鑒定順鉑對人肝癌細胞系轉錄物組的影響

郭 鑫，冀夢蝶，王 琦，李雪媛，陳 陽

中國醫學科學院 北京協和醫學院 基礎醫學研究所 生物化學與分子生物學系 重大疾病共性機制研究全國重點實驗室，北京 100005

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是一種常見的惡性腫瘤,也是癌相關死亡的主要原因之一[1]。目前,已經研發出多種用于肝癌治療的化學治療藥物。其中,順鉑(cisplation,cis-diaminodichloroplatinum,CDDP)是第一種合成的鉑類抗癌藥物,仍然廣泛應用于肝癌治療。順鉑是一種細胞非特異性藥物,在進入細胞后水化反應形成水合順鉑,該物質強烈結合癌細胞DNA形成Pt-DNA加合物,干擾癌細胞DNA的復制,從而引起DNA損傷,抑制癌細胞的增殖,并引發細胞凋亡[2]。

轉錄物組(transcriptome)是細胞特定發育階段或生理條件下完整的轉錄本(RNA)及其數量的總和。轉錄物組學(transcriptomics)是從RNA水平研究基因表達的情況,其研究對發育和疾病至關重要[3]。目前,順鉑耐藥機制上已經取得了一些進展,但腫瘤細胞對順鉑反應的異質性機制仍然需要探索。為了揭示肝癌細胞對順鉑耐藥的共性轉錄物變化,本研究選取兩種來源不同的肝癌細胞系HepG2、Huh7,通過不同濃度順鉑處理肝癌細胞系后進行轉錄物組測序( RNA-sequencing,RNA-seq) 以探索其轉錄物組發生的改變。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系: 人肝癌細胞系HepG2、Huh7(中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心)。

1.1.2 試劑:細胞培養試劑(Gibco公司);γH2A.X抗體、cisplation抗體(Abcam公司);VAHTS Universal V6 RNA seq Library Prep Kit for Illumina? RNA-seq建庫試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞的培養及處理:均使用DMEM高糖,10%胎牛血清培養HepG2、Huh7細胞,細胞貼壁24 h后使用培養基溶解的不同濃度的順鉑處理細胞后收樣檢測其活性、構建普通轉錄物組文庫以及進行免疫熒光實驗。

1.2.2 RNA-seq檢測細胞轉錄物組:使用VAHTS Universal V6 RNA-seq Library Prep Kit for Illumina試劑盒建庫后進行測序。數據下機后,先用fastqc軟件對數據進行質控,用bowtie2軟件將轉錄物組數據比對到hg38參考基因組上,然后用Featurecounts軟件對基因表達進行定量,最后用R軟件對基因表達矩陣進行分組整理。

1.2.3 差異基因(differentially expressed genes,DEG)的分析及KEGG通路富集分析:將feature Counts導出的矩陣導入到DESeq2中,用dds函數構建DESeqDataSet對象,再用DESeq函數進行差異表達分析,獲取結果并保存到Excel表格中。繪制差異基因火山圖,選取目標基因利用DAVID[4](https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp)數據庫進行KEGG分析,KEGG的氣泡圖使用Sangerbox3.0[5](http://sangerbox.com/home.html)工具繪制。

1.2.4 蛋白質相互作用網絡分析(protein-protein interaction, PPI)及預后:基于篩選出來的基因,使用STRING[6](https://STRING-db.org/)生成蛋白質相互作用網絡,利用Network Analyser工具對網絡中的各個節點進行分析,得到各個節點的節點度值。根據節點度篩選出來的基因利用交互式分析平臺GEPIA[7](http://gepia.cancer-pku.cn/)分析基因表達與腫瘤患者預后的關系。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 順鉑處理對肝癌細胞系活性影響分析

隨著順鉑濃度升高HepG2和Huh7細胞的活性明顯下降,且下降趨勢一致(圖1A),觀察隨濃度升高,兩株細胞形態均改變,發生凋亡(圖1B)。

A.cell viability of HepG2 and Huh7 cells treated with different concentrations of cisplatin for 12 hours; B.cell morphology of HepG2 and Huh7 cells treated with different concentrations of cisplatin for 12 hours.

