發酵白芥子穴位敷貼對支氣管哮喘大鼠氣道炎癥和Th17/Treg免疫失衡的影響

張 晴,穆金霞,屈玉明,2,郝重耀,3,張天生,3,肖楷楠

(1.山西中醫藥大學第二臨床學院,山西 晉中 030619;2. 山西衛生健康職業學院,山西 晉中 030619;3. 山西省針灸醫院,山西 太原 030006;4. 北京中醫藥大學針灸推拿學院,北京 100105)

支氣管哮喘是一種常見的慢性氣道炎癥性疾病,流行病學調查結果顯示,2015年我國20歲以上的支氣管哮喘患者可能達到了4 570萬人,患者人數眾多,但控制效果卻不容樂觀[1]。研究認為氣道免疫-炎癥機制是支氣管哮喘重要的發病機制之一,其中輔助性T細胞17(Th17)/調節性 T 細胞(Treg) 免疫平衡在支氣管哮喘的發生、發展及預后中都占據著舉足輕重的地位,初始 CD4+T細胞分化出Th17和Treg,Th17產生炎癥細胞因子白細胞介素-17(IL-17)、白細胞介素-22(IL-22)等,它們募集中性粒細胞等炎性細胞,促進疾病部位炎癥的發生發展,而調節性細胞產生抗炎細胞因子白細胞介素-10(IL-10)和白細胞介素-35(IL-35)等,可抑制多種免疫細胞的活性,從而抑制免疫反應[2]。中醫藥在幾千年歷史發展中積累了豐富的防治支氣管哮喘的經驗,穴位敷貼是公認的行之有效的療法之一,但敷貼用藥中白芥子的皮膚刺激性在臨床使用中會帶給患者一定的心理負擔。本課題組利用現代微生物轉化技術將白芥子進行發酵,觀察了發酵白芥子穴位敷貼對支氣管哮喘大鼠氣道炎癥及 Th17/Treg免疫失衡的影響,旨在為穴位敷貼劑型的改進提供參考。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 SPF 級8周齡 SD 大鼠48只,雌雄各半,體重190～230 g,購自北京昌揚西山養殖場,實驗動物許可證號：SCXK(京)2022-0002,飼養于山西中醫藥大學實驗動物中心,室溫控制在18～25 ℃,12 h /12 h 明暗交替,適應性飼養7 d,期間給予自由飲水、進食。本實驗涉及的所有動物研究有關材料及取材經山西中醫藥大學醫學倫理委員會審查(倫理審核號：AWE202309384)。

1.2藥物與試劑 生白芥子(亳州市金方千草藥業有限公司,貨號：156658452)粉碎過 80目篩備用,發酵白芥子由山西省針灸醫院灸療科提供,生白芥子和發酵白芥子均以生姜汁調制成質量為0.3 g的藥丸備用。地塞米松磷酸鈉(上海澤葉生物科技有限公司,貨號：ZY69049SD),卵清白蛋白(OVA,美國 Sigma 公司,貨號： A5253),氫氧化鋁[Al(OH)3,上海麥克林生化科技股份有限公司,貨號：A800852];IL-22、IL-35、IL-10、IL-17 ELISA 試劑盒(WKSUBIO,批號均為20230715);HRP-羊抗兔、HRP-羊抗小鼠(BOSTER,貨號分別為BA1054、BA1050);4%多聚甲醛、PBS緩沖液(BOSTER,貨號分別為AR1068、AR0030);乙醇、二甲苯、切片石蠟(上海國藥,貨號分別為100092680,100234186,9019461)。

1.3主要儀器 402AI超聲霧化器(蘇州魚躍醫療科技有限公司);SH01D型高速離心機(上海知信實驗儀器技術有限公司);DT5-2型低速離心機(北京時代北利離心機有限公司);Histocore BIOCUT型切片機(leica);JT-12型脫水機、JB-L5型包埋機(武漢俊杰電子有限公司);DYY-7C型電泳儀(北京六一儀器廠);VE-180型電泳槽、VE-60型微型垂直槽多板灌膠器、VE-186型轉移電泳槽(上海天能科技有限公司);SCIENTZ-24型組織勻漿器、SCIENTZ-1500F型超聲破碎儀(寧波新芝生物科技有限公司)。

