芍藥苷對小鼠放射性腸炎的防治作用

陳美麗,楊 艷,馬亞軍,劉寶瑞,錢曉萍,楊 覓

(1. 南京醫科大學附屬江寧醫院,江蘇 南京 211100;2. 南京大學醫學院附屬鼓樓醫院腫瘤中心暨南京大學臨床腫瘤研究所,江蘇 南京 210008)

放療是目前腫瘤治療的重要手段之一,2020年《全球癌癥統計報告》數據顯示,約70%的惡性腫瘤患者在疾病發展的不同階段需要接受放療[1],包括術前新輔助放療、術后輔助放療、放化療聯合及晚期姑息減癥性放療等。放射性腸炎是腹腔和盆腔腫瘤放療后的常見并發癥,急性放射性腸炎多發生在放療后3個月內,主要表現為腹痛、腹瀉、里急后重、黏液血便等,其中有5%～20%的患者可遷延為慢性放射性腸炎。國際上2018年發布的“ASCRS慢性放射性直腸炎診治指南”是迄今為止第一份放射性腸炎的診治指南[2],我國也根據國內外研究情況和國人特點制定了一份符合中國實際情況的“中國放射性直腸炎診治專家共識”[3],但仍有許多患者治療效果不滿意,甚至還伴隨著一些治療相關不良反應,所以臨床迫切需求尋找有效治療放射性腸炎的方法,以減輕患者癥狀,提高生活質量。芍藥苷是芍藥的重要組成成分,具有抗炎、鎮靜、鎮痛、抗腫瘤、保肝、保護神經、免疫調節等作用,其毒性很低,正常情況下無明顯不良反應,小鼠半數致死量靜脈注射為3 530 mg/kg、腹腔注射為9 530 mg/kg[4-5]。本研究觀察了不同劑量芍藥苷腹腔灌注對小鼠放射性腸炎的防治作用,旨在為芍藥苷防治放射性腸炎提供依據。

1 實驗材料和方法

1.1實驗動物 SPF清潔級C57/B6雌性小鼠60只,體重18～22 g,由揚州大學比較醫學中心提供,實驗動物使用許可證號：SCXK(蘇)2012-0004,分籠飼養于南京大學醫學院附屬鼓樓醫院腫瘤中心SPF級動物實驗室,實驗室保持溫度(20±2)℃,60%相對濕度,自由飲水及標準飼料適應性喂養1周,符合相關動物實驗倫理要求。

1.2主要藥物及器材 水合氯醛(用蒸餾水配成10%溶液,由南京鼓樓醫院動物房提供),芍藥苷(純度≥98%,由南京醫科大學實驗室提供),10%福爾馬林溶液,生理鹽水,南京鼓樓醫院腫瘤中心放療部直線加速器(10 MeV,德國西門子公司),超凈工作臺(蘇州安泰),電子精密天平(奧豪斯儀器常州有限公司),自制的小鼠固定器,眼科剪(蘇州市施強醫療器械有限公司),彎頭鑷(上海醫療器械集團有限公司手術器械廠),包埋機(常州康恩醫療器械有限公司),切片機(常州康恩醫療器械有限公司),蘇木精-伊紅染液(福州飛凈生物科技有限公司)。

1.3實驗方法 隨機將小鼠分為6組,每組10只。各組小鼠禁食12 h(不禁水)后,采用水合氯醛(30 μL/10 g)腹腔注射麻醉,待小鼠肌肉完全松弛后取仰臥位固定于自制的小鼠固定架,正常組小鼠予以假照射,其余組小鼠均予以18 Gy 10 MeV電子線全腹部單次照射,照射范圍為劍突至恥骨聯合,源皮距100 cm,劑量率為260～300 MU/min,照射完畢等待小鼠蘇醒后送返動物房。放療操作過程在經驗豐富的放療科醫生及技師指導下完成。在放療前2 d、放療當天及放療后第1～13天,正常組和放療+生理鹽水組每天腹腔灌注生理鹽水,放療+地塞米松組每天腹腔灌注地塞米松1.25 mg/kg,放療+芍藥苷低劑量組、放療+芍藥苷中劑量組、放療+芍藥苷高劑量組分別每天腹腔灌注芍藥苷30 mg/kg、60 mg/kg、90 mg/kg,灌注量均為0.1 mL/10 g,均1次/d。

