基于STAT3信號通路研究檸檬苦素對胃癌模型小鼠免疫因子表達的影響

劉雪 石柳 林曄 張靜智 溫建軍

(贛州市人民醫院消化內科,江西 贛州 341000)

胃癌早期無明顯癥狀,隨病情進展逐漸出現消化不良等胃部不適癥狀,晚期出現疼痛、嘔吐,甚至嘔血、黑便、腹部腫塊、上腹壓痛、脾腫大和黃疸及遠處淋巴結轉移、盆腔轉移等體征〔1,2〕。大部分胃癌患者確診時已到晚期〔3〕,常采用手術治療,但對于晚期患者而言,術后易出現復發和轉移,并且預后不佳,所以必須輔以藥物治療〔4～6〕?，F階段臨床所使用的化療藥物副作用較大,患者不宜耐受,所以尋找毒副作用小且效果好的藥物成為重中之重〔7〕。檸檬苦素具有抗腫瘤、昆蟲拒食、抗病毒、鎮痛、抗炎、催眠等多種生物活性〔8～10〕。有研究顯示〔11〕,檸檬苦素能抑制多種癌癥細胞系生長。且研究還指出〔12〕,檸檬苦素抑制癌細胞可能與阻斷信號轉導與轉錄激活因子(STAT)3通路激活有關。本研究旨在分析檸檬苦素對胃癌小鼠模型免疫因子表達的影響,并初步探索其作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 實驗用細胞為MFC小鼠胃癌細胞,購自攸碧艾(上海)貿易有限公司,貨號U30042。SPF級小鼠購自武漢賽維爾生物科技有限公司,貨號GA1003,動物生產許可證號為SCXK(滬)2019-0002。鼠齡6～8 w,平均體質量(23±3)g,采用籠養方式飼養,標準光照,飼料喂養,自由攝食,室溫20～25 ℃,相對濕度45%～55%。適應性喂養1 w后進行實驗。檸檬苦素(購自成都植標化純生物技術有限公司,PCS0683,純度95%)、環磷酰胺片(天津金世制藥有限公司,18121001,規格50 mg)。

1.2細胞培養 MFC胃癌細胞解凍,加入含10%胎牛血清的DMEM 培養基,1 500 r/min離心5 min,棄上清,沉淀,重懸,37 ℃、5%CO2孵育箱培養、傳代。

1.3分組、造模、給藥 50只SPF級小鼠隨機分為模型組、陽性對照組及檸檬苦素低、中、高劑量組,每組10只。MFC胃癌細胞調整至1.5×106/ml。取0.2 ml細胞懸液接種于小鼠的右側腋下,當瘤塊直徑達到0.5 cm時,表明造模成功〔13〕。模型組給予0.5%羧甲基纖維素鈉灌胃,陽性對照組給予環磷酰胺25 mg/kg灌胃,檸檬苦素低、中、高劑量組給予檸檬苦素12.5、25.0、50.0 mg/kg灌胃,灌胃體積均為20 ml/kg,1次/d,持續14 d。

1.4計算脾指數、胸腺指數及抑瘤率 末次給藥后第2天,頸椎脫臼法處死小鼠,解剖其脾臟、胸腺及腫瘤組織,稱重,計算脾指數、胸腺指數及抑瘤率。

1.5測定CD4+、CD8+T淋巴細胞百分數和CD4+/CD8+比值 取小鼠脾臟,加入適量磷酸鹽緩沖液(PBS),輕攆磨碎,用200目篩網過濾,取混懸液用1 500 r/min離心5 min,適量PBS重懸細胞,制備脾淋巴細胞懸液,調整細胞密度為1×106/ml。取0.1 ml脾淋巴細胞懸液置于1.5 ml離心管,加CD4+、CD8+抗體(稀釋度為1∶1 000),混勻,低溫靜置30 min;加PBS 1 ml,離心,棄上清;沉淀,加PBS 0.5 ml,后進行檢測。

1.6檢測白細胞介素(IL)-2、IL-10、干擾素(IFN)-γ的表達水平 摘眼球法取血,離心取血清,用酶標儀于450 nm處檢測IL-2、IL-10、IFN-γ水平。

1.7檢測胃癌組織中磷酸化(p)-STAT3、基質金屬蛋白酶(MMP)-9的陽性表達率 末次給藥后第2天,頸椎脫臼法處死小鼠,取部分胃癌組織,用 4%多聚甲醛固定進行組織石蠟包埋,對石蠟包埋標本的5 μm切片進行免疫組織化學染色,并用p-STAT3和MMP-9抗體進行染色,顯微鏡拍照。200倍顯微鏡下觀察到胞核內有棕色顆粒者即為陽性細胞,每個樣本隨機選取10個視野,通過Image J軟件進行細胞計數,計算陽性表達率。

1.8檢測胃癌細胞中STAT3磷酸化水平 末次給藥后第2天處死小鼠前,提取各組小鼠胃癌細胞,胰酶處理各組小鼠胃癌細胞,預冷PBS洗3遍,加預冷裂解緩沖液(RIPA)裂解細胞,靜待30 min,離心15 min,取上清,進行二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量。 5×還原型上樣緩沖液稀釋混勻,沸水煮10 min,凝膠電泳,將蛋白轉運到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,5%牛血清白蛋白(BSA)封閉1 h,加一抗稀釋液4 ℃過夜,二抗室溫孵育1～2 h,檢測第705位點酪氨酸的磷酸化的STAT3蛋白(pTyr705-STAT3)、STAT3的表達,β-actin為內參。

