AP2M1抑制彌漫性大B細胞淋巴瘤細胞增殖和侵襲

彌漫性大B細胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)是一種起源于B淋巴細胞的惡性腫瘤[1],也是全球常見的侵襲性非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin′s lymphoma,NHL)類型,約占所有NHL患者的1/3[2]。DLBCL的主要治療方案為全身化學治療(化療),一線化療方案為環磷酰胺/阿霉素/長春新堿/強的松[3]。盡管現有的治療方案使60%～70%的DLBCL患者得到有效治療,但DLBCL的5年生存率仍然很低,仍有30%～40%的患者出現化學治療耐藥、復發和轉移[4]。因此,有必要探索新的診斷和治療靶點以提高患者的生存時間。接頭相關蛋白質復合體2亞基μ1(adaptor related protein complex 2 subunit μ1,AP2M1)是接頭蛋白質復合體2(adaptor protein complex 2,AP-2)家族,也是一種膜蛋白質,參與網狀蛋白質的內吞作用[5]。AP2M1的表達水平與DLBCL患者的總體生存率呈正相關,AP2M1高表達的DLBCL患者的總體生存率高于低表達患者[6]。然而,目前尚不清楚AP2M1在DLBCL中的具體功能。AP2M1對膽囊癌細胞中的磷酸化的表皮生長因子受體(epithelial growth factor receptor,EGFR)表達具有抑制作用[7]。EGFR是一種跨膜酪氨酸激酶受體,與細胞外配體結合形成二聚體,使細胞內結構域磷酸化,隨后磷酸化并激活磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K),導致PI3K/蛋白質激酶B(protein kinase B,Akt)信號的激活[8]。EGFR/PI3K/AKT信號通路是一種重要的癌調節通路[9]。本研究旨在揭示AP2M1基因對DLBCL細胞增殖和侵襲的影響,并分析其對EGFR/PI3K/AKT信號通路的調控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗試劑:Lipofectamine 2000(Invitrogen公司);RPMI-1640培養基(Sigma-Aldrich公司);四甲基偶氮唑鹽(MTT)、Matrigel(北京索萊寶科技有限公司);Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒、Trizol、BeyoRT Ⅱ M-MLV反轉錄酶(RNase H-)、BeyoFast SYBR Green One-Step RT-qPCR Kit試劑盒、ECL(碧云天生物技術研究所);Bcl-2、p-PI3K、p-AKT一抗(Cell Signaling Technology公司);Bax、基質金屬蛋白質酶(MMP)-2、MMP-9、AP2M1、EGFR、PI3K、AKT、β-actin一抗和山羊抗兔IgG H&L(HRP)二抗(Abcam公司)。

1.1.2 細胞和動物:人彌漫性大B細胞淋巴瘤細胞系OCI-LY8(ATCC公司)。SPF級BALB/c雄性裸鼠(體質量18～22 g,7～8周齡)[西安交通大學實驗動物中心,生產許可證:SCXK(陜)2020-001]。

1.1.3 患者標本的采集:共收集空軍軍醫大學第二附屬醫院血液內科收治的彌漫性大B細胞淋巴瘤患者的34份DLBCL組織(設為DLBCL組)和21份反應性淋巴結增生(reactive hyperplasia of lymph node,RLH)組織(設為RLH組)。所有受試患者采集組織標本前均未接受相關治療。所有受試者均簽署受試研究知情同意書,本研究經空軍軍醫大學第二附屬醫院倫理委員會批準(審批編號:TD-LXY-2020-0126-L05)。