2.2 順鉑處理引起DNA損傷

與對照組相比,隨著順鉑濃度升高,兩株細胞的細胞核周邊逐步出現 cisplatin 信號富集,少量在細胞核上富集,γH2A.X 在受到順鉑處理后信號增強(圖2)。

A.immunofluorescence of cisplatin and γH2A.X in HepG2 cells after cisplatin treatment;B.immunofluorescence of cisplatin and γH2A.X in Huh7 cells after cisplatin treatment.

2.3 轉錄物組測序結果主成分分析及差異基因分析

使用5個濃度處理細胞后進行轉錄物組測序,每個濃度共2個樣本,加上時間對照,每組一共12個樣本,在主成分分析(principal component analysis,PCA)中,每組實驗樣本的兩個重復之間呈現出均一的重合分布,而不同濃度的順鉑處理后的樣本則顯示出分散的分布(圖3A,圖4A)。DEG分析顯示,兩株細胞中無藥物對照和0 h空白對象相比無明顯差異(圖3B,圖4B)。在HepG2細胞系中,共有255個基因在不同濃度的順鉑處理下被共同上調(圖3G),208個基因被共同下調(圖3H)。而在Huh7細胞系中,有185個基因在各個實驗組中被共同上調(圖4G),268個基因被共同下調(圖4H)。

A.PCA analysis of HepG2 cells after cisplatin treatment, PC1 and PC2 represented the first and second principal components of the data; B.volcano plot of differential gene expression in HepG2 cells between 12 h and 0 h HepG2 cells; C.volcano plot of differential gene expression in HepG2 cells between 0 μmol/L and 20 μmol/L cisplatin treatment; D.volcano plot of differential gene expression in HepG2 cells between 0 μmol/L and 50 μmol/L cisplatin treatment; E.volcano plot of differential gene expression in HepG2 cells between 0 μmol/L and 100 μmol/L cisplatin treatment; F.volcano plot of differential gene expression in HepG2 cells between 0 μmol/L and 200 μmol/L cisplatin treatment; G.overlap of up-regulated genes in HepG2 cells with different concentrations of cisplatin; H.overlap of down-regulated genes in HepG2 cells with different concentrations of cisplatin.

A.PCA analysis of Huh7 cells after cisplatin treatment,PC1 and PC2 represented the first and second principal components of the data; B.volcano plot of differential gene expression in Huh7 cells between 12 h and 0 h Huh7 cells; C.volcano plot of differential gene expression in Huh7 cells between 0 μmol/L and 20 μmol/L cisplatin treatment; D.volcano plot of differential gene expression in Huh7 cells between 0 μmol/L and 50 μmol/L cisplatin treatment; E.volcano plot of differential gene expression in Huh7 cells between 0 μmol/L and 100 μmol/L cisplatin treatment; F.volcano plot of differential gene expression in Huh7 cells between 0 μmol/L and 200 μmol/L cisplatin treatment; G.overlap of up-regulated genes in Huh7 cells with different concentrations of cisplatin; H.overlap of down-regulated genes in Huh7 cells with different concentrations of cisplatin.

2.4 不同濃度順鉑處理后兩種細胞系重疊基因及富集通路分析

選取了兩種細胞所有實驗組中共同的上調和下調的DEG,并使用韋恩圖展示了上下調的DEG之間的重疊情況。共有59個共同上調基因、196個HepG2特異上調基因以及127個Huh7特異上調基因; 通過分析下調基因,共有81個共同的差異下調基因、127個HepG2特異下調基因以及187個Huh7特異下調基因(圖5A,D)。兩株細胞共同上調的59個基因主要富集在腫瘤發生發展相關通路(圖5B)。而對于兩株細胞共同下調的81個基因進行基因功能分析,主要富集在Rap1信號通路、Ras信號通路、調控干細胞多能性、軸突的指導和黏附連接等相關通路(圖5E)。

