基于系統生物學和分子對接探討益腎固胎顆粒治療復發性流產的作用機制

錢艷平,陳 茁,詹興秀,牛紅萍,萬茜茜,姜麗娟

(1. 云南省中醫醫院/云南中醫藥大學第一附屬醫院,云南 昆明 650021;2. 云南中醫藥大學,云南 昆明 650500)

根據最新的歐洲人類生殖與胚胎學會指南規定,與同一性伴侶發生連續2次或2次以上妊娠24周前的胎兒丟失,定義為復發性流產(recurrent spontaneous abortion,RSA)[1],中醫稱其為“滑胎”。RSA是一種嚴重的妊娠生殖障礙,其致病因素錯綜復雜,目前已知的病因主要與染色體、內分泌代謝、子宮解剖異常及感染、易栓癥、全身性疾病、環境心理等因素有關,但仍有高達50%的病因未明確[2]?；谥嗅t“腎為先天之本,藏精,主生長、發育與生殖。沖任之本在腎,胞絡系于腎”的理論,認為腎氣盛實,則任通沖盛,胎自安固,腎虛是導致滑胎的基本病機。RSA作為婦產科一種常見的妊娠并發癥,是全世界關注的疑難雜癥之一,發病率占生育期女性的1%～5%[3],而且隨著流產次數的增加,RSA的復發風險也逐漸上升[4]。目前,西醫針對RSA的治療尚無確切有效的治療方法,主要采用孕酮類藥物、抗凝及免疫進行預防性治療,在臨床取得一定的療效,但存在免疫排斥、感染、出血等風險[1,5]。中醫治療滑胎采用辨證與辨病相結合,以補腎健脾、調理沖任、鞏固胎元為原則,在整體性的基礎上強調治療的個體化,臨床收效顯著,且對胎兒生長發育無不良影響[6]。但中醫復方作用機制復雜,故需要借助系統生物學多維度預測“藥物-靶點-疾病”之間的網絡機制。

系統生物學主要研究基因調控網路、細胞信號傳導、生物系統組成之間相互關系的結構和系統功能,體現系統論和實驗計算方法整合研究的特征。網絡藥理學作為一種新興藥物的研究方法,通過系統生物學理論和方法,從整體網絡角度分析藥物有效成分與疾病之間的復雜關系及其相互作用機制[7]。益腎固胎顆粒(Yi Kidney Fertility Granules,YKFG)是云南中醫藥大學第一附屬醫院院內制劑,由菟絲子、黃芪、桑寄生、杜仲、川續斷、淫羊藿、黨參、白術、茯苓、阿膠和甘草組成。方中菟絲子、白術補腎健脾為君藥;川續斷、杜仲、淫羊藿、桑寄生溫陽補腎,黃芪、黨參、茯苓助白術健脾益氣,共為臣藥;佐阿膠以止血補血、滋陰養血;甘草調和諸藥為使藥。前期臨床研究證實益腎固胎顆?？擅黠@緩解脾腎兩虛型滑胎患者的臨床癥狀,改善血清雌二醇(E2)、孕酮(P)、β人絨毛膜促性腺激素(β-HCG)水平,提高妊娠成功率,且未見明顯不良反應及毒副作用[8]。關于益腎固胎顆粒的院內制劑研發,其急性毒性實驗已由云南中醫藥大學第一附屬醫院中心實驗室萬春平博士完成,實驗結果顯示本品短期服用比較安全。益腎固胎顆粒多用于治療先兆流產、復發性流產的患者,臨床療效顯著。其所含有效成分及治療靶點較多,無法明確具體的治療靶標及作用機制。本研究基于系統生物學理論和方法,通過網絡藥理學數據分析及分子對接技術探討益腎固胎顆粒治療RSA的分子機制,為進一步的實驗研究提供理論基礎及科學依據,使傳統中醫藥的臨床經驗研究向循證醫學研究轉變。

1 資料與方法

1.1益腎固胎顆?；钚猿煞趾桶悬c的收集與篩選利用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺TCMSP(https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)和BATMAN-TCM數據庫檢索益腎固胎顆粒(菟絲子、黃芪、桑寄生、杜仲、川續斷、淫羊藿、黨參、白術、茯苓、阿膠、甘草)的主要活性成分。設置口服生物利用度(OB)≥30%,類藥性(DL)≥0.18,以此為過濾條件作進一步篩選。根據藥物有效成分的摩爾數,在相關靶標中搜索與藥物有效成分對應的靶蛋白名稱。BATMAN-TCM根據分數截止值為20,預測的候選目標(包括已知的目標)其得分不小于20,多次測試校正后設置P值的截止值(調整后的P值)小于0.05。將篩選到的活性成分通過Pub Chem數據庫進行SMILES晶體結構查詢,將不能查詢到晶體結構的活性成分進行剔除。將獲取靶點導入Uniprot數據庫 (http：//www．uniprot．org/),設置基因來源為人源性,轉換官方基因名,去除重復基因和數據庫中未經驗證的基因即為各個成分的潛在靶點。

