巨噬細胞向肌成纖維細胞轉化促進LPS誘導的急性肺損傷模型小鼠肺纖維化

趙 東，查世乾，王易軒，潘 舟，于文蓁，胡 克

武漢大學人民醫院 呼吸與危重癥醫學科二科，湖北 武漢 430060

下呼吸道感染是全球主要疾病負擔,當以成纖維細胞增殖和細胞外基質過度沉積為主要表現的急性肺損傷(acute lung injury,ALI)后肺纖維化的出現,預示著死亡風險升高[1-2]。尤其是當下新型冠狀病毒感染背景下,國內外專家呼吁應加強該伴發疾病的救治措施[3-5],但鑒于其引起肺纖維化的臨床治療和轉歸相關資料極為有限,因此仍需要更多的臨床觀察和基礎研究。

目前發現巨噬細胞向肌成纖維細胞轉化(macrophage-to-myofibroblast transition,MMT)過程,在心肌、腎組織等臟器纖維化病變中表現出促進作用[6-9]。然而該轉化機制在肺纖維化中發揮的作用尚不明確。本研究將借助脂多糖(lipopolysac-charide,LPS)誘導早期肺纖維化小鼠模型模擬肺部感染致ALI后肺纖維化的病理過程,探討MMT在LPS誘導小鼠肺纖維化過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物:SPF級8～10周、體質量為20～25 g之間的C57BL/6J雄性小鼠[湖北省疾病預防控制中心,SYXK(鄂)2015-0027]。

1.1.2 主要試劑:脂多糖(LPS)(Sigma-Aldrich公司);達爾伯克氏改良伊格爾培養基(Dulbecco′s modified eagle medium,DMEM)、胎牛血清(Gibco公司);Masson染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司);α-SMA抗體、fibronectin(FN)抗體、collagen Ⅰ(Col1) 抗體、β-actin鼠源單克隆抗體、Smad3、p-Smad3抗體(Abcam公司);免疫組化二抗試劑盒(賽默飛世爾科技有限公司);RT-qPCR反轉錄試劑盒(TaKaRa公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠的分組與處理:共21只實驗小鼠,隨機分為7組,分別為對照(Ctrl)組、LPS誘導肺損傷早期纖維化(lipopolysaccharide-induced pulmonary fibrosis, LPS-PF)模型第3、7、10天組(day 3、day 7、day 10)和氯磷酸二鈉脂質體(clodronate-liposomes,CL-LIP)干預模型第3、7、10天組(day 3、day 7、day 10),每組3只。

建立LPS-PF小鼠模型:參照文獻[10]造模方法,經氣管插管注入劑量為1.5 mg/kg的LPS 0.05 mL;然后在操作后48 h腹腔注入劑量為3.0 mg/kg的LPS 0.1 mL;最后在首次操作第5天氣管內注入劑量為3.0 mg/kg的LPS 0.05 mL。對照(Ctrl)組小鼠干預時間點注射同體積0.9%氯化鈉溶液。造模完成后1周進行組織取材。

CL-LIP干預組處理:小鼠在建立LPS-PF模型前第5天、24 h分別予以0.2 mL(5 mg/mL)CL-LIP靜脈注入達到耗竭巨噬細胞的目的;之后隔3 d靜注1次,直至造模完成。

1.2.2 小鼠骨髓來源巨噬細胞(bone marrow-derived macrophage cells,BMDMs)的分離培養及體外誘導:小鼠麻醉后處死,在無菌環境下取出雙側股骨、脛骨,收集骨髓腔內容物經重懸、離心等步驟后,在含10 ng/mL巨噬細胞集落刺激因子培養液中培養。每隔3 d換1次培養液,培養貼壁細胞即為巨噬細胞,此時的細胞可用于接下來的實驗。體外細胞實驗分為對照(Ctrl)組和體外誘導BMDMs向肌成纖維細胞轉化組(TGF-β1刺激組)。

體外誘導BMDMs向肌成纖維細胞轉化(MMT過程):在BMDMs細胞培養液中加入10 ng/mL的TGF-β1刺激誘導,5 d后使用免疫熒光共標檢測,共標記有CD68和α-SMA的為MMT表型細胞[6-9, 11]。

1.2.3 肺組織纖維化評分:3位研究者采用盲法對Masson染色后的肺組織標本進行Ashcroft評分并取均值進行分析。評分分為0～8分,0分指正常肺組織,8分指肺組織形態結構完全被纖維組織取代。