1.4實驗方法 適應性喂養結束后,將 48只大鼠按照隨機數字表分為空白組、模型組、地塞米松組、發酵組、非發酵組以及假貼組。參照文獻[3]方法,于實驗開始的第 1天和第 8天,給予空白組大鼠腹腔注射 1 mL生理鹽水,其余組大鼠腹腔注射 1 mL [含OVA 100 mg、Al(OH)3200 mg]的混合液致敏。從實驗第15天開始,將大鼠放入透明密閉霧化箱,空白組大鼠給予生理鹽水霧化吸入,其余組大鼠給予5% OVA溶液霧化吸入,1 次/d,40 min/次,連續10 d。造模期間注意觀察各組大鼠的精神狀態,注射致敏階段大鼠精神狀態萎靡、活動減少、弓背蜷縮、飲水進食減少,霧化激發階段大鼠躁動不安、抓耳撓腮、舔抓皮毛、打噴嚏繼而俯伏于角落,呼吸頻率加快,嚴重者可出現點頭呼吸、顯著性哮鳴音和發紺等哮喘行為視為造模成功。末次霧化結束后,按照《實驗針灸學》[4]取穴方法對發酵組、非發酵組、假貼組大鼠的大椎、膻中、肺俞(雙側)、脾俞(雙側)、腎俞(雙側)穴位處進行脫毛。實驗第25天開始,將提前調和好的藥丸制作成直徑約1 cm、厚度約3 mm的藥餅,并用醫用膠布固定于發酵組、非發酵組大鼠穴位處,假貼組以同樣方法敷貼凡士林,每次貼敷 5 h,1 次/d,共10次;地塞米松組大鼠給予地塞米松腹腔注射,1 mg/kg,1 次/d,共 10次;空白組和模型組大鼠不做任何干預。每次干預結束1 h后,空白組大鼠給予生理鹽水霧化吸入,其余組大鼠給予 5% OVA 溶液霧化吸入,1次/d,40 min/次,直至干預結束。

1.5觀察指標及方法

1.5.1哮喘行為學評分 于末次霧化激發開始的10 min 內觀察各組大鼠哮喘行為學并計分,其中無抓鼻或撓癢動作記為0分,抓鼻或撓癢1～3次記為1分,4～6次記為2分,7次及以上記為3分;沒有哮喘癥狀為0分,輕微哮喘發作癥狀記為3分,有呼吸急促、呼吸頻率加快或焦躁不安等癥狀記為6分,嚴重呼吸困難記為9分[5]。

1.5.2肺組織病理學形態 末次干預結束之后的24 h之內,麻醉大鼠,取右肺上葉組織,用4%多聚甲醛固定24 h后,將組織進行脫水,采用石蠟包埋機包埋,切片,進行蘇木素-伊紅染色(HE),將切片置于顯微鏡下觀察肺組織病理形態學。

1.5.3血清和肺泡灌洗液中炎性細胞因子水平 末次干預結束之后的24 h之內,麻醉大鼠,取腹主動脈血,于4 ℃條件下靜置4 h后,低速離心機3 600 r/min離心15 min,取上清液,-20 ℃冰箱冷凍保存待檢。取血結束后,使用無菌棉線結扎右肺支氣管,行氣管切開,插入氣管套管,抽取5 mL預冷的PBS緩沖液對大鼠左肺進行肺泡灌洗,輕輕按摩10次后,反復抽吸3次回收肺泡灌洗液,將回收的肺泡灌洗液置于低速離心機3 000 r/min 離心 10 min,去除顆粒和聚合物,取上清液。嚴格遵照 ELISA 試劑盒操作步驟檢測血清和肺泡灌洗液中IL-17、IL-22、IL-10、IL-35水平。

