柴胡解表退熱功效相關生物活性指標與柴胡皂苷a、柴胡皂苷d含量相關性分析△

劉壯壯，康媛，郭怡琳，郭欣慰，李西蒙，蔡潤蘭，高源，齊云

中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所，北京 100193

柴胡是臨床常用中藥，始載于《神農本草經》，列為上品，功效為解表退熱、疏肝解郁、升舉陽氣?，F代中醫臨床常將其用于感冒發熱、寒熱往來、胸脅脹痛、月經不調、子宮脫垂、脫肛等[1]?！吨腥A人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020 年版中收錄了傘形科柴胡Bupleurum chinenseDC.（北柴胡）和狹葉柴胡B.scorzonerifoliumWilld.（南柴胡）2 個品種，依據南、北柴胡中柴胡皂苷a（SSa）和柴胡皂苷d（SSd）的含量，分別采用定性（南柴胡）或定量（北柴胡，SSa和SSd總質量分數不得少于0.30%）作為其化學質量控制標準[2]。

在柴胡的3 個功效中，解表退熱的歷史沿革最久，《神農本草經》中就記載了其“主治寒熱邪氣”[1]，臨床應用廣泛（如經典名方小柴胡湯、大柴胡湯、柴胡桂枝湯、柴葛解肌湯）。因此，本研究聚焦于柴胡解表退熱之功效，通過解析其可能存在的生物活性，從對應的相關體外模型中篩選出量效關系明顯的指標，并根據各指標在實際病理過程的重要性賦予不同權重，以加權后的綜合得分（生物活性量化值）量化柴胡解表退熱作用的強弱。通過將各個柴胡樣品的綜合得分與其所含SSa 和SSd 的總量進行相關性分析，即可間接判斷SSa 和SSd 是否是其解表退熱功效的物質基礎。

1 材料

1.1 細胞

小鼠單核巨噬細胞白血病細胞RAW264.7 購于美國模式培養物集存庫（ATCC）；人急性單核細胞白血病細胞THP-1 購于中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心。

1.2 藥材

柴胡樣品均由北京協和醫學院藥用植物研究所郭欣慰副研究員提供并鑒定為傘形科植物柴胡Bupleurum ChinenseDC.（北柴胡）或狹葉柴胡B.scorzonerifoliumWilld.（南柴胡）的干燥根，分別為四川北柴胡（用于活性指標篩選）、陜西寶雞北柴胡（B-1#）、湖北十堰房縣北柴胡（B-2#）、河南洛陽嵩縣北柴胡（B-3#）、黑龍江齊齊哈爾碾子山區北柴胡（B-4#）、黑龍江大慶林甸縣花園鎮南柴胡（N-5#）、內蒙古呼倫貝爾市扎蘭屯市臥牛河鎮南柴胡（N-6#）、內蒙古興安盟科爾沁右翼前旗大石寨鎮南柴胡（N-7#）。

1.3 試藥

DMEM 培養基干粉（批號：2445690）和RPMI 1640 培養基干粉（批號：2298430）均購自美國Gibco 公司；無噬菌體低內毒素優級胎牛血清（批號：22040703，浙江天杭生物科技股份有限公司）；細胞培養用青鏈霉素（批號：090419210209，北京索萊寶科技有限公司）；牛血清白蛋白（BSA，批號：WXBC8988V）、脂多糖（LPS，批號：0000130726）、Trolox（批號：BCBG5969V）和酵母多糖A（批號：BCBK3273V）均購自美國Sigma-Aldrich 公司；三吡啶三嗪（TPTZ，批號：1208864，美國Honeywell Fluka 公司）；乙腈（批號：20230214，天津市永大化學試劑有限公司）；Griess 試劑盒（批號：S0021M-2/S0021M-3，上海碧云天生物技術有限公司）；正常人血清補體（批號：185488，美國Quidel公司）；生物素化小鼠抗人C5b-9 抗體（批號：7397B-01，丹麥AntibodyShop公司）；辣根過氧化物酶（HRP）標記親和素（批號：B405103）、ELISA Coating Buffer（批號：B372207）、3,3′,5,5′-四甲基聯苯胺（TMB）顯色液（批號：B377080）和人腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA 試劑盒（批號：B352565）均購自美國Biolegend公司；CCK-8試劑盒（批號：40，美國GlpBio 公司）；SSa（批號：PS011067，純度≥98%）和SSd（批號：PS011481，純度≥98%）均購自成都普思生物科技股份有限公司。