1.9統計學方法 采用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1脾指數、胸腺指數及抑瘤率 與模型組相比,陽性對照組脾指數、胸腺指數顯著降低(P<0.05),檸檬苦素低、中、高劑量組脾指數、胸腺指數顯著升高(P<0.05);與模型組相比,陽性對照組及檸檬苦素低、中、高劑量組抑瘤率均顯著增加(P<0.05),見表1。

2.2CD4+、CD8+T細胞及其比值 與模型組相比,陽性對照組CD4+、CD8+T細胞及其比值顯著下降(P<0.05);檸檬苦素低、中、高劑量組CD4+、CD8+T細胞及其比值顯著上升(P<0.05),且組間兩兩比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.3IL-2、IL-10、IFN-γ的陽性表達水平 與模型組相比,陽性對照組IL-2、IL-10水平顯著下降,IFN-γ顯著上升(P<0.05);而檸檬苦素低、中、高劑量組IL-2、IFN-γ水平顯著增加,IL-10顯著降低(P<0.05),且組間兩兩比較差異有統計學意義(P<0.05),見表1。

表1 各組脾指數、胸腺指數、抑瘤率、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、IL-2、IL-10、IFN-γ比較

2.4各組胃癌組織中p-STAT3、MMP-9陽性表達率 與模型組相比,陽性對照組及檸檬苦素低、中、高劑量組p-STAT3、MMP-9的陽性表達率均顯著下降(P<0.05),且檸檬苦素各劑量組兩兩比較差異有統計學意義(P<0.05),見表2、圖1。

圖1 各組胃癌組織中p-STAT3、MMP-9的陽性表達(免疫組織化學染色,×200)

2.5各組胃癌細胞中STAT3磷酸化水平 與模型組相比,陽性對照組及檸檬苦素低、中、高劑量組pTyr705-STAT3/STAT3水平均顯著降低(P<0.05),且檸檬苦素各劑量組兩兩比較差異有統計學意義(P<0.05),見表2、圖2。

表2 各組胃癌組織中p-STAT3、MMP-9的陽性表達率及STAT3磷酸化水平比較

1～5:模型組、陽性對照組、檸檬苦素低、中、高劑量組

3 討 論

本研究中取MFC胃癌細胞懸液接種于小鼠的右側腋下來構建胃癌小鼠模型,觀察腫瘤直徑,達0.5 cm時證實模型構建成功。對于動物而言,脾臟及胸腺是關鍵的免疫器官,本實驗中常通過檢測小鼠的脾指數及胸腺指數來判斷實驗小鼠的免疫器官功能是否發育良好、免疫細胞的狀態是否正常及免疫狀態是否穩定平衡〔14〕,因此,研究結果表明,檸檬苦素可以改善胃癌小鼠的免疫狀態,提高免疫力,并且對胃癌還具有較好的抑制作用,呈現劑量依賴性,提示其可用于胃癌的治療。環磷酰胺治療腫瘤細胞的療效較好但不良反應大、毒副作用強〔15〕,因此其在臨床的使用受到了限制,本研究結果提示,檸檬苦素毒副作用小,具有較高的應用價值。

CD4+、CD8+T細胞與腫瘤免疫相關,癌癥患者接受治療后免疫功能得到改善,趨于平衡,體內CD4+、CD8+T細胞及其比值較治療前升高〔16〕。本文提示,檸檬苦素對T淋巴細胞亞群具有調節性作用,其中陽性對照組所用環磷酰胺為免疫抑制劑類藥物,會使CD4+、CD8+T淋巴細胞及其比值下降。IL-2是免疫因子,可以提高動物機體細胞免疫和體液免疫能力〔17〕,癌癥患者常伴有細胞免疫功能損害,其標志性變化為IL-2表達下降。IL-10是免疫抑制因子,抑制免疫應答,參與腫瘤細胞周期調控、免疫逃逸、遷移等過程,與腫瘤的惡性程度和不良預后相關,在多種癌癥患者體內呈現高表達〔18〕。IFN-γ與抗腫瘤免疫也有聯系,其能夠激活細胞免疫,殺傷腫瘤細胞〔19〕。本研究結果提示,檸檬苦素可調節免疫因子水平從而達到抑制腫瘤生長的作用。

STAT3是與癌細胞增殖和轉移相關的致癌轉錄因子,MMP-9為STAT3下游靶基因,與為胃癌細胞的轉移密切相關〔20〕。本研究通過免疫組化染色發現,檸檬苦素低、中、高劑量組中STAT3信號通路關鍵因子STAT3磷酸化水平及MMP-9陽性表達率均下降,降低了p-STAT3、MMP-9水平,抑制其激活,減弱了STAT3信號通路表達,抑制了癌癥的發展。方明等〔21〕研究也提到STAT3、MMP-9的活化與乳腺癌的浸潤和轉移密切相關,與本文關于其與胃癌的研究相類似,提示檸檬苦素對于胃癌的治療具有潛在價值。

綜上,檸檬苦素能抑制胃癌小鼠模型腫瘤組織的發展,這與其提高小鼠免疫水平與抑制STAT3通路激活密切相關,為胃癌的臨床治療提供了新思路,但本文也有一定的局限性,一方面,本研究結論基于動物實驗得出,是否適用于人體還需進一步實驗佐證;另一方面,本研究僅基于STAT3信號通路進行研究,是否有其他信號通路參與尚不清楚,也需進一步實驗證實。