1.4觀察指標及方法 放療后每天稱重,觀察小鼠排便(大便顏色、硬度,有無稀便、黏液膿血便)、自主活動(活動/靜止、正常/蜷縮)及毛發(光滑/粗糙)情況。放療后第2天、第4天、第6天、第8天、第14天解剖(解剖前禁食12 h,不禁水)各組小鼠,肉眼觀察腸道大體情況(腹腔與腸道是否光滑無粘連、腸管是否擴張、顏色是否紅潤等),并取病變最明顯處大腸、小腸組織進行HE染色病理觀察。

2 結 果

2.1各組小鼠一般情況 放療前各組小鼠排便正常,精神良好,進食及飲水等均正常。正常組小鼠和放療后放療+芍藥苷高劑量組、放療+芍藥苷中劑量組小鼠排便均正常,肛周皮膚清潔,活動自如,毛發光滑;放療+芍藥苷低劑量組放療后第4天有2只小鼠出現解黃色稀便伴肛周污垢,1只出現行動遲緩,小鼠陸續出現毛發粗糙;放療+生理鹽水組在放療后第3天有5只小鼠出現解黃色稀便伴肛周污垢,第4天有2只小鼠出現行動遲緩,小鼠陸續出現毛發粗糙;放療+地塞米松組在放療后第4天有1只小鼠出現解黃色稀便伴肛周污垢,1只出現行動遲緩,小鼠陸續出現毛發粗糙。

2.2各組小鼠體重 放療前2 d至放療當天, 6組小鼠體重整體呈上升趨勢;放療后,除正常組外,其他組小鼠體重呈不同程度的下降趨勢;放療第14天,正常組、放療+芍藥苷高劑量組、放療+芍藥苷中劑量組、放療+芍藥苷低劑量組、放療+地塞米松組、放療+生理鹽水組小鼠體重分別為(21.49±0.60)g、(19.73±0.60)g、(19.99±0.48)g、(16.83±1.92)g、(16.50±1.83)g、(15.77±2.20)g,各放療組均明顯低于正常組(P均<0.05),放療+芍藥苷高劑量組、放療+芍藥苷中劑量組均明顯高于其他放療組(P均<0.05),放療+芍藥苷高劑量組與放療+芍藥苷中劑量組比較差異無統計學意義(P>0.05),放療+生理鹽水組、放療+地塞米松組、放療+芍藥苷低劑量組間比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見圖1。

圖1 正常組和放療各組小鼠放療前2 d和放療后14 d內體重

2.3各組小鼠病理組織形態 正常組小鼠腸黏膜上皮和固有層腺體完整,腺體輪廓清晰、排列整齊,無明顯炎癥細胞浸潤。放療+芍藥苷高劑量組小鼠在放療后第4天出現腸絨毛局灶脫落,腺體結構完整、排列整齊;第6天腸絨毛損傷嚴重,出現腸絨毛變短,炎癥細胞增多,腺體大小、深度不一,間質水腫;其他時間段損傷較輕。放療+芍藥苷中劑量組小鼠在放療后第4天出現腸絨毛變短及脫落,第6天腸絨毛損傷嚴重,其他時間段損傷較輕。放療+芍藥苷低劑量組、放療+生理鹽水組及放療+地塞米松組均在放療后第2天即開始出現腸絨毛變短及脫落;第4天、第6天、第8天腸絨毛損傷嚴重,腸絨毛大片脫落,固有層腺體結構破壞,大小及顏色深淺不一,出現大量炎癥細胞及間質顏色變淺,有水腫,第14天損傷較輕。見圖2。

圖2 正常組和放療各組小鼠放療后腸黏膜形態(HE染色,×10)

2.4各組小鼠生存情況 正常組及放療后14 d內放療+芍藥苷高劑量組、放療+芍藥苷中劑量組小鼠均存活,總生存率為100%。放療+芍藥苷低劑量組在放療后第4天、第5天、第6天、第7天、第10天各有1,1,1,2,1只小鼠死亡,存活4只,14 d總生存率為40%,中位生存時間為8.5 d。放療+生理鹽水組在放療后第4天、第5天、第6天各有4,3,1只小鼠死亡,存活2只,14 d總生存率為20%,中位生存時間為5 d。放療+地塞米松組在放療后第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第11天各有1,1,3,1,2,1只小鼠死亡,存活1只,14 d總生存率為10%,中位生存時間為5.5 d。生存曲線差異有統計學意義(P均<0.05),見圖3。

圖3 正常組和放療各組小鼠放療后生存曲線

3 討 論

炎癥是組織損傷和細胞死亡的主要原因,炎癥反應在電離輻射損傷中起著重要作用[6]。放射性腸炎是腹盆腔惡性腫瘤經放射治療后引起的腸道放射性損傷,可導致腸黏膜及腸腺細胞的損傷,尤其是小腸,可表現為厭食、嘔吐、腹瀉、脫水、全身感染甚至敗血性休克和死亡[7],不僅嚴重影響腫瘤患者的生活質量,也限制了放療的最大劑量,影響總體治療效果。