1.5.4肺組織中炎癥因子蛋白表達情況 取0.2 g大鼠右肺組織樣本,切碎,取適量溶解并混勻后的RIPA裂解液,使用前加入酶抑制劑,在每100 mg右肺組織樣本內加入1 mL的RIPA裂解液,后將組織充分研磨勻漿,于4 ℃的條件下裂解30～60 min,將裂解后的組織置于超聲破碎儀上破碎,用高速離心機10 000 r/min離心10 min,取上清液。提取總蛋白并利用BCA試劑盒測定總蛋白濃度,于100 ℃水中煮5 min,使蛋白變性后,置于冰上使其驟冷,提取為實驗使用的蛋白樣本,置于-20 ℃冰箱中冷凍保存。使用蒸餾水清洗干凈灌膠玻璃板,豎直放置使其自然晾干。分別使用分離膠、5%濃縮膠處理后,將凝膠置于電泳槽進行電泳,電泳結束后將蛋白轉移到預先準備的NC膜上,制備轉膜 “三明治”,在電轉儀中轉膜結束后,搖床洗膜,封閉液封閉1～2 h倒掉封閉液,加入稀釋的相應抗體。在搖床上4 ℃過夜,TBS-T洗膜3次,每次10 min,加入二抗。二抗孵育結束后,于搖床上用TBST洗膜5～10 min×3次。加ECL工作液于印跡膜上30～60 s,吸干發光液,置印跡膜于成像分析儀自動成像,軟件ImageJ分析蛋白條帶灰度值。

2 結 果

2.1各組大鼠哮喘行為學評分比較 模型組和假貼組大鼠哮喘行為學評分均明顯高于空白組(P均<0.05);地塞米松組、發酵組、非發酵組大鼠哮喘行為學評分均明顯低于模型組和假貼組(P均<0.05),地塞米松組、發酵組、非發酵組間比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見圖1。

圖1 空白組和支氣管哮喘各組大鼠哮喘行為學評分

2.2各組大鼠肺組織HE染色表現 空白組大鼠支氣管黏膜上皮細胞排列整齊,肺泡、肺泡間隔形態正常,未見炎性細胞浸潤或僅有散在少量炎性細胞分布;模型組和假貼組大鼠支氣管黏膜上皮細胞明顯脫落,氣道壁受損,支氣管腔明顯狹窄,黏膜下層可見明顯炎性細胞浸潤及水腫,肺泡內炎性細胞浸潤明顯,肺泡間隔形態明顯增厚;地塞米松組、發酵組、非發酵組大鼠支氣管上皮較完整,偶見上皮細胞散在脫落,支氣管黏膜下層偶見炎性細胞浸潤,肺間質輕微增生。見圖 2。

圖2 空白組和支氣管哮喘各組大鼠肺組織HE染色表現

2.3各組大鼠血清和肺泡灌洗液中IL-17、IL-22、IL-10、IL-35水平比較 與空白組比較,模型組和假貼組血清和肺泡灌洗液中IL-17、IL-22水平均明顯升高(P均<0.05),IL -10、IL-35水平均明顯降低(P均<0.05);與模型組和假貼組比較,地塞米松組、發酵組、非發酵組血清和肺泡灌洗液中IL-17、IL-22 水平均明顯降低(P均<0.05),IL-10、IL-35 水平均明顯升高(P均<0.05);地塞米松組、發酵組、非發酵組間各指標比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見表1和表2。

表1 空白組和支氣管哮喘各組大鼠血清炎癥因子水平比較

表2 空白組和支氣管哮喘各組大鼠肺泡灌洗液中炎癥因子水平比較

2.4各組大鼠肺組織中IL-17、IL-22、IL-10、IL-35蛋白表達情況比較 與空白組比較,模型組和假貼組肺組織中IL-17、IL-22 蛋白相對表達量均明顯升高(P均<0.05),IL-10、IL-35 蛋白相對表達量均明顯降低(P均<0.05);與模型組和假貼組比較,地塞米松組、發酵組、非發酵組肺組織中IL-17、IL-22 蛋白相對表達量均明顯降低(P均<0.05),IL-10、IL-35 蛋白相對表達量均明顯升高(P均<0.05);地塞米松組、發酵組、非發酵組間各指標比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見表3及圖3。

