基于ITS條形碼的滇雞血藤及混偽品分子鑒定△

劉心雨，姜丹，楊楚楚，徐慶一，徐裕彬，陳緒軍，任廣喜*，劉春生*

1.北京中醫藥大學 中藥學院，北京 102488；

2.北京橘井健康科技集團有限公司，北京 100068；

3.北京衛仁中藥飲片廠有限公司，北京 101300

滇雞血藤作為臨床常用的中藥，為木蘭科南五味子屬植物內南五味子Kadsura interiorA.C.Smith的干燥藤莖，主產于云南西南部的保山、鳳慶、臨滄、耿馬等地。滇雞血藤味苦、甘，性溫，歸肝、腎經，具有活血補血、調經止痛、舒筋通絡的作用，主要用于月經不調、痛經、麻木癱瘓、風濕痹痛、氣血虛弱等癥[1]。滇雞血藤在婦科用藥中較為常見，特別在云南地區，滇雞血藤常被熬制成滇雞血藤單膏，或與川牛膝、續斷、紅花、黑豆一起組成復方滇雞血藤膏[2]，使用較為廣泛。滇雞血藤藥材的混偽品較多，目前基原植物的界定存在著較大爭議，影響了臨床用藥的安全性和有效性。前期系統分類學研究發現，內南五味子與異形南五味子K.heteroclita（Roxb.）Craib、南五味子K.longipedunculataFinet &Gagnep.、黑老虎K.coccinea（Lem.）A.C.Smith 的親緣關系較近，屬于近緣物種，且后三者均具有一定的藥用價值，藥材的外觀特征與內南五味子相似，在實際應用過程中很容易混淆[3-4]。徐菁[5]從化學成分和藥效活性2 個角度出發對內南五味子及其近緣種進行差異比較，挖掘內南五味子止痛活性的特征標志物，闡明了內南五味子與近緣種的差異性。但化學成分含量受采收時間等諸多因素的影響，通過規定合理的數值標準進行藥材鑒別存在較大困難。另有研究從植物形態、藥材性狀、顯微特征等方面對比了滇雞血藤基原植物內南五味子與異形南五味子之間的差異，結果顯示二者的差異主要體現在雄蕊的花絲與藥隔連成的形狀、藥室與雄蕊的長短比例等方面，在藥材栓皮裂隙及石細胞形態上雖有一定差異但不明顯[6-7]。在實際生產中，從產地收購的中藥材往往經過一定的加工處理，流通到市場的中藥材難以保持植物的原形態，同時，滇雞血藤以莖入藥，通過植物形態進行區分鑒定較為困難。性狀鑒別、顯微鑒別、理化鑒別等傳統的鑒別方法存在一定的局限性和主觀性[8]。以DNA 作為遺傳標記的中藥鑒定差異信息量大、穩定性高。為保證滇雞血藤藥材基原植物的準確性，亟待從分子生物學方面對滇雞血藤藥材基原植物內南五味子及其近緣物種展開差異性研究。

目前，DNA 條形碼技術已被廣泛應用到動植物藥材[9-18]及真菌細菌[19-21]等微生物的鑒定中，同時，隨著近些年來該技術的飛速發展，在中成藥[22-24]及中藥配方顆粒[25-26]等深加工產品領域的鑒定也取得了顯著成效。植物類藥材鑒定的通用候選序列有rbcL、matK、psbA-trnH、內轉錄間隔區（ITS）和ITS2等[27-30]。尚飛能等[31]基于ITS2條形碼及化學指紋圖譜建立了何首烏及其偽品的鑒定方法。王俊等[32]通過對7 條候選條形碼ITS、ITS2、psbA-trnH、rbcL、matK、trnL（UAA）內含子、trnL（UAA）的篩選，將trnL（UAA）內含子序列作為血竭藥材的DNA 條形碼鑒定序列。在滇雞血藤的分子鑒定中，熊瑤等[33]研究發現，matK不能把滇雞血藤和南五味子分開。周紅等[34]研究表明，采用psbA條形碼對雞血藤、滇雞血藤、大血藤藥材進行分子鑒定構建發育樹時，雞血藤、大血藤均單獨聚為一支，能明顯地與其他混偽品區分開，但滇雞血藤與異形南五味子聚為一支，無法區分。ITS 序列是核糖體基因非轉錄區的一部分，具有長度保守性、序列變異性高、進化速度快等優點，在藥用植物及其混偽品鑒定上具有良好的重復性和穩定性[35]，故采用ITS條形碼鑒定滇雞血藤及其混偽品具有可行性。