1.4 儀器

Quintix35 型十萬分之一電子精密天平（德國Satorius 公司）；YF-116B 型高速中藥粉碎機（瑞安市永歷制藥機械有限公司）；98-1B 型加熱套（天津市泰斯特儀器有限公司）；MB100-4P 型微孔板恒溫振蕩器（杭州奧盛儀器有限公司）；Multiskan Ascent型酶標儀（美國Thermo Electron 公司）；Napco 5410型二氧化碳孵箱（美國Napco 公司）；Essentia LC-15C型高效液相色譜系統（配置LCsolution型色譜工作站、LC-15C 型泵、SIL-10AF 型自動進樣器、SPC-15C型紫外檢測器，日本島津公司）。

2 方法

2.1 藥物制備

按照臨床柴胡煎藥方式制備水煎劑：柴胡樣品經粉碎機簡單破碎后分別稱取約80 g置于煎藥器中，用10 倍量超純水浸泡2 h 后煎煮15 min，收集藥液；向藥渣中加5 倍量超純水煎煮15 min 后收集藥液，此為第二煎；第三煎重復第二煎的操作；合并3 次藥液。濾過并濃縮藥液后加入乙醇至醇體積分數為70%，4 ℃靜置過夜。濾過，除去多糖和蛋白質等沉淀物質，收集濾液濃縮至恒重，所得浸膏保存于-20 °C備用。

2.2 細胞培養

RAW264.7 細胞采用含10%胎牛血清和青霉素-鏈霉素的DMEM 培養基，THP-1 細胞采用含10%胎牛血清、0.05 mmol·L-1巰基乙醇和青霉素-鏈霉素的RPMI 1640培養基，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。

2.3 CCK-8法檢測細胞活力

取對數生長期的RAW264.7細胞或THP-1細胞，分別按2×105個/孔或3×105個/孔（100 μL/孔）接種于96 孔板中，隨后加入不同終質量濃度的柴胡提取物溶液（RAW264.7細胞為250、500、1000 μg·mL-1，THP-1細胞為125、250、500、1000 μg·mL-1，培養基溶解后過0.22 μm 濾膜除菌，100 μL/孔），于37 ℃、5% CO2培養箱中培養22 h 后，每孔加入CCK-8 溶液20 μL，在37 ℃繼續孵育2 h 后，測定450 nm 處的吸光度（A），按照公式（1）計算細胞活力。

2.4 Griss 法檢測細胞上清液中一氧化氮（NO）水平

取對數生長期的RAW264.7細胞，按2×105個/孔接種于96 孔板中，加入2.3 項下篩選得到的無毒質量濃度的柴胡提取物（B-1#、B-2#、B-3#和B-4#的終質量濃度為250、500 μg·mL-1；N-5#、N-6#和N-7#的終質量濃度為250、500、1000 μg·mL-1），預處理細胞1 h，加入終質量濃度為10 ng·mL-1的LPS，于細胞培養箱中繼續孵育24 h 后取上清液，用Griess試劑盒測定NO含量。

2.5 ELISA法檢測細胞上清液中TNF-α的含量

取對數生長期的THP-1 細胞，按3×105個/孔接種于96 孔細胞板中，加入2.3 項下篩選得到的無毒質量濃度的柴胡提取物（B-1#和B-3#終質量濃度為125、250、500 μg·mL-1；B-2#、B-4#、N-5#、N-6#、N-7#終質量濃度為125、250、500、1000 μg·mL-1），預孵育1 h 后加入終質量濃度為10 ng·mL-1的LPS，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h。次日收集細胞培養上清液，用ELISA試劑盒測定TNF-α的含量。

2.6 鐵離子還原能力法（FRAP）測定總抗氧化能力

FRAP 工作液參照本課題組前期建立的方法配制[3]，臨用現配。向96 孔酶標板每孔加入Trolox 或柴胡提取物50 μL，再加入TPTZ工作液200 μL，于微孔板恒溫振蕩器中37 ℃反應20 min后，測定540 nm處的A。以Trolox當量代表柴胡樣品總抗氧化能力。