1.2RSA靶點的預測 以GeneCards數據庫(https：//www.genecards.org/)、OMIM數據庫(https：//www.omim.org/)為平臺,“Recurrent spontaneous abortion”為關鍵詞進行搜索,取交集并刪除重復靶點,獲取RSA靶標。通過Draw Venn Diagram網站(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)在線分析,繪制藥物-疾病靶點的韋恩圖,獲得其交集靶點。

1.3藥物-活性成分-疾病-靶點網絡(D-A-T網絡)的構建 利用Cytoscape 3.8.2軟件繪制藥物-活性成分-疾病-靶點網絡(D-A-T網絡)。在此基礎上,利用其內置工具網絡分析儀計算益腎固胎顆粒的活性成分和靶點的網絡拓撲參數,根據度值選擇主要活性成分,構建D-A-T網絡圖以探究益腎固胎顆粒的藥理學作用機制。

1.4基因本體論(GO)富集與京都基因和基因組百科全書(KEGG)通路分析 通過DAVID(https：//david. ncifcrf. gov/)網站,借助“Functional Annotation Tool”對交集靶點進行GO富集分析,包括生物過程、細胞成分和分子功能3個模塊的分析。以P<0.05和FDR<0.05為標準篩選,根據涉及靶點數目排序,選取前10位;同時對交集靶點進行KEGG通路分析,以P<0.01為篩選標準,根據KEGG通路分析結果及P值大小排序,選取前20位,分別建立通路與對應靶點之間的相互作用關系和節點屬性與對應靶點之間的相互作用關系,并導入Cytoscape 3.7.2軟件中,構建益腎固胎顆粒治療RSA的“通路-靶點”關系網絡圖。

1.5益腎固胎顆粒蛋白相互作用網絡關系構建(PPI網絡構建)及關鍵基因篩選 為進一步說明靶點蛋白在系統水平上的作用,通過使用“多蛋白”作為數據分析模式,所需置信度(綜合得分)>0.9作為閾值,通過STRING數據庫(http：//www.string-db.org/)對共有靶點進行PPI分析,并將數據以tsv文件格式保存后,得到PPI網絡圖。將數據結果導入到Cytoscape 3.8.2中,使用CytoHubba插件獲得益腎固胎顆粒的核心基因,按度值排序后,取前10名作為核心靶點。最后在PubMed中檢索關鍵靶點作用于RSA的藥理作用。

1.6分子對接驗證 從TCMSP數據庫下載D-A-T網絡圖中度數最高的20種活性成分及PPI網絡中度數值最高的10種核心靶標的MOL2格式文件,從蛋白質數據庫(http：//www.rcsb.org/pdb)獲得關鍵蛋白的3D結構。運用AutoDockTools 1.5.6和PyMOL軟件對關鍵靶點蛋白進行去除水分子,分離配體和受體,加入極性氫,計算Gasteiger電荷,分配AD4類型,將小分子配體柔性鍵設置為可旋轉等操作。對接過程使用AutoDock Vina執行,最后將結合能最低的模型運用PyMOL軟件進行可視化。

2 結 果

2.1益腎固胎顆粒有效成分篩選及靶點預測 通過TCMSP和BATMAN-TCM數據庫檢索,并查閱已發表的相關文獻進行補充,最終收集到益腎固胎顆粒所包含的11味中藥,共有161個有效活性成分,其中川續斷11個,白術7個,阿膠3個,黨參21個,杜仲15個,茯苓15個,甘草33個,黃芪20個,桑寄生2個,菟絲子10個,淫羊藿23個。剔除重復及非人類靶標基因后,Uniprot校正為官方名稱,最終獲得1 101個活性成分靶點。

2.2RSA靶點預測結果 利用Genecards數據庫和OMIM數據庫,以“Recurrent spontaneous abortion”為關鍵詞進行搜索,分別獲得了2 069個和90個RSA相關基因,合并所得疾病靶點,去除重復值后,最終得到2 146個疾病靶點。將1 101個藥物靶點和2 146個疾病靶點通過Draw Venn Diagram網站在線分析,獲得346個交集靶點,并繪制韋恩圖(見圖1)。