1.2.4 其他指標檢測:免疫熒光標記法檢測組織、細胞樣本中CD68、α-SMA標記物的表達量;Western blot檢測肺組織和細胞樣本中Smad3蛋白、p-Smad3、α-SMA蛋白的表達量;RT-qPCR檢測α-SMA、FN(fibronetin)、Col1(collagen-1)的表達,α-SMA引物:上游CATGGCATCATCACCAACTG,下游GCTGGGACATTGAAAGTCTC;FN引物:上游GGACACTATGCGGGTCACTT,下游TCAAAACCAG TTGGGGAGTC;Col1引物:上游GCACCGTCAAGG CTGAGAAC,下游TGGTGAAGACGCCAGTGGA。反應條件:95 ℃ 30s預變性,95 ℃ 5 s變性60 ℃ 30 s退火延伸,40個循環;采用相對表達量計算法2-ΔΔCt計算目的基因相對表達水平。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 耗竭巨噬細胞可以減輕LPS誘導模型小鼠肺損傷后纖維化程度

與對照組相比,LPS和CL-LIP干預組第7天的HE染色可見肺泡結構被不同程度破壞甚至實變,肺間質內大量炎性細胞浸潤以及間隔增厚;Masson染色也觀察到淡藍色膠原纖維染色明顯增強(圖1A)。LPS模型組第7天和第10天肺組織的Ashcroft評分(分別為6.27±0.51、6.73±0.82)較對照組(0.33±0.09)明顯增加(P<0.01);而在CL-LIP組中,第7天評分(4.71±0.53)較對應時間點LPS組的評分顯著降低(P<0.05)(圖1B)。

A.pathological changes in each group by HE and Masson staining; B.Ashcroft′s score at different time points; Ctrl.control group; LPS-PF.lipopolysaccharide - induced pulmonary fibrosis group; CL-LIP.clodronate liposomes group; *P<0.01 compared with LPS-PF/CL-LIP and Ctrl group; #P<0.05 compared with LPS-PF and CL-LIP group in day 7.

2.2 耗竭巨噬細胞抑制LPS-PF模型小鼠中MMT過程

在LPS組, CD68α-SMA共標記的MMT表型細胞數量在第7天(292.0±61.9)和第10天(346.0±43.9)均較第3天(52.5±11.8)明顯增加(P<0.01)(圖2A, B)。而在CL-LIP組中,盡管α-SMA陽性細胞數較第7天LPS組的數量未見明顯變化;但CD68和CD68 α-SMA共表達的陽性細胞計數均較LPS組顯著降低(P<0.01)(圖2A, B)。

A.expression of CD68, α-SMA, CD68 α-SMA in each group measured by immunofluorescent staining; B.number of CD68、α-SMA、CD68 α-SMA positive cells at different time points; Ctrl.control group; LPS-PF.lipopolysaccharide-induced pulmonary fibrosis group; CL-LIP.clodronate liposomes group; *P<0.01 compared with LPS-PF in day 7, 10 and in day 3; #P<0.01 compared with LPS-PF and CL-LIP group in day 7.

2.3 體外誘導MMT過程具有促纖維化作用

TGF-β1分別刺激24 h、48 h及96 h均可見CD68、α-SMA共標記現象,并且隨著刺激時間的延長,共標記熒光強度逐漸增強(圖3A)。第96 h的α-SMA蛋白表達量(0.93±0.03)較對照組(0.50±0.02)明顯升高(P<0.05)(圖3C)。RT-qPCR檢測96 h的α-SMA(4.32±0.88比1.15±0.07)、FN(4.17±0.24比1.13±0.12)、Col1(3.76±0.68比1.16±0.16)表達水平較對應時間點明顯上升(P<0.01)(圖3D,E,F)。在刺激后第48 h,FN、Col1表達水平分別為2.98±0.29、1.98±0.26較對應時間點對照組的表達水平(分別為1.17±0.11、1.08±0.14)明顯升高(P<0.05)(圖3E,F)。

A.different expression of α-SMA (red light), CD68 (green light) in each group measured by immunofluorescent staining; B.Western blot detection of α-SMA protein expression; C.quantitation of α-SMA levels; E.RT-qPCR was used to detect the expression of α-SMA; F.RT-qPCR was used to detect the expression of FN; G.RT-qPCR was used to detect the expression of Col1; Ctrl.control group; MMT.macrophage-to-myofibroblast transition group; FN.fibronetin; Col1.collagen-1; *P<0.05, **P<0.01 compared with the Ctrl of 48 hours, 96 hours and 24 hours.