2.7 酵母多糖介導的替代途徑補體活化水平測定

實驗方法在參考Jendza等[4]建立方法的基礎上稍作修改。將酵母多糖包被至96 孔板（100 μL/孔，1 mg·mL-1），4 °C 孵育過夜。用PBST 洗去游離的酵母多糖后，每孔加入1% BSA 封閉液200 μL，在25 ℃避光孵育1 h 后洗板4 次，立即使用或儲存于-20 ℃備用。于離心管中加入終質量濃度為125、250、500、1000 μg·mL-1的柴胡提取物50 μL，再加入稀釋12.5 倍的正常人血清補體50 μL，25 ℃避光反應15 min。將反應物加至包被了酵母多糖的ELISA 板內（50 μL/孔），37 ℃避光孵育1 h。洗去未結合物，加入生物素化小鼠抗人C5b-9 抗體（100 μL/孔），37 ℃避光孵育1 h。用PBST 洗去未結合物，加入HRP 標記的親和素（100 μL/孔），37 ℃避光孵育30 min。洗板5 次，加入TMB 底物（100 μL/孔），37 ℃避光顯色15 min。加入2 mol·L-1H2SO4（100 μL/孔）終止顯色反應，于450 nm 處檢測A。

2.8 高效液相色譜法（HPLC）測定各柴胡樣品中SSa和SSd的含量

2.8.1 樣品制備 按照《中國藥典》2020 年版柴胡【含量測定】項中的方法制備供試品溶液和對照品溶液[2]。

2.8.2 色譜條件 XBridge BEH C18反相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～5 min，70%B；5～35 min，70%～30%B；35～40 min，30%B；40～45 min，30%～70%B；45～60 min，70%B），柱溫為室溫，檢測波長為210 nm，流速為1 mL·min-1。

2.9 數據統計

3 結果

3.1 柴胡解表退熱功效相關靈敏指標的篩選

靈敏指標的篩選研究以四川產北柴胡（提取物得率為18.45%）為研究對象，通過解析柴胡解表退熱功效的臨床應用、風寒/風熱表證和外感發熱的病理過程，從抗巨噬細胞活化 [包括3 個指標：LPS 刺激巨噬細胞分泌NO、白細胞介素-6（IL-6）、TNFα]、抗肥大細胞活化[包括3 個指標：免疫球蛋白E（IgE）/免疫球蛋白Fc 段受體（FcεRI）介導RBL-2H3 細胞脫顆粒、Mas 相關G 蛋白偶聯受體-X2（MrgprX2）介導LAD2 細胞脫顆粒、鈣離子載體A23187/佛波 酯（PMA）誘導RBL-2H3 細 胞分泌TNF-α]、抗氧化應激[包括3 個指標：1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除能力、羥自由基清除能力、總抗氧化能力]及解熱（包括3 個指標：LPS 刺激單核細胞THP-1 分泌IL-6 和TNF-α，以及補體活化）這4 類與此功效相關的體外模型中尋找評價其質量的可靠靈敏指標，以綜合評估柴胡解表退熱作用的優劣與強弱。最終選定了量效關系明確、靈敏度高的4 項指標（圖1）：LPS 誘導RAW264.7巨噬細胞生成NO（抗炎）、LPS 刺激THP-1 細胞分泌TNF-α（解熱）、總抗氧化能力及酵母多糖介導的替代途徑補體活化（解熱），并建立了基于柴胡解表退熱功效的生物質控評價體系。

3.2 柴胡樣品生物活性指標評價

7 個柴胡樣品B-1#、B-2#、B-3#、B-4#、N-5#、N-6#、N-7#提取物得率分別為16.58%、11.53%、10.93%、14.56%、10.64%、13.34%、19.72%，用于后續生物活性指標評價。