1.2 方法

1.2.1 細胞的分組和感染處理:將OCI-LY8細胞共分為5組:對照組(control)、NC-shRNA組、AP2M1-shRNA組、NC-LV組和AP2M1-LV組。根據試劑盒使用說明步驟,使用Lipofectamine 2000對OCI-LY8細胞進行細胞轉染。對照組細胞不進行感染處理,NC-shRNA組細胞轉染陰性對照shRNA慢病毒,AP2M1-shRNA組細胞感染AP2M1 shRNA慢病毒,NC-LV組細胞感染陰性對照過表達慢病毒、AP2M1-LV組細胞感染AP2M1過表達慢病毒。shRNA及慢病毒均委托上海吉瑪制藥技術有限公司合成。感染48 h后進行后續實驗。

1.2.2 MTT法檢測細胞增殖:將100 μL對數增殖期的OCI-LY8細胞(2×103個)加入96孔板中,在37 ℃和5% CO2條件下培養48 h。每孔加入10 μL的MTT溶液(5 mg/mL)繼續孵育4 h。去除上清液并加入150 μL的DMSO溶解結晶。酶標儀中測量570 nm處吸光度值(A值)。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡:將對數增殖期的OCI-LY8細胞用PBS溶液(pH 7.5)重懸處理,取1×105個OCI-LY8細胞接種在6孔板中,加入5 μL的annexin V-FITC和5 μL 的PI,室溫避光孵育5 min處理。在BD FACSCalibur流式細胞儀上分析細胞凋亡水平。

1.2.4 Transwell小室法檢測細胞遷移和侵襲:遷移實驗中,用200 μL不含FBS的RPMI-1640培養基重懸對數生長期的OCI-LY8細胞(1×104個),然后加入Transwell上室中,Transwell下室添加800 μL含20% FBS的RPMI-1640培養基。培養48 h后,用棉簽擦去未遷移的細胞,然后用4%多聚甲醛固定30 min,1%結晶紫染色15 min。顯微鏡下計數遷移的細胞。侵襲實驗中,首先使用50 μL 250 μg/mL的Matrigel包被Transwell上室,其他步驟同遷移實驗處理。

1.2.5 RT-qPCR檢測mRNA表達:使用Trizol從組織標本和OCI-LY8細胞中提取總RNA,用分光光度法定量RNA濃度。BeyoRT Ⅱ M-MLV反轉錄酶(RNase H-)用于制備cDNA。采用BeyoFast SYBR Green One-Step RT-qPCR Kit試劑盒在ABI 7500實時熒光定量PCR儀上進行PCR。反應條件為:95 ℃ 30 s;40個循環(95 ℃ 5 s,60 ℃ 34 s)。β-actin為內源性對照,采用2-ΔΔCt方法計算基因相對表達量。引物序列如下:AP2M1正向5′-TTGATG ACTGCACCTTCCAC-3′和反向5′-TGTCCTTGGTTGT GCGATAC-3′;β-actin正向5′-CTCCAGGCAGTTCG GCAACCTATCCT-3′和反向5′-ACTGCGTTATTCGG TCGCAGCAG-3′。

1.2.6 Western blot檢測蛋白質表達:使用RIPA分離OCI-LY8細胞和腫瘤組織的總蛋白質。BCA試劑盒定量蛋白質濃度,然后使用10%～12%的SDS-PAGE分離蛋白質并轉移到PVDF膜上,5%脫脂牛奶4 ℃封閉膜12 h后,將膜與Bcl-2、Bax、MMP-2、MMP-9、AP2M1、EGFR、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT和β-actin一抗(稀釋比為1∶1 000)在4 ℃孵育過夜,隨后與山羊抗兔IgG H&L(HRP,稀釋比為1∶1 000稀釋)二抗在室溫下孵育2 h。通過ECL顯影,ImageJ軟件定量條帶密度。β-actin為內源性對照。

1.2.7 裸鼠移植瘤模型的建立及治療處理:將裸鼠在SPF條件下飼養1周,然后隨機分為陰性對照過表達慢病毒(R-NC-LV)組和AP2M1過表達慢病毒(R-AP2M1-LV)組,每組6只。兩組裸鼠分別皮下注射100 μL NC-LV和AP2M1-LV的OCI-LY8細胞懸液(5×106個)。使用游標卡尺測量腫瘤體積。28 d后頸椎脫臼處死裸鼠,分離腫瘤并進行稱重。

