compared with control.

2.4 Sitravatinib與Niraparib聯合治療促進黏膜黑色素瘤細胞自噬

聯合組自噬標志物LC3II/LC3I比值、Beclin-1蛋白表達量顯著升高。LC3、Beclin-1 mRNA表達量顯著升高(P<0.01,P<0.001)(圖4B)。

2.5 Sitravatinib與Niraparib聯合治療可誘導HRR缺陷

與對照組和Niraparib單藥組相比,Sitravatinib單藥組或聯合組中,RAD51的蛋白表達量均明顯降低。聯合組的γ-H2AX蛋白表達量較單藥組與對照組明顯上升(圖5A)。

隨著Sitravatinib的劑量升高至2 μmol/L,RAD51的蛋白和mRNA表達量明顯下降(P<0.05或P<0.01), BRCA1和BRCA2 mRNA表達明顯下降(P<0.05或P<0.01或P<0.001)(圖5B, C), NHEJ1、XRCC5 mRNA表達差異無統計學意義 (圖5D)。

3 討論

黏膜黑色素瘤好發于亞裔人群,腫瘤突變負荷低, 可選擇的靶向藥物少, 對免疫治療反應差, 患者生存期短,預后不良[9]。最近有研究證實基于抗血管藥物的治療方案對黏膜黑色素瘤有效[10]。

既往研究證實,在卵巢癌中,抗血管抑制劑與PARP抑制劑聯合使用可促進細胞凋亡[11]。本研究發現,在選定的聯合濃度下, HMVⅡ和GAK細胞中聯合組細胞凋亡水平顯著增高。自噬與細胞凋亡存在復雜的相互作用,如BCL-2可抑制Beclin-1依賴的細胞自噬[12]。自噬發生時,LC3Ⅰ被類泛素化修飾后與磷脂酰乙醇胺耦聯形成LC3Ⅱ,LC3Ⅱ在自噬體形成過程中起重要作用,隨后自噬體與溶酶體融合,被吞噬的分子或細胞組分被蛋白酶水解[13]。本研究發現,聯合治療可顯著增強HMVⅡ與GAK的細胞自噬程度。

“合成致死”是一種靶向治療的新方向,即兩種基因干擾的組合可以導致腫瘤細胞死亡。在一些基因突變率較低的腫瘤,使用藥物誘導“合成致死”效應成為當前研究的熱點[3]。許多研究證實了抗血管生成藥物通過各種機制影響腫瘤細胞的HRR,其中比較明確的是通過抑制血管生成誘導腫瘤微環境低氧,從而導致RAD51、BRCA1/2等HRR因子的下調[4]。在最近的卵巢癌研究中,證實了抗血管生成藥物可不依賴誘導低氧直接削弱HRR水平,并在這一基礎上聯合PARP抑制劑顯著抑制了腫瘤的生長[11]。本研究證實,抗血管生成劑Sitravatinib在濃度為2 μmol/L時可降低HMVⅡ和GAK細胞的HRR因子表達水平,與此同時,并不抑制非同源末端連接(non-homologous end-joining, NHEJ)因子表達水平,提示 Sitravatinib可能通過誘導HRR下降,聯合Niraparib導致“合成致死”效應,損傷DNA修復能力,進而抑制細胞增殖能力并促進細胞凋亡和細胞自噬。

綜上所述,Sitravatinib聯合Niraparib可顯著抑制黏膜黑色素瘤細胞系HMVⅡ和GAK的細胞增殖,促進細胞凋亡和細胞自噬,且可能與Sitravatinib損傷HRR有關,為兩者聯合應用于黑色素瘤的治療提供了參考依據。