單核苷酸多態性（SNP）主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA 序列多態性。由多個SNP 突變構成的一種突變譜被稱為一種單倍型。鄭司浩等[36]基于甘草基因組的SNP 分子標記可成功鑒定不同產地的甘草。劉佳[37]通過對大黃matK序列差異位點分析，將其劃成了不同的單倍型，其中以掌葉大黃和唐古特大黃的單倍型種類最多，同時還發現不同產地所包含大黃單倍型的種類和數量也存在一定的差異。朱蘭等[38]根據云上黑山羊3 個核心群的SNP 位點對其進行了遺傳多樣性及遺傳關系的研究分析。本研究基于滇雞血藤ITS 條形碼的SNP 位點，構建滇雞血藤單倍型數據庫，區分鑒定雞血藤及其混偽品，同時為滇雞血藤種內遺傳多樣性研究提供參考。

1 材料

1.1 樣品

共收集滇雞血藤及混偽品藥材165 份，其中包括滇雞血藤藥材145份、南五味子藥材8份、異形南五味子（藥材粉末）5 份、黑老虎（葉片）7 份，滇雞血藤樣品主要來源于云南鳳慶等地，由河北橘井藥業公司提供。以上所有樣品經北京中醫藥大學劉春生教授鑒定，具體信息見表1。

表1 滇雞血藤及混偽品樣品信息

1.2 儀器與試劑

LSB35 型立式壓力蒸汽滅菌器（江陰濱江醫療設備有限公司）；MM400 型球磨儀（德國Retsch 公司）；1-14 型臺式小型離心機（德國Sigma 公司）；eriti 96 型梯度聚合酶鏈式反應（PCR）擴增儀（美國ABI公司）；JY-SP3型水平電泳槽（北京君意東方電泳設備有限公司）；GelDoc2000 型凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）。

植物基因組DNA 提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；2×RapidTaqMaster Mix 酶和DL2000 Plus Marker（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）；ITS 引 物（ITS-1F：5?-TCCGTAGGTGAACCTGC GG-3?，ITS-4R：5?-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3?）由北京睿博興科生物技術有限公司合成；瓊脂糖、50×TAE 溶液均購于北京蘭博利德生物技術有限公司。

2 方法

2.1 基因組總DNA提取

滇雞血藤藥材用75%乙醇擦洗表面后晾干；用75%乙醇擦過的剪刀將樣品剪碎，稱取藥材約70 mg（按照DNA 提取試劑盒要求的取樣量為干燥組織30 mg，但由于滇雞血藤藥材質地堅硬、纖維性強，研磨時較為困難，故應加大取樣量至70～100 mg，對于研磨不充分的樣品應進行二次研磨），放入已滅菌的離心管中，同時每個離心管里放入已滅菌的小鋼球2個；將離心管放入液氮中快速冷凍樣品，冷凍好的樣品用球磨儀研磨5 min（30 r·s-1），編號備用。處理好的藥材粉末用植物基因組DNA 提取試劑盒提取總DNA，65 ℃水浴1 h，期間搖晃數次混勻，其余步驟按照試劑盒說明書進行；所得DNA 于-20 ℃冰箱中保存備用。

2.2 PCR擴增及測序

ITS引物用滅菌雙蒸水溶解并稀釋至100 μmol·L-1。PCR 反應體積為30 μL，含2×RapidTaqMaster Mix 15 μL、正反引物各1 μL（100 μmol L-1）、ddH2O 11 μL、總DNA 2 μL。PCR 反應程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，56.4 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s（35 個循環）；72 ℃ 5 min。

采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產物，電壓130 V，電泳時間20 min；凝膠成像系統檢測，將單一、明亮的擴增條帶送至上海生工生物工程有限公司進行雙向測序。

