銀杏總黃酮對血管性癡呆大鼠神經元損傷的影響及作用機制

張棽 饒佳濤 王超越 李宏治

(湖北恩施學院 1教務處,湖北 恩施 445000;2醫學部;3恩施州中心醫院麻醉科)

血管性癡呆是威脅老年人健康并引發癡呆的主要原因之一〔1〕。缺血性腦卒中是引發血管性癡呆的常見病因,神經炎癥反應、神經元自噬參與調控血管性癡呆的發生與發展〔2〕。相關研究顯示,抑制神經炎癥反應、增強神經元自噬作用能夠改善血管性癡呆所致的認知障礙〔3〕。銀杏是我國傳統中藥材,總黃酮是其主要活性成分〔4〕。相關研究顯示,山楂總黃酮能夠降低腦缺血大鼠炎性因子表達和神經細胞凋亡,保護神經系統功能〔5〕;但關于銀杏總黃酮對神經細胞和神經系統影響的研究仍十分少見。本研究旨在探討銀杏總黃酮對血管性癡呆大鼠神經元損傷的影響及作用機制。

1 材料與方法

1.1動物與主要試劑 健康雄性SD大鼠,平均體質量(300±10)g,購于湖北省實驗動物研究中心,許可證號:SCXK(鄂)2015-0018。飼養溫度(24±1)℃,自由進食、進水,每日12 h光照。銀杏總黃酮購于武漢普世達生物科技有限公司,貨號20210605,質量分數≥98%。腦組織乙酰膽堿、5-羥色胺檢測試劑盒購于武漢艾美捷科技有限公司;血清白細胞介素(IL)-1β、IL-17、IL-6檢測試劑盒購于武漢賽培生物科技有限公司;鼠抗人Beclin1單克隆抗體,鼠抗人微管相關蛋白1輕鏈(LC)3單克隆抗體,鼠抗人PINK誘導激酶(PINK)1單克隆抗體,鼠抗人帕金蛋白(Parkin)單克隆抗體,鼠抗人β-actin單克隆抗體及二抗均購于武漢菲恩生物科技有限公司。

1.2血管性癡呆大鼠動物模型建立與分組 大鼠禁食、自由飲水12 h,麻醉后分離雙側頸總動脈并結扎。造模7 d后進行穿梭箱實驗進行篩選,與正常大鼠相比步入潛伏期明顯降低,暗室中花費的總時間明顯升高提示血管性癡呆大鼠模型造模成功。隨機分為模型組、50、100、200 mg/kg銀杏總黃酮組,每組12只;另取12只大鼠為假手術組(僅分離雙側頸總動脈、不結扎)。各銀杏總黃酮組灌胃給予相應劑量銀杏總黃酮,另外兩組給予等體積生理鹽水,連續21 d。

1.3穿梭箱實驗檢測大鼠學習記憶能力 將各組大鼠放入照明狀態腔室中,引導大鼠自由穿梭2個空腔室約10 min,當大鼠再次進入黑暗腔室時進行電擊刺激(0.5 mA),至大鼠逃離到不通電的照明狀態腔室中為止,記錄大鼠進入黑暗腔室所需的時間(步入潛伏期)和暗室中花費的總時間。

1.4組織收集與處理 穿梭箱實驗結束后麻醉大鼠,采集各組頸動脈血1.2 ml,3 000 r/min離心10 min,收集血清,-80 ℃保存。之后斷頭處死大鼠,取部分大腦組織加入RIPA裂解液,使用便攜式組織勻漿機勻漿,12 000 r/min 4 ℃恒溫離心20 min,收集上清,-80 ℃保存。另取部分大腦組織,常規石蠟包埋,切片后放于光學顯微鏡下觀察,收集含有典型海馬結構的腦組織切片,用于自噬相關蛋白和PINK1、Parkin蛋白表達檢測。

1.5大鼠腦組織乙酰膽堿、5-羥色胺水平和血清炎癥因子水平檢測 取各組大鼠腦組織蛋白樣品在冰水浴中解凍,吸取約0.2 ml腦組織蛋白樣品,酶聯免疫吸附試驗測定腦組織乙酰膽堿、5-羥色胺濃度。取各組大鼠血清樣品在冰水浴中解凍,吸取約0.3 ml血清,酶聯免疫吸附試驗測定血清IL-1β、IL-17、IL-6濃度。

1.6Western印跡檢測大鼠海馬組織中自噬相關蛋白和PINK1/Parkin信號通路蛋白表達 取各組含有典型海馬組織結構的切片,脫蠟、水化后RIPA細胞裂解液提取總蛋白,二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度,行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),電轉法將目標蛋白轉膜,使用含5%脫脂牛奶的TBST緩沖液封閉1 h,滴加鼠抗人Beclin1單克隆抗體(稀釋倍數1∶1 000),鼠抗人LC3單克隆抗體(稀釋倍數1∶800),兔抗人PINK1單克隆抗體(稀釋倍數1∶500),兔抗人Parkin單克隆抗體(稀釋倍數1∶1 000),鼠抗人β-actin單克隆抗體(稀釋倍數1∶2 000),4 ℃孵培育過夜,次日滴加羊抗鼠IgG、羊抗兔IgG,稀釋倍數1∶4 000,室溫下1 h,電化學發光法(ECL)顯影,使用ImageJ軟件讀取各條帶灰度值。