目前國內外對于放射性腸炎治療的探索包括藥物治療、手術治療、內鏡下治療等多種方法[8],其中藥物預防或減輕輻射引起的損傷對于提高放療治療效果至關重要[9-10]。藥物治療包括抗炎藥、抗氧化劑、硫酸鋁、類固醇及其他類[11],我國專家共識1A類推薦洛哌丁胺治療放射性腸炎的腹瀉癥狀、類固醇激素灌腸治療出血性腸炎,柳氮磺胺吡啶、巴柳氮、抗生素(甲硝唑、環丙沙星)、益生菌、生長抑素、短鏈脂肪酸灌腸等則作為1B類推薦藥物[3]。但部分藥物治療效果有限,治標不治本,停藥后癥狀可反復,因此尋找新的治療方向迫在眉睫。

芍藥苷對于炎癥疾病的治療具有很大潛力,其抗炎作用已經在各種炎性疾病的體外及動物體內實驗中得到驗證[12]。Ke等[13]報道芍藥苷可以通過下調miR-29a、抑制NLRP3炎癥小體通路激活緩解以腹瀉為主的腸易激綜合征小鼠的炎癥反應,重建腸上皮屏障。Zhang等[14]發現芍藥苷可以減輕葡聚糖硫酸鈉誘導的結腸炎的嚴重程度。Gu等[15]研究表明芍藥苷可以通過抑制絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)/核因子-κB (NF-κB)信號通路和細胞凋亡對三硝基苯磺酸(TNBS)誘導的潰瘍性結腸炎發揮保護作用。據此推測芍藥苷對放射性腸炎也具有一定的治療作用。

對于放射性腸炎動物模型放療方式及劑量的選擇,各個實驗也存在差異。李宜放等[16]發現,大鼠在接受盆腔局部20 Gy照射后一般情況及直腸病理組織學變化與人類放射性直腸炎的表現相一致。王中秋等[17]采用瓦里安600CD直線加速器單次6 MV X射線10 Gy照射誘導小鼠放射性腸炎,照射后第2天小鼠開始逐漸出現腹瀉或稀便,精神萎靡、懶動、體重減輕等,病理上表現為腸黏膜不完整,腸絨毛變短,隱窩和腺體正常結構消失,部分病灶表面上皮結構被破壞,可見明顯的炎細胞浸潤。本研究根據既往文獻并結合前期預實驗,選擇18 Gy作為單次照射劑量,選取全腹部為照射部位,非照射部位用鉛板遮住,模擬了臨床放射性腸炎形成過程。

本研究發現,放療+芍藥苷高劑量組及放療+芍藥苷中劑量組小鼠在放療后均未出現明顯的消化道反應,小鼠精神及活動尚可,體重波動小;而放療+生理鹽水組小鼠在放療后3 d即有半數小鼠出現解稀便及行動遲緩,且放療+芍藥苷低劑量組、放療+生理鹽水組、放療+地塞米松組小鼠在放療后體重下降明顯,可能與進食少及腸道吸收障礙有關;腸組織HE染色顯示,放療+芍藥苷低劑量組、放療+生理鹽水組、放療+地塞米松組小鼠在放療后較短時間內(2 d)即開始出現腸黏膜的損傷,而高劑量及中劑量芍藥苷干預可以延長腸道組織損傷時限,減輕損傷程度,且未見明顯治療相關不良反應。表明較高劑量的芍藥苷可以改善放療后小鼠的一般狀況,減輕消化道反應,保護腸道黏膜組織,緩解放射性腸炎導致的體重降低,且濃度越高效果越好。生存曲線分析顯示,放療+芍藥苷低劑量組、放療+生理鹽水組、放療+地塞米松組小鼠放療后中位生存時間為8.5 d、5 d、5.5 d,而放療+芍藥苷高劑量組和及放療+芍藥苷中劑量組小鼠放療后14 d內均存活,表明腹腔灌注芍藥苷可以降低放射性腸炎小鼠病死率,且濃度越高效果越佳。

綜上所述,18 Gy 10 MeV電子線全腹部單次照射可成功構建小鼠放射性腸炎模型;較高劑量芍藥苷腹腔灌注可以保護放射性腸炎小鼠腸黏膜,緩解消化道反應和體重下降,提高小鼠生存率,且安全。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。