圖1 益腎固胎顆粒與復發性流產相互作用靶點的韋恩圖

2.3藥物-活性成分-疾病-靶點網絡(D-A-T網絡)的構建 分別將益腎固胎顆粒的161個活性成分和346個藥物-疾病共同靶點導入Cytoscape3.8.2軟件,構建D-A-T網絡圖(見圖2)。該網絡包括11個藥物節點、1個疾病節點、125個活性成分節點和346個靶蛋白節點。從網絡分析儀中一共獲得483個節點,2 323條邊,平均度值為17.39。根據度值(見表1)篩選了前20個活性成分,它們可能是益腎固胎顆粒治療RSA的核心成分(注：20種活性成分未找到相應的靶點,11種活性成分是某些中藥常見的,因此網絡圖中僅顯示了125種活性成分)。

表1 益腎固胎顆粒的主要活性成分

橙色節點是藥物,藍色節點是活性成分,綠色節點是交叉靶點;TSZ為菟絲子,HQ為黃芪,SJS為桑寄生,DZ為杜仲,CXD為續斷,YYH為淫羊藿,DS為黨參,BZ為白術,FL為茯苓,EJ為阿膠,GC為甘草

A. 生物過程直方圖;B. 細胞成分直方圖;C. 分子功能直方圖;D. KEGG信號通路富集直方圖

A. PPI網絡;B. 關鍵靶蛋白網絡的相互作用;C. 核心靶標條形圖

2.4GO功能富集分析和KEGG通路富集分析 利用DAVID數據庫進行常見靶點的GO富集分析,包括生物過程、細胞組成和分子功能等3個模塊的分析,以P<0.05和FDR<0.05為篩選條件,分別獲得207個分子功能(Molecular Function,MF)、3 380個生物過程(Biological Process,BP)和153個細胞組成(Cellular Component,CC)。根據P值分別選擇每個亞型中的前10個生物過程,并在圖3的GO基因富集條中列出(圖3A、圖3B、圖3C)。條形圖的長度表示生物過程中目標位置的富集水平,條形圖的顏色表示其調整后的P值,P值越小顏色越紅。結果表明,益腎固胎顆粒治療RSA的主要靶點的生物學過程主要集中在外部刺激、有機物含氧化合物等方面;細胞組成過程主要集中在細胞表面、膜微區、膜筏、膜區、神經元投射等;分子功能主要在受體結合、蛋白質二聚化活性、酶結合、信號轉導等方面。

KEGG通路富集分析進一步解釋了益腎固胎顆粒治療RSA的潛在機制,通過DAVID數據庫對346個共同靶基因進行KEGG富集分析,得到186條信號通路。設置P<0.01為篩選標準,根據P值大小進行排序,篩選出糖尿病并發癥中的糖化終末產物及其受體信號通路(AGE-RAGE)、人巨細胞病毒感染(HCMV)、PI3K-Akt信號通路、癌癥中的蛋白聚糖、TNF信號通路、MAPK信號通路、IL-17信號通路等前20個主要信號通路。這些通路可能是益腎固胎顆粒治療RSA的關鍵途徑(圖3D)。

2.5PPI網絡分析和核心靶基因篩選 利用STRING數據庫,以“多蛋白”為數據分析模式,以置信度>0.9為閾值,將346個藥物-疾病共同靶點導入Cytoscape3.8.2,并利用其中Cytohubba插件分析交集網絡中各個節點的屬性值,繪制PPI網絡圖(圖4A)。按照Degree值進行篩選,取排名前10的靶點作為核心靶點,分別為酪氨酸蛋白激酶c(SRC)、雌激素受體基因1(ESR1)、1號染色體的原癌基因(JUN)、絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、骨肉瘤癌基因(FOS)、細胞腫瘤抗原(TP53)、上皮細胞生長因子受體(EGFR)、人β-連環蛋白(CTNNB1)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AKT1)、絲裂原活化蛋白激酶8(MAPK8),并繪制條形圖(圖4C),其中水平坐標是Degree值,垂直坐標是每個蛋白基因符號的縮寫。表明益腎固胎顆?？赡芡ㄟ^這些蛋白對RSA發揮治療作用。

Degree值表示連接該節點的條數,節點代表潛在作用靶點,邊代表靶點之間存在的相互作用關系。

節點的大小和顏色代表靶點的度值,節點越大、顏色越深,表明靶點在網絡體系中的度值越大,參與的生物功能越多,其生物重要性越強;連線越多,說明關聯度越大,代表的生物學意義越大。