3.2.1 柴胡提取物對RAW264.7和THP-1細胞活力的影響 分別考察7個柴胡樣品提取物在RAW264.7細胞和THP-1 細胞上的無毒劑量。結果顯示，4 個北柴胡的提取物在質量濃度為1000 μg·mL-1時對RAW264.7 細胞具有明顯的細胞毒性；而3 個南柴胡的提取物在各質量濃度（250、500、1000 μg·mL-1）均對細胞活力無顯著影響（圖2）。在THP-1細胞上，B-1#和B-3#的提取物在質量濃度為1000 μg·mL-1時具有明顯的細胞毒性；其余5 個樣品的提取物在各質量濃度下均對細胞活力無顯著影響（圖3）。隨后的細胞實驗均在不影響細胞活力的劑量下展開。

圖2 不同質量濃度柴胡提取物對RAW264.7細胞活力的影響（±s,n=3）

圖3 不同質量濃度柴胡提取物對THP-1細胞活力的影響（±s,n=3）

3.2.2 柴胡提取物對LPS誘導的RAW264.7細胞分泌NO 的作用 如圖4 所示，7 個樣品均能質量濃度依賴地抑制RAW264.7細胞分泌NO。將各樣品提取物質量濃度換算為對應生藥質量濃度，并繪制NO抑制率-生藥質量濃度曲線（圖5）。在相同抑制率下，曲線越靠右則表明該樣品對NO 的抑制作用越弱，以此判斷7個樣品對NO 分泌的抑制作用強弱并排序：B-1#＞N-5#≈N-6#≈N-7#＞B-3#＞B-2#＞N-4#。

圖4 不同質量濃度柴胡提取物對LPS刺激RAW264.7細胞分泌NO的作用（±s,n=3）

圖5 柴胡提取物的NO抑制率-生藥質量濃度曲線

3.2.3 柴胡提取物對LPS 刺激THP-1 細胞分泌TNF-α的作用 單核細胞被外生致熱原刺激后生成致熱因子如TNF-α、IL-6、IL-1β，致熱因子是感染性發熱的關鍵因素[5]。如圖6 所示，樣品B-1#、B-3#、N-5#、N-6#、N-7#均能質量濃度依賴地抑制LPS 誘導的THP-1 細胞分泌TNF-α；然而，B-2#和B-4#的提取物呈現出相反的作用。將除B-2#和B-4#外的5 個樣品的提取物質量濃度換算為對應生藥質量濃度，并繪制TNF-α抑制率-生藥質量濃度曲線（圖7），根據曲線右移情況判斷5個樣品對TNF-α的抑制作用強弱并排序：N-6#＞N-7#＞B-1#＞N-5#＞B-3#。

圖6 不同質量濃度柴胡提取物對LPS刺激THP-1細胞生成TNF-α的作用（±s,n=3）

圖7 柴胡提取物的TNF-α抑制率-生藥質量濃度曲線

3.2.4 柴胡提取物的總抗氧化能力比較 如圖8 所示，7 個柴胡樣品的總抗氧化能力顯著，且呈質量濃度依賴性。為了便于樣品間作用比較，以Trolox當量表示柴胡樣品的總抗氧化能力[2]，將各提取物質量濃度換算成對應的生藥質量濃度并繪制Trolox 當量-生藥質量濃度曲線（圖9），經計算，樣品B-1#、B-2#、B-3#、B-4#、N-5#、N-6#和N-7#與10 μmol·L-1Trolox 的等效質量濃度分別為0.570 8、1.053 1、1.130 2、0.452 1、0.982 9、1.244 7、0.900 3 mg·mL-1。等效質量濃度越低表明總抗氧化能力越強，以此將7 個樣品的總抗氧化能力強弱排序：B-4#＞B-1#＞N-7#＞N-5#＞B-2#＞B-3#＞N-6#。

圖8 不同質量濃度柴胡提取物的總抗氧化能力（±s,n=3）

3.2.5 柴胡提取物對酵母多糖介導的替代途徑補體活化的作用 補體系統在接觸到病原微生物或其產物時可以通過經典途徑、凝集素途徑和替代途徑迅速激活，補體的活化與感染性發熱密切相關[6-7]，如細菌內毒素即可誘導替代途徑的補體活化而引起或增強發熱[8]。研究結果顯示（圖10），7 個樣品均質量濃度依賴地抑制了該途徑的補體活化。將提取物質量濃度換算為生藥質量濃度并繪制補體活化抑制率-生藥質量濃度曲線（圖11），根據曲線右移情況判斷7 個樣品對替代途徑補體活化的抑制作用強弱并排序：B-1#＞B-2#＞B-4#＞N-6#＞N-7#＞B-3#＞N-5#。