1.2.8 免疫組織化學檢測:分離的裸鼠腫瘤組織用4%多聚甲醛固定,常規制作4 μm石蠟切片。切片脫蠟和水化后,用10 mmol/L檸檬酸鈉緩沖液煮沸30 min進行抗原修復,正常山羊血清中封閉30 min后與AP2M1和EGFR一抗(稀釋比為1∶200)在4 ℃下孵育過夜,然后與山羊抗兔IgG H&L(HRP,稀釋比為1∶200)二抗于室溫孵育1 h。DAB顯色,蘇木精復染,顯微鏡下觀察陽性染色情況。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 DLBCL組織和RLH組織中AP2M1的表達水平

DLBCL組中AP2M1的mRNA相對表達量為0.44±0.16,顯著降低于RLH組的1.00±0.23(t=9.853,P<0.001)。

2.2 AP2M1對OCI-LY8細胞增殖和凋亡的影響

與對照組相比,AP2M1-shRNA組的相對細胞活力升高(P<0.05),AP2M1-LV組的相對細胞活力降低(P<0.05)(圖1A)。與對照組相比,AP2M1-shRNA組中AP2M1的mRNA和蛋白相對表達量均降低(P<0.05),AP2M1-LV組中AP2M1的mRNA和蛋白相對表達量均升高(P<0.05)(圖1B～D)。

A.relative cell viability in each group; B-D.AP2M1 mRNA and protein expression in OCI-LY8 cells of each group; *P<0.05 compared with control group and NC-shRNA group; #P<0.05 compared with control group and NC-LV group.

與對照組相比,AP2M1-shRNA組的細胞凋亡率降低(P<0.05),AP2M1-LV組的細胞凋亡率升高(P<0.05)(圖2A, B)。與對照組相比,AP2M1-shRNA組的Bcl-2蛋白相對表達量升高(P<0.05),Bax蛋白相對表達量降低(P<0.05);與對照組相比,AP2M1-LV組的Bcl-2蛋白相對表達量降低(P<0.05),Bax蛋白相對表達量升高(P<0.05)(圖2C～E)。

A,B.apoptosis of OCI-LY8 cells detected by flow cytometry; C-E.protein expression of apoptosis-related proteins Bcl-2 and Bax in each group of cells; *P<0.05 compared with control group and NC-shRNA group; #P<0.05 compared with control group and NC-LV group.

A-C.migration and invasion of OCI-LY8 cells detected by Transwell assay(×400); D-F.protein expression of migration and invasion-related proteins MMP-2 and MMP-9 in cells of each group; *P<0.05 compared with control group and NC-shRNA group; #P<0.05 compared with control group and NC-LV group.

A-D.protein expression of EGFR and the phosphorylation of PI3K and AKT in cells of each group; *P<0.05 compared with control group and NC-shRNA group; #P<0.05 compared with control group and NC-LV group.

A-C.tumor images (6 repetitions), tumor volumes and tumors of two groups of nude mice; D-H.protein expression of AP2M1 and EGFR and phosphorylation of PI3K and AKT in tumor tissue of each group; I.immunohistochemical staining images of AP2M1 and EGFR in tumor tissue (×400); *P<0.05 compared with R-NC-LV group.