表3 空白組和支氣管哮喘各組大鼠肺組織中IL-17、IL-22、IL-10、IL-35蛋白相對表達量比較

圖3 空白組和支氣管哮喘各組大鼠肺組織中IL-17、IL-22、IL-10、IL-35蛋白表達電泳圖

3 討 論

支氣管哮喘主要特征有氣道炎癥、氣道高反應性和氣道重塑,患者主要癥狀為咳嗽、喘息、氣短、胸悶和不同程度的支氣管阻塞等,在全世界范圍內支氣管哮喘的患病人數超過了2.6億人[6-7]。目前研究認為Th17/Treg免疫平衡機制在支氣管哮喘的發生發展過程中起著至關重要的作用,患者存在Th17/Treg免疫失衡,通常表現為有促炎作用的Th17細胞產生過量,而有抑制炎癥作用的Treg細胞產生減少或功能減弱[8]。Treg和Th17是由CD4+T細胞分化出來的兩種具有拮抗作用的T細胞亞群,其中Th17表達的IL-17、IL-22細胞因子是 T 細胞誘導炎癥反應的早期啟動因子和許多自身免疫疾病中的關鍵炎癥介質,它可以誘導炎癥細胞募集到疾病感染部位[9]。研究表明,中度至重度支氣管哮喘的發病與Th17細胞及其產生的炎癥細胞因子密切相關,主要表現為Th17活化產生IL-17,IL-17通過直接產生趨化因子CXCL8或間接通過促進結構細胞釋放趨化因子CXCL8、CXCL1和CXCL5來協調中性粒細胞向肺組織募集,產生氣道炎癥反應,同時IL-17可以誘導氣道平滑肌和成纖維細胞增殖以加快氣道重塑的進程,另外IL-17和淋巴細胞分泌的IL-22可以增加嗜酸粒細胞的招募,從而促進變態反應的產生[10]。Treg細胞的主要功效為抑制效應T細胞的活化和增殖,保持自身免疫耐受和機體抗炎能力,其中 IL-10 是Treg細胞產生的功能最強大的抑炎因子,它可以抑制促炎細胞因子的合成和釋放,抑制過敏性炎癥時嗜酸性粒細胞的存活、遷移和炎性細胞的生成與聚集,并且可以恢復上皮層的完整性,促進組織愈合;Treg細胞分泌的IL-35可以在一定程度上抑制Th17細胞的增殖分化,增強Treg細胞的免疫抑制功能,從而抑制機體的過度免疫反應[11-13]。故糾正Th17/Treg的免疫失衡對抑制哮喘發作,促進疾病緩解非常重要。多項研究表明,使用單味中藥、中藥復方、中成藥、針刺、艾灸和穴位敷貼等中醫療法可以有效減輕哮喘大鼠或小鼠肺組織炎性細胞浸潤狀態,糾正Th17/Treg免疫失衡,控制或減少支氣管哮喘發作[14-16]。

穴位敷貼是在中醫經絡理論的基礎之上,將特制的藥物貼敷于疾病治療所需的穴位,藥物通過穴位的表皮傳達進入經絡,從而調節經絡的氣血,達到祛除臟腑病邪,引導疾病向愈的特殊中醫外治法。穴位敷貼治療哮喘的記錄,最早可以追溯到清代張璐所著的《張氏醫通》中的“白芥子涂法治療冷哮”。本實驗采用OVA和Al(OH)3混合液致敏制備支氣管哮喘模型,結果模型組和假貼組大鼠在末次激發的10 min之內出現哮喘癥狀,病理觀察顯示支氣管周圍出現大量的炎性細胞浸潤、水腫,血清和肺泡灌洗液中IL-17、IL-22水平及肺組織中IL-17、IL-22蛋白表達量明顯升高,血清和肺泡灌洗液中IL-10、IL-35水平及肺組織中IL-10、IL-35蛋白表達量明顯降低,表明哮喘大鼠存在顯著的氣道炎癥反應和Th17/Treg免疫失衡。發酵白芥子和非發酵白芥子穴位敷貼干預結束后,哮喘大鼠的哮喘行為學評分均明顯降低,肺組織炎癥反應明顯減輕,血清、肺泡灌洗液及肺組織中IL-17、IL-22、IL-10、IL-35表達情況均較模型組明顯改善,說明發酵白芥子穴位敷貼能明顯改善支氣管哮喘大鼠哮喘發作癥狀,減輕肺組織炎癥改變,糾正Th17/Treg免疫失衡,其效果與非發酵白芥子相當。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。