2.4 在MMT過程中Smad3、p-Smad3的表達量升高

體外誘導MMT過程中,Smad3的表達量在48 h(0.52±0.20)和96 h (0.87±0.13)較對應時間點的對照組(0.20±0.06、0.22±0.15)的明顯增加(P<0.01)(圖4A,B);磷酸化Smad3(p-Smad3)的表達量在48 h(0.49±0.21)和96 h(0.99± 0.18)較對應時間點的對照組(0.14±0.04、0.15±0.32)的明顯增加(P<0.01)(圖4A,C)。在LPS-PF模型組中,Smad3的表達量在第7天(1.10±0.56)和第10天(1.37±0.34)較對應時間點的對照組(0.49±0.08、0.45±0.05)的明顯增加(P<0.01)(圖4D,E);p-Smad3的表達量在第7天(0.67±0.06)和第10天(0.92±0.12)較對應時間點的對照組(0.34±0.06、0.39±0.07)的明顯增加(P<0.01)(圖4D,F)。

A.protein expression of Smad3, p-Smad3 in BMDMs; B, C.relative expression of Smad3, p-Smad3 protein in BMDMs; D.protein expression of Smad3, p-Smad3 in lung tissue; B, C.relative expression of Smad3, p-Smad3 protein in lung tissue; *P<0.01 compared with TGF-β1, LPS-PF group and Ctrl group.

3 討論

LPS作為細菌細胞外壁主要成分,在誘導炎性反應中起到決定性作用,故常被用于ALI/ARDS動物模型的建立。本研究參考前人造模方法[10],觀察到第7天肺組織膠原纖維含量明顯增加;而耗竭體內巨噬細胞后,第7天肺纖維化的程度明顯減輕,表明巨噬細胞在肺纖維化過程中發揮促進作用。

一般認為巨噬細胞對肺纖維化的影響主要與巨噬細胞極化有關,即對肺泡上皮細胞反復損傷與異常修復的過程[2,4,13]。一方面,M1型極化釋放TNF-α、IL-1β和IL-6等細胞因子加重肺部炎性反應;另一方面,M2型極化釋放TGF-β1和IL-10等多種細胞因子,促進成肌成纖維細胞生成、細胞外基質(extracellular matrix,ECM)沉積,最終導致肺纖維化的發生發展。但巨噬細胞對肺纖維化促進的其他機制很少有報道。

肌成纖維細胞聚集被認為是肺纖維化的一個標志[11-12],主要包括駐留于組織中成纖維細胞、上皮細胞向間充質細胞轉化以及骨髓組織衍生的循環纖維細胞激活三種來源。MMT過程的發現為研究巨噬細胞促進纖維化的可能機制提供了新方向,也為多種途徑干預肌成纖維細胞提供依據。有研究將巨模型肺組織中觀察到CD68α-SMA共表達細胞;在CL-LIP組中,由于巨噬細胞被提前耗竭,CD68 α-SMA共表達細胞數量明顯降低。而體外實驗誘導CD68α-SMA共表達的細胞表現促纖維化特性。從而表明在LPS-PF小鼠模型中,巨噬細胞對纖維化的促進可能是通過巨噬細胞向肌成纖維細胞轉化過程完成。

Smad3與肺間質纖維化關系密切,已成為抗纖維化治療的潛在靶點[12-13]。本研究在纖維化肺組織中檢測Smad3和p-Smad3蛋白的表達水平明顯升高也說明存在這種關系。而在進一步檢測體外誘導CD68α-SMA共表達細胞Smad3和p-Smad3蛋白的表達發現,顯著升高的Smad3和p-Smad3蛋白可能在MMT過程促纖維化進程中發揮重要作用。

綜上,MMT過程在肺損傷肺組織中具有促纖維化作用。但本研究初次涉足MMT過程對LPS所致ALI模型小鼠肺纖維化的影響,尚需深入研究來了解MMT過程的具體機制,從而為改善ALI后肺纖維化提供更完整的理論依據。