2.3 測序分析及數據處理

測序原始結果利用CExpress v3.0.0 軟件進行序列拼接，并根據測序峰圖對堿基進行校正，去除引物區及兩端低質量序列；將得到的所有序列分別在美國國家生物技術信息中心（NCBI）數據庫中進行Blast（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比對，在從多方面確認參考序列準確性的基礎上，查看2 條序列的一致性，并對差異較大的序列進行判斷分析；使用DNAMAN v6 軟件進行多序列比對，統計其片段長度及變異位點個數；使用MEGA 5.0軟件計算K2P 遺傳距離，并且使用鄰接法（NJ）構建系統進化樹，聚類分析使用Bootstrap 進行分析，通過進行1000 次自展重復分析獲得。當同一物種的所有個體在系統樹上聚為一個單系，且支持率高于50%，則視為該物種鑒定成功；同時，根據滇雞血藤ITS 條形碼的SNP 位點構建滇雞血藤單倍型數據庫，確定滇雞血藤單倍型數據庫所包含的單倍型數量。

3 結果

3.1 種內種間遺傳距離分析

使用MEGA 軟件計算ITS 序列的種內、種間遺傳距離，基于K2P遺傳距離模型計算樣品平均種間、種內遺傳距離。滇雞血藤種內平均遺傳距離為0.002，滇雞血藤與異形南五味子、南五味子、黑老虎的種間平均遺傳距離為0.011。統計分析樣品種間及種內遺傳距離，得出遺傳距離分布表（表2）。理想DNA 條形碼種內遺傳距離應明顯小于種間距離，兩者之間存在明顯的界限。滇雞血藤及其混偽品ITS 條形碼序列雖具有較小的種內變異和較大的種間變異，但種內種間遺傳距離存在著部分重疊，barcoding gap較不明顯。

表2 滇雞血藤與其混偽品ITS條形碼種間與種內遺傳距離分布占比 %

3.2 系統發育樹聚類分析

使用MEGA 軟件分別對145 份滇雞血藤及其混偽品、滇雞血藤19 種單倍型及混偽品構建系統發育樹?；贗TS 條形碼構建的系統發育樹中共包括滇雞血藤145 份、異形南五味子1 份（4 份異形南五味子粉末微生物污染，測序分析失?。?、南五味子8份、黑老虎7 份。滇雞血藤、黑老虎各單獨聚為一支，異形南五味子與南五味子聚為一支，滇雞血藤能夠與其他3 個物種明顯分開，見圖1。滇雞血藤ITS 序列的19 種單倍型（DBX1～DBX19）與偽品構建系統發育樹，與上述結果保持一致，滇雞血藤單獨聚為一支，見圖2。由此可知，ITS 可以作為鑒定滇雞血藤及混偽品的DNA條形碼。

圖1 滇雞血藤及其混偽品ITS條形碼系統發育樹

圖2 滇雞血藤19種單倍型及其混偽品ITS條形碼系統發育樹

3.3 滇雞血藤ITS單倍型數據庫的分析

使用ITS通用引物對前期收集的110份滇雞血藤樣品（KI1～KI110）進行PCR 擴增，均獲得單一、明亮的條帶。PCR 擴增率和測序成功率均為100%，樣品膠圖見圖3。使用DNAMAN 軟件進行多序列比對，序列長度為675 bp，有9 個變異位點，共包括19 種單倍型，序列相似度99.52%，鳥嘌呤+胞嘧啶（G+C）占比為55.42%～55.87%。其中，滇雞血藤在163、647 bp 存在C-胸腺嘧啶（T）雜交（用字母N 表示），具體單倍型信息見表3。在110 份滇雞血藤樣品中，單倍型1 共1 份，為樣品KI80；單倍型2共1 份，為樣品KI40；單倍型3 共1 份，為樣品KI43；單倍型4 共1 份，為樣品KI67；單倍型5 共2份，為樣品KI77、KI108；單倍型6 共2 份，為樣品KI85、KI87；單倍型7 共2 份，為樣品KI41、KI84；單倍型8 共1 份，為樣品KI79；單倍型9 共2 份，為樣品KI19、KI60；單倍型10 共1 份，為樣品KI88；單倍型11 共1 份，為樣品KI92；單倍型12 共34 份，包括樣品KI1、KI3、KI4 等；單倍型13 共4 份，為樣品KI21、KI36、KI39、KI70；單倍型14 共35 份，包括樣品KI2、KI6、KI8 等；單倍型15 共5 份，為樣品KI10、KI27、KI30、KI59、KI76；單倍型16共2 份，為樣品KI78、KI90；單倍型17 共4 份，為樣品KI5、KI18、KI42、KI66；單倍型18 共10 份，包括樣品KI28、KI31、KI33 等；單倍型19 共1 份，為樣品KI103。其中，以單倍型12、14 的樣品數量居多，單倍型15、18次之。