圖10 不同質量濃度柴胡提取物對體外補體活化的作用（±s,n=3）

圖11 柴胡提取物的補體活化抑制率-生藥質量濃度曲線

3.2.6 生物評價得分 根據以上4 項指標在柴胡解表退熱中的貢獻度，并充分考慮臨床用柴胡于表證，多因其擅長解散肌熱（退熱），故賦予了與發熱直接相關的THP-1 細胞生成TNF-α（0.5）及補體活化（0.2）這2 項指標共占比0.7 的權重；而LPS 誘導RAW264.7 巨噬細胞生成NO 與總抗氧化能力這2 項指標的權重分別為0.2 和0.1。隨后，將上述7 個樣品在每項生物指標上的排名轉換為分數，排名最高者計7分，排名第二者計6分，依次遞減。以排名分數與相應的權重的積為該項得分，4 項得分的總和視為該柴胡解表退熱生物活性的量化值。經計算，7個樣品的總分由大到小排序為B-1#＞N-6#＞N-7#＞N-5#＞B-3#＞B-2#＞B-4#（表1）。

表1 柴胡樣品生物評價得分

3.3 柴胡樣品中SSa 和SSd 含量及其與生物評價總分的相關性分析

《中國藥典》2020 年版將SSa 和SSd 的總含量作為北柴胡的質量控制標準（南柴胡由于SSa 和SSd含量低，僅以兩者定性），并且普遍認為皂苷類成分是柴胡的主要活性成分之一[9]。按照《中國藥典》2020 年版方法測定7 個柴胡樣品中SSa 和SSd 含量。如 圖12 所示，SSa 和SSd 的tR分別為21.057、26.987 min。SSa 和SSd 的峰面積-樣品質量濃度標準曲線分別為Y=371 080X+11 733（r=0.998）和Y=338 550X+101 833（r=0.995 0），利用外標法計算得到7 個柴胡樣品中SSa和SSd含量（表2）。其中，4個北柴胡樣品（B-1#～B-4#）中SSa 和SSd 的總質量分數均遠高于《中國藥典》2020 年版規定的限度0.30%，質量分數最高的樣品（B-3#）可達1.110 5%。而3 個南柴胡樣品（N-5#～N-7#）中的SSa和SSd總質量分數均遠低于北柴胡樣品，這與文獻報道南北柴胡皂苷含量差距是一致的[10]。隨后，采用Spearman 相關分析法考察7 個樣品的生物評價得分與其SSa 和SSd 總含量間的相關性（圖13），兩者間r=-0.500 0，P=0.266 7（＞0.05），表明7 個柴胡樣品中SSa 和SSd 的總質量分數與柴胡解表退熱的生物活性量化值之間不具有相關性。

表2 柴胡樣品中SSa和SSd的質量分數（±s,n=3） %

表2 柴胡樣品中SSa和SSd的質量分數（±s,n=3） %

圖12 對照品SSa和SSd及柴胡樣品的HPLC圖

圖13 柴胡樣品的生物活性量化值與SSa和SSd總質量分數的相關性

4 討論

柴胡用于解表時，既能用于風寒表證也能用于風熱表證[11]。表證即外感病邪（外界的各種致病因素）侵入機體淺表部位后出現的一組癥候群，臨床表現主要有惡寒、發熱、鼻塞、噴嚏、流涕、咳嗽、咽喉癢痛、頭痛、肌肉酸痛等。表證治療的對癥措施主要為抗炎（感染性炎癥和過敏性炎癥）和抗病原微生物。在感染性炎癥方面，本研究從3 個指標（LPS誘導的RAW264.7細胞分泌NO、IL-6和TNF-α）中篩選出了靈敏指標，即柴胡對LPS 誘導的RAW264.7細胞生成NO的抑制作用。但在過敏性炎癥上，選用MrgprX2 介導人肥大細胞LAD2 非免疫型脫顆粒模型、IgE/FcεRI介導RBL-2H3脫顆粒模型和A23187/PMA 聯合刺激RBL-2H3 釋放TNF-α模型篩選柴胡的抗過敏指標。然而，柴胡提取物對3 種過敏體外模型均無抑制作用。此外，由于氧化應激和炎癥是高度關聯且相互促進的病理生理過程，抗氧化也早已被納入各種炎癥性疾病的治療策略中[12]，故本研究將抗氧化應激也視作解表的對癥措施之一，并從3個指標（總抗氧化能力、DPPH 自由基清除能力、羥自由基清除能力）中篩選出總抗氧化能力這一靈敏指標?？紤]到包括柴胡在內的多數中藥對感染性疾病的療效并不依賴其抗病原微生物作用[13]而未將此項指標納入。