2.6分子對接 將上述列表中的活性成分分子對接至核心靶點SRC(PDBID：1A09)、ESR1(PDBID：1A52)、JUN(PDBIB：1JNM)、MAPK1(PDBIM：1TVO)、FOS(PDBII：1S9K)、TP53(PDBID：1JSP)、EGFR(PDBIT：1XKK)、CTNNB1(PDBID=2Z6H)、AKT1(PDBID：1UNQ)、MAPK8(PDBID：3ELJ),并計算核心化合物與核心靶點之間的結合能以預測其結合活性。低于0的結合能表明這兩個分子可以自發結合,結合能的負值越高表明結合活性越強。分子對接結果表明,核心組分和核心靶標大多能夠良好結合(見表2)。此外,核心組分MOL0005002和核心靶標ESR1的結合能為-7.31 kcal/mol,這是對接結果中最小的結果,表明益腎固胎顆?？赡芡ㄟ^ESR1發揮對RSA的治療作用。核心靶標和核心組分的對接結合能是使用PyMOL證明它們之間相互作用的最低模型。依據自由結合能的大小,選取部分對接結果進行可視化,利用PyMOL軟件繪圖(見圖5)。由圖可見,β-谷甾醇能穩定地對接到PIK3CA蛋白結構6GVF的活性口袋中,二者通過氨基酸殘基LYS-271發生氫鍵作用;山柰酚能穩定地對接到AKT1蛋白結構1UNQ的活性口袋中,二者通過氨基酸殘基AGR-48和ASN-54發生氫鍵作用;槲皮素能穩定地對接到MAPK1蛋白結構2Y9Q的活性口袋中,二者通過氨基酸殘基GLU-33和LYS-114發生氫鍵作用。因此認為山柰酚、槲皮素、β-谷甾醇等是益腎固胎顆粒中重要的潛在活性化合物。

表2 核心活性成分和核心靶標的分子對接結果

圖5 分子對接模式圖

3 討 論

益腎固胎顆粒是姜麗娟教授治療滑胎的臨床常用方,該方由壽胎丸和四君子湯加減化裁而來。壽胎丸是中醫安胎基礎方,四君子湯為健脾益氣常用方,兩方合用辨證治療滑胎,具有補腎固沖、健脾安胎的作用。藥理研究證明：壽胎丸安胎機制主要為緩解平滑肌痙攣,抑制子宮收縮,提高孕期雌孕激素水平,改善盆腔內環境,調節神經體液內分泌功能,具有雌激素樣作用,可促進胚胎發育[9]。白術醇對未孕子宮自發性收縮及對催產素引起的子宮興奮均呈顯著抑制作用[10]。研究表明,黃芪、黨參、茯苓具有增強免疫、改善血流動力學、促進紅細胞及血紅蛋白生成等作用[11];阿膠具有耐缺氧、增強免疫、促進止血等作用[12]。上述諸藥合用可達補腎健脾安胎之效,使胎系能固。

中藥復方治療疾病作用機制復雜,但關于中醫藥的疾病作用機制研究主要集中在單一的靶點或信號通路,且對中藥有效成分的互作關系不明確,難以體現中醫治病的整體性和系統性。本研究基于系統生物學理論和方法,通過網絡藥理學和分子對接技術,對益腎固胎顆粒治療RSA的機制做系統探討。對益腎固胎顆粒所含的11味中藥的有效成分進行篩選,得到與RSA相關的2146個疾病靶點,1 101個藥物靶點。通過數據分析顯示主要有效成分是槲皮素(Quercetin)、山柰酚(Kaempferol)、木犀草素(luteolin)、異鼠李素(isorhamnetin)、β-谷甾醇(β-sitosterol)等,大都屬于黃酮類化合物。槲皮素共存于黃芪、菟絲子、桑寄生、淫羊藿中,可通過JAK2/STAT3通路促進先兆流產大鼠卵巢、子宮合重增加,臟器系數升高,降低流產率及胚胎吸收率[13];降低LPS誘導的模型小鼠早產發生率,并通過NF-κB/AP-1通路增加后代存活率[14]。淫羊藿、黃芪、菟絲子、杜仲四味中藥均含有山柰酚,通過體外細胞實驗發現山柰酚可顯著抑制苯并芘(BaP)引起的人絨毛膜外滋養層細胞HTR8/SVneo的凋亡率[15];還能改變衰老卵母細胞中的氧化應激、過氧化物酶體、TNF信號傳導、cAMP信號傳導和間隙連接途徑,改善老化卵母細胞的不良妊娠結局[16]。此外,木犀草素可促進正常懷孕大鼠子宮動脈等血管平滑肌的松弛,對先兆子癇具有保護作用[17]。異鼠李素可抑制炎癥相關因子及通路發揮抗炎作用[18];Liu等[19]研究發現,母體血清Th1細胞因子與血清植物甾醇水平呈正相關,植物甾醇(特別是β-谷甾醇)可通過誘導孕婦的Th1分泌來調節Th1/Th2平衡?？梢娨婺I固胎顆粒主要通過槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、木犀草素、異鼠李素等成分作用于RSA患者,體現作用機制的多靶點和多途徑等特點。