表3 滇雞血藤ITS條形碼19種單倍型變異位點

為驗證所建滇雞血藤單倍型數據庫的穩定性，后期于市場采購35份滇雞血藤樣品（KI111～KI145），采用ITS 通用引物擴增，所得序列與所建滇雞血藤數據庫保持一致，未出現新的單倍型，樣品膠圖見圖4。在35 份滇雞血藤樣品中，包括單倍型5 共2份、單倍型7 共4 份、單倍型9 共1 份、單倍型12 共6 份、單倍型14 共16 份、單倍型15 共5 份、單倍型18 共1 份。對145 份滇雞血藤ITS 單倍型種類及數量進行匯總，單倍型1～19（藥材份數分別為1、1、1、1、4、2、6、1、3、1、1、40、4、51、10、2、4、11、1）分別占總數的0.69%、0.69%、0.69%、0.69%、2.76%、1.38%、4.14%、0.69%、2.07%、0.69%、0.69%、27.59%、2.76%、35.17%、6.90%、1.38%、2.76%、7.59%、0.69%。綜上所述，單倍型12、14為滇雞血藤ITS條形碼中的主要單倍型種類。

圖4 滇雞血藤樣品KI111～KI145電泳圖

4 討論

滇雞血藤作為目前臨床常用的一種補血活血、調經止痛的大宗藥材，已在我國歷史上沿用千年。由于植物形態相似，《Flora of China》將內南五味子歸并為異形南五味子[3-4]，但前期相關研究表明內南五味子與異形南五味子在植物形態、化學成分和藥效活性方面都有顯著差異[5-7]，目前滇雞血藤基原植物的界定還存在著較大爭議。隨著藥用資源的日益緊缺，市場需求量的逐漸增大，出現了不同程度的藥材摻偽現象，特別是近緣物種之間的以假亂真，造成中藥材市場的產品質量參差不齊，這嚴重影響了臨床用藥的安全性和有效性。ITS 作為核基因條形碼，也存在鑒定不理想或失敗的情況，如PCR 擴增結果易受到真菌等微生物的干擾作用[39]。前期滇雞血藤種內種間遺傳距離的計算及所構建的系統發育樹結果顯示，滇雞血藤種內種間遺傳距離存在著部分重疊現象，雖然系統發育樹上顯示滇雞血藤單獨聚為一支，但是據此得出ITS 可以作為鑒別滇雞血藤及其混偽品的DNA 條形碼缺乏一定的科學性。通過建立滇雞血藤ITS 單倍型數據庫，對結果進行了補充驗證，證明了滇雞血藤與其混偽品之間存在分子水平的差異，不僅為滇雞血藤臨床用藥的安全性和準確性提供了保障，同時也能豐富滇雞血藤的基因數據庫，使滇雞血藤種內變異得到較為全面、科學的解釋。單倍型是單倍體基因型的簡稱，在遺傳學上是指在同一染色體上進行共同遺傳的多個基因座上等位基因的組合，即若干個決定同一性狀的緊密連鎖的基因構成的基因型。Dong 等[40]基于SNP位點的簡化基因組測序（RAD-seq）對內南五味子及其異形南五味子等4 個近緣種進行基因多樣性、系統發育重建和群體遺傳結構分析，揭示了物種之間存在基因交流及生態位分化。謝平等[41]通過分析平貝母ITS 和matK序列中所包含的單倍型種類及數量，為貝母屬植物的物種界定提供了較為有效的理論依據。為了充分利用DNA 條形碼大批量、快速、準確地鑒定物種的優勢，除確立用于鑒定該物種及其常見混偽品的標準條形碼外，以此為基礎構建該物種的單倍型數據庫也顯得至關重要。

本研究一方面通過計算種內、種間遺傳距離，構建系統發育樹比較了滇雞血藤及其混偽品的親緣關系，初步確定了ITS 可以作為滇雞血藤及其混偽品的鑒定條形碼；另一方面通過建立滇雞血藤ITS單倍型數據庫對上述結論進行輔證，實現滇雞血藤的真偽鑒別，同時也為滇雞血藤的物種界定提供了參考。

[利益沖突]本文不存在任何利益沖突。