柴胡的解表功效以退熱為主要特征，柴胡從古至今也一直是臨床治療表證發熱最常用的中藥之一[11]。中醫表證多屬現代醫學的上呼吸道感染，機體免疫細胞受外生致熱原（細菌或病毒）刺激后產生的內生致熱因子（如TNF-α、IL-6、IL-1β）隨血液循環運輸至血腦屏障附近，刺激腦內皮細胞產生中樞致熱介質，后者作用于中樞神經系統而引發體溫升高[5,14]。由此可見，抑制內生致熱因子的分泌是解熱的重要策略。本研究建立了LPS 誘導的THP-1細胞分泌致熱因子（TNF-α和IL-6）細胞模型并發現柴胡能顯著減少細胞TNF-α的生成。此外，補體系統在接觸到病原微生物或其產物（如LPS 或酵母多糖觸發的替代途徑）時幾乎立即被激活，激活過程產生的補體毒素C5a 是神經途徑介導的快速發熱過程的關鍵觸發因素[6]，且C5a還可協同LPS 刺激的單核/巨噬細胞分泌TNF-α等內生致熱原從而放大感染性發熱[15]。本研究結果顯示，柴胡能劑量依賴地抑制酵母多糖介導的替代途徑補體活化。本課題組前期研究在體內實驗中也證實了柴胡水提物溫和的退熱作用與其抑制循環中TNF-α生成及補體活化有關[16]。

獲得以上4 種靈敏指標數據后，本研究按照其在柴胡解表退熱功效上的貢獻度及在外感發熱病理過程中的參與度賦予了不同權重。鑒于柴胡的解表功效以退熱為最大特征，且單核細胞分泌內生致熱原是導致外感發熱的主要因素[6]，本研究將與發熱直接相關的2 項指標賦予了共計0.7 分權重（其中LPS誘導的THP-1 細胞分泌TNF-α的權重系數設為0.5，替代途徑補體活化權重系數設為0.2）；而代表抗炎的LPS 誘導RAW264.7 巨噬細胞生成NO 權重設為0.2，總抗氧化能力權重系數設為0.1。以此評價體系對7 個柴胡樣品（4 個北柴胡，3 個南柴胡）解表退熱作用優劣進行了對比與排序，結果發現，南、北柴胡在不同的生物活性指標上存在較大差異。值得注意的是，3 個南柴胡樣品的SSa 和SSd 總含量均遠低于北柴胡，但其生物活性量化值均僅次于排名第一的陜西北柴胡B-1#；而在3 個南柴胡樣品中，SSa 和SSd 總含質量分數最低的N-6#（0.074 2%）在3 個南柴胡中得分最高。再結合本研究的相關性分析結果表明，《中國藥典》2020 年版中北柴胡的指標性成分SSa 和SSd 總量與解表退熱的生物活性量化值并無相關性，提示SSa 和SSd 可能并非是柴胡解表退熱的物質基礎。此發現也與前期學者的研究結果一致[17]。

中藥成分組成復雜，成分之間還可能存在著交互作用，檢測單個或幾個化學成分難以與整體中藥的臨床功用真正相關。利用生物活性指標（群）來判斷關聯功用中藥質量的方法可能是目前以指標性成分衡量其質量方式的一種有效修正與補充。本研究在篩選與柴胡解表退熱功效相關的生物活性指標方面開展了有益的探索，為科學評價柴胡解表退熱功效及物質基礎的判斷提供了研究的新路徑。

[利益沖突]本文不存在任何利益沖突。