對本研究篩選所得的346個交集靶點通過PPI網絡分析以及生物過程GO分析,發現益腎固胎顆粒治療復發性流產的主要核心靶點是SRC、ESR1、JUN、MAPK1、FOS、TP53、EGFR、CTNNB1、AKT1和MAPK8。根據分子對接結果顯示,槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、木犀草素、異鼠李素與這些核心靶點親和力好,為網絡藥理學研究益腎固胎顆粒治療RSA提供了可靠保證。研究證明,通過HIF-1α/SRC/LDHA通路,可促使滋養層來源的乳酸(LA)在蛻膜巨噬細胞介導的復發性流產中起至關重要的作用[20];對已婚夫婦的檢查揭示ESR1基因的多態性變異A-351G與特發性不孕癥(遺傳的對數加性模型)和早期胚胎丟失(過度顯性遺傳模型)的風險增加密切相關[21];此外,MAPK1的磷酸化水平在先兆子癇胎盤中顯著降低[22];VEGFA、NOS1和CTNNB1失調引起子宮血管高通透性可誘發子宮血管微環境中的自噬缺陷,導致先兆子癇的發生[23];自然流產的蛻膜組織中EGFR-1表達較高,表明EGFR-1可促進絨毛外滋養層的破壞性入侵[24];TP53可促進胎盤滋養層細胞凋亡,誘發流產[25]。這些說明SRC、ESR1、MAPK1、EGFR、CTNNB1、MAPK8 TP53等靶點與流產等妊娠相關疾病有關。

KEGG通路富集分析顯示,益腎固胎顆粒對RSA的治療主要通過AGE-RAGE、PI3K-Akt、TNF、MAPK、IL-17等信號通路發揮作用。研究結果證實,調控AGEs-RAGE信號通路可對妊娠糖尿病大鼠胎兒發育起保護作用[26];PCOS小鼠的胚胎丟失率可通過激活AMPK/PI3K/Akt/FoxO3a信號通路,改善滋養層凋亡來預防[27];在妊娠早期監測IL-17A,可作為流產風險評估的生物標志物[28];在不明原因復發性流產(URSA)患者的絨毛中,RASA1基因啟動子中H3K27me3的富集減少,RASA1基因異常激活,RASA1基因的異常激活可導致Ras-MAPK通路的異常失活,進而抑制滋養層細胞的增殖和侵襲能力,可見RASA1-Ras-MAPK調節軸的異常與URSA的發展密切相關[29];若TNF-α失調導致免疫調節失衡,將引起Th1/Th2細胞平衡紊亂,擾亂母胎界面,導致復發性流產[30]。

本研究從網絡藥理學及分子對接層面對益腎固胎顆粒進行系統探究,進一步闡明其治療RSA的潛在作用機制。結果表明益腎固胎顆粒主要通過槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、木犀草素、異鼠李素等多種有效成分作用于SRC、ESR1、JUN、MAPK1、FOS、TP53、EGFR、CTNNB1、AKT1和MAPK8等基因靶點,調控AGE-RAGE信號通路、HCMV、PI3K-Akt信號通路、癌癥中的蛋白聚糖、TNF信號通路、MAPK信號通路、IL-17信號通路等20個信號通路發揮治療RSA的作用?？梢?益腎固胎顆粒主要從母胎免疫界面、炎癥反應、胎盤滋養層細胞代謝、宮腔內環境等方面治療RSA。為進一步深入研究奠定基礎,為臨床治療RSA的組方用藥提供一定的參考價值。結合本研究數據,查閱大量文獻后發現,中醫復方治療疾病作用機制復雜,藥味的加減即可對全方的中藥活性成分及作用靶點產生巨大影響。這也提示我們在科研設計及臨床觀察研究中,中藥組方的固定對于確切的分子機制研究至關重要。此外,本研究過程未涉及益腎固胎顆粒的劑量配比、服藥劑型及煎煮方法等,故仍待進一步的動物實驗或細胞實驗研究來驗證。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。