2.3 AP2M1對OCI-LY8細胞遷移和侵襲的影響

與對照組相比,AP2M1-shRNA組的遷移和侵襲細胞數量增加(P<0.05),AP2M1-LV組的遷移和侵襲細胞數量降低(P<0.05)(圖3A～C)。與對照組相比,AP2M1-shRNA組的MMP-2和MMP-9蛋白相對表達量升高(P<0.05),而AP2M1-LV組的MMP-2和MMP-9蛋白相對表達量降低(P<0.05)(圖3D～F)。

2.4 AP2M1對OCI-LY8細胞中EGFR/PI3K/AKT信號通路的影響

與對照組相比,AP2M1-shRNA組細胞中EGFR的蛋白表達水平及PI3K和AKT的磷酸化水平均升高,AP2M1-LV組細胞中EGFR的蛋白表達水平及PI3K和AKT的磷酸化水平均降低(P<0.05)(圖4)。

2.5 AP2M1對移植瘤模型裸鼠腫瘤生長和EGFR/PI3K/AKT信號通路的影響

與R-NC-LV組相比,R-AP2M1-LV組裸鼠的腫瘤體積和質量均降低(P<0.001)(圖5A～C)。與R-NC-LV組相比,R-AP2M1-LV組裸鼠的腫瘤組織中AP2M1的蛋白表達水平升高(P<0.001),EGFR的蛋白表達水平及PI3K和AKT的磷酸化水平均降低(P<0.001)(圖5D～H)。免疫組化染色結果也顯示,與R-NC-LV組相比,R-AP2M1-LV組裸鼠的腫瘤組織中AP2M1的陽性表達升高,EGFR的陽性表達降低(圖5I)。

3 討論

最新研究報道,AP2M1在DLBCL患者腫瘤組織中異常表達,AP2M1高表達患者的總體生存率更高[6]。在本研究中,發現AP2M1在DLBCL中的轉錄水平明顯低于RLH組織,提示AP2M1可能參與了DLBCL的發生發展。目前,AP2M1在不同癌組織中具有不同的表達模式。例如,膽囊癌組織中AP2M1的表達水平降低[7]。然而,肝癌組織的AP2M1表達水平則高于正常肝臟組織,并且AP2M1表達水平與患者預后相關,AP2M1低表達的患者的生存率更高[10]。本研究分析,AP2M1可能與不同癌類型的發病機制或腫瘤特性有關,在肝癌中,AP2M1對網狀蛋白質內吞作用的調節影響了乙肝病毒對宿主的感染,進而影響了癌的發生發展[11]。在DLBCL中,AP2M1可能發揮其他的功能。

本研究發現,AP2M1在DLBCL中主要發揮抗癌作用,AP2M1的高表達有助于抑制DLBCL的進展。為了揭示AP2M1影響DLBCL細胞功能的分子機制。本研究考察了AP2M1對OCI-LY8細胞中中EGFR/PI3K/AKT信號通路的影響。EGFR/PI3K/AKT信號通路是重要的促存活通路,在癌形成中發揮重要作用[9]。目前,文獻證實AP-2復合物調節活化的EGFR的內吞及其功能[12]。磷酸化的EGFR變成活化的二聚體,該二聚體進入內吞小體發生內吞,隨后分選入溶酶體進入降解途徑[13]。EGFR通過內吞作用進入細胞可影響細胞增殖、發育相關信號通路的傳遞,有研究顯示,當EGFR無法內吞時,EGF的刺激能夠增強細胞增殖,相反,EGFR的內吞可減弱EGF誘導的細胞增殖[14]。本研究推測,AP2M1可能通過調節EGFR影響DLBCL細胞功能。結果表明,AP2M1的過表達在體內和體外均抑制了EGFR/PI3K/AKT信號通路的激活,而下調AP2M1則在體外激活了該通路。因此,EGFR/PI3K/AKT信號通路可能介導AP2M1對DLBCL細胞功能的調控作用。其他學者也報道,AP2M1的過表達抑制了膽囊癌細胞中的EGFR表達及其下游PI3K/AKT信號的活化[7],支持本研究結果。

綜上所述,本研究表明AP2M1在DLBCL中發揮抗癌作用,AP2M1的過表達部分通過抑制EGFR/PI3K/AKT信號通路來抑制DLBCL細胞的增殖和侵襲。AP2M1可能是治療DLBCL的新型分子靶標,值得進一步研究。