1.7統計學分析 采用SPSS25.0統計學軟件進行方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1各組海馬組織自噬相關蛋白表達水平比較 模型組海馬組織Beclin1蛋白、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白與假手術組相比升高,但差異無統計學意義(P>0.05);不同濃度銀杏總黃酮組明顯高于模型組和假手術組(P<0.05);隨著銀杏總黃酮濃度的增加自噬相關蛋白Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ表達水平明顯提升(P<0.05)。見圖1,表1。

2.2各組學習記憶能力比較 模型組步入潛伏期明顯低于假手術組,暗室中花費總時間明顯長于假手術組(P<0.01);與模型組相比,不同濃度銀杏總黃酮組步入潛伏期明顯升高,暗室中花費總時間明顯降低(P<0.05),隨著銀杏總黃酮濃度的增加上述改變逐漸明顯(P<0.05)。見表1。

2.3各組海馬組織PINK1、Parkin蛋白表達水平比較 模型組海馬組織PINK1、Parkin蛋白與假手術組相比升高,但差異無統計學意義(P>0.05);不同濃度銀杏總黃酮組明顯高于模型組和假手術組(P<0.05);隨著銀杏總黃酮濃度的增加PINK1、Parkin蛋白表達水平明顯提升(P<0.05)。見圖1,表1。

1～5:假手術組、模型組、50、100、200 mg/kg銀杏總黃酮組

表1 各組學習記憶能力及海馬組織自噬相關蛋白、PINK1、Parkin蛋白表達水平比較

2.4各組腦組織乙酰膽堿、5-羥色胺水平比較 模型組腦組織乙酰膽堿、5-羥色胺水平明顯低于假手術組(P<0.01);與模型組相比,不同濃度銀杏總黃酮組明顯升高(P<0.01),隨著銀杏總黃酮濃度的增加腦組織乙酰膽堿、5-羥色胺水平明顯升高(P<0.01)。見表2。

2.5各組血清IL-1β、IL-17、IL-6水平比較 模型組血清IL-1β、IL-17、IL-6水平明顯高于假手術組(P<0.01);與模型組相比,不同濃度銀杏總黃酮組明顯降低(P<0.01),隨著銀杏總黃酮濃度的增加血清IL-1β、IL-17、IL-6水平明顯降低(P<0.01)。見表2。

表2 各組腦組織乙酰膽堿、5-羥色胺、IL-1β、IL-17、IL-6水平比較

3 討 論

隨著我國人口老齡化進程的發展,血管性癡呆患病率呈逐年上升趨勢,生活自理能力明顯下降,增加了家庭和社會的經濟、醫療負擔〔6〕。本實驗結果提示,大鼠學習記憶受損,出現認知障礙,血管性癡呆大鼠模型造模成功;銀杏總黃酮能夠改善血管性癡呆大鼠的學習記憶能力,減輕認知障礙程度。血清炎性因子升高所致的神經炎癥反應擴大會加重海馬神經元損傷,降低5-羥色胺、乙酰膽堿水平,導致學習記憶能力減退〔7〕。

腦灌注不足所致的異常炎癥反應是血管性癡呆的主要病理基礎〔8〕,自噬作用也參與其中,加強自噬作用能夠保護神經元,是血管性癡呆治療的主要手段〔9〕。銀杏是我國傳統中藥材,具有活血化瘀、活血通絡等功效〔10〕。研究發現,錦雞兒總黃酮是其主要活性成分,能夠減輕腦缺血再灌注損傷〔11〕。本研究結果提示,模型組大鼠神經元自噬代償性升高幅度難以對抗神經元損傷,導致血管性癡呆的發生;另外,提示銀杏總黃酮可通過提高自噬相關蛋白表達來加強神經元自噬,減輕海馬神經元損傷,達到改善血管性癡呆大鼠學習記憶能力的目的。

PINK1/Parkin信號通路參與調控阿爾茨海默病的病理過程,其中PINK1、Parkin表達上調能夠增強神經元的自噬代償能力,加速清除受損線粒體,保護神經細胞免受氧化應激損傷〔12〕。PINK1表達上調還能夠激活神經元自噬信號,減輕神經元損傷,進而發揮對阿爾茨海默病的治療作用〔13〕。本研究結果提示,銀杏總黃酮可通過激活PINK1/Parkin信號通路,提高自噬作用,減輕神經元損傷,最終達到改善血管性癡呆癥狀的作用。