2.5 共同上調、下調基因基因編碼蛋白質相互作用網絡分析

使用 STRING 數據庫分別繪制 59 個共同上調基因以及81個共同下調基因的蛋白質相互作用網絡。在共同上調基因的網絡中,具有節點度大于5的基因包括FosB 原癌基因,AP-1 轉錄因子(Fos proto-oncogene, AP-1 transcription factor subunit,FOS)、Jun 原癌基因,AP-1 轉錄因子(Jun proto-oncogene, AP-1 transcription factor subunit,JUN)、轉錄激活因子3(activating transcription factor 3,ATF3)、周期素依賴性激酶抑制因子1A(cyclin dependent kinase inhibitor 1A,CDKN1A)、生長停滯DNA損傷可誘導蛋白α(growth arrest and DNA damage inducible alpha,GADD45A)和KLF轉錄因子(KLF transcription factor 4,KLF4)(圖5C)。而在共同下調基因的網絡中,節點度最高的基因是AT豐富結合域含蛋白1B (AT-rich interaction domain 1B,ARID1B),其節點度為5(圖5F)。

A.overlap of upregulated DEG in both HepG2 and Huh7 cells; B.KEGG analysis of upregulated DEG in both HepG2 and Huh7 cells; C.PPI analysis of upregulated DEG in both HepG2 and Huh7 cells; D.overlap of downregulated DEG in both HepG2 and Huh7 cells; E.KEGG analysis of downregulated DEG in both HepG2 and Huh7 cells; F.PPI analysis of downregulated DEG in both HepG2 and Huh7 cells.

2.6 相關特征基因與預后的關系

對共同上調基因蛋白質相互作用網絡中節點度大于5的基因以及共同下調基因的蛋白質相互作用網絡中節點度最高的基因ARID1B分析與GEPIA數據庫中TCGA-LIHC患者隊列生存預后的關系,其中只有 JUN 和 GADD45A與患者生存存在顯著相關性(圖6)。

A,B.prognostic correlation of JUN and GADD45A in hepatocellular carcinoma patients; Transcripts per million(TPM) indicated the number of specific genes per million transcripts, taking into account the length of the gene and the total sequencing depth, better reflecting the relative level of gene expression.

3 討論

本研究顯示,隨著順鉑濃度的增加,兩種肝癌細胞系的活性降低,DNA損傷加重。通過轉錄物組測序和差異基因篩選,發現HepG2和Huh7細胞共同受影響的KEGG通路。研究還揭示了一些共同上調基因,包括FOS、JUN、ATF3、CDKN1A、GADD45A和KLF4,其中JUN與患者生存期延長相關,而GADD45A則與生存期延長呈負相關,可能可以成為肝癌患者預后的標志物。然而,在共同下調基因中,ARID1B在網絡中起到重要作用,但與患者生存期無顯著相關。

以上結果表明肝癌細胞對順鉑的應答機制可能與JUN和GADD45A的轉錄調控有關。其中,JUN是轉錄激活蛋白1(activator protein 1,AP-1)的主要組成部分,參與細胞增殖、凋亡和腫瘤發生等過程,活化的JUN蛋白在保護人類腫瘤細胞免受DNA損傷誘導的細胞凋亡方面具有重要作用[8]。當神經元遭受DNA損傷誘導的細胞凋亡時,JUN的表達會激活。該激活過程主要受到經典c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)通路以外的信號通路介導[9]。這意味著高表達JUN的肝癌患者可能對JNK抑制劑不太敏感。同時,有研究表明抑制JUN的轉錄活性可以有效阻止TNFα誘導的染色質重塑和間質轉化,有望改善腫瘤進展中的轉錄調控網絡失調[10]。

GADD45A則是一個關鍵的細胞周期調控蛋白,其通過直接與R環結合招募TET1介導局部DNA去甲基化[11],參與維持基因組的穩定性[12]、DNA修復和抑制細胞增殖[13]。GADD45A的減少可能導致腫瘤抑制基因(例如MLH1)的過度甲基化和失活[14],其高表達可能有助于維持細胞的穩定性,減緩腫瘤的生長速度,從而改善了患者的預后。綜上所述,這些研究結果為肝癌順鉑治療的轉錄共性變化提供了數據,提示克服順鉑耐藥可能關鍵在于DNA損傷修復的調節。然而,這些發現仍然需要更多的臨床研究來驗證其可靠性。