miR-340-5p靶向調控ARID1A對甲狀腺癌活性、遷移和侵襲的影響

段飛 陳羿 查官金 段訓凰

(九江市第一人民醫院 1耳鼻咽喉頭頸外科,江西 九江 332600;2腫瘤科)

甲狀腺癌是一種主要起源于濾泡上皮細胞的常見內分泌癌〔1〕。分為乳頭狀甲狀腺癌(PTC)、濾泡狀甲狀腺癌(FTC)、低分化甲狀腺癌(PDTC)和間變性甲狀腺癌(ATC)。其中PTC和FTC占甲狀腺癌病例的95%〔2〕。近十年來,甲狀腺癌的發病率呈現增長趨勢,這得益于醫療診斷技術的優化〔3〕。目前手術切除是大多數甲狀腺癌患者的標準治療方法。然而,晚期甲狀腺癌患者的較差生存率表明仍然缺乏有效的治療策略〔4〕。特別是低分化或是晚期甲狀腺癌患者常出現淋巴轉移,需要進行淋巴清掃和放射性碘治療〔5〕。因此,探究甲狀腺癌轉移相關的具體分子機制,對于甲狀腺癌轉移患者靶向治療的研究具有一定的意義。

MicroRNA(miRNA)是一類進化上保守的小非編碼RNA,它們通過與其互補的靶mRNA結合在生物學的許多方面發揮關鍵作用〔6〕。目前,miRNA已成為癌癥新治療策略的有吸引力的工具和靶標〔7〕。越來越多的研究已證實,miRNA失調是許多癌癥發展的原因之一〔8〕。miR-340-5p是一種基因內miRNA,位于宿主基因RNF130的內含子區域、染色體5q35.313上。miR-340-5p在哺乳動物中表達模式與宿主基因相似〔9〕。越來越多的證據表明,miR-340-5p與多種癌發展相關。胃癌細胞中miR-340-5p的水平顯著高于正常胃黏膜細胞。敲降miR-340-5p通過上調細胞因子信號轉導抑制因子(SOCS)3表達以抑制Janus激酶(JAK)-信號轉導子和轉錄激活子(STAT)3信號通路從而減弱胃癌細胞的細胞增殖并阻止細胞周期〔10〕。在甲狀腺癌的研究中發現,miR-340-5p通過抑制骨形態發生蛋白(BMP)4在體外和體內促進甲狀腺癌的生長〔11〕。然而,目前關于miR-340-5p在甲狀腺癌轉移中的機制尚不清楚。轉換/蔗糖不發酵(SWI/SNF)復合物對染色質調節和基因表達至關重要,其在約20%人類癌癥中的中發生突變或表達差異〔12〕。ARID亞基家族被認為通過募集ATPase催化模塊來增強SWI/SNF復合物活性,其中ARID1A是SWI/SNF亞基最常發生突變的基因〔13〕。在ARID1A缺乏的情況下,增強子活性控制的缺陷會損害發育程序并導致基因表達廣泛失調,從而驅動腫瘤形成〔14〕。研究顯示,小鼠BRAFV600E突變腫瘤中ARID1A的甲狀腺特異性缺失會促進疾病進展和降低存活率〔15〕。并且研究發現,ARID1A mRNA表達與甲狀腺癌分化惡性程度呈負相關〔16〕。miR-340-5p是否通過調控ARID1A影響甲狀腺癌的發展有待進一步證實。本研究在甲狀腺細胞BCPAP中通過分子生物學技術,探討miR-340-5p靶向調控ARID1A對BCPAP細胞的活性、遷移和侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1細胞培養 人類甲狀腺上皮胞系(HTori-3)和人類甲狀腺乳頭狀癌細胞系(IHH4、TPC-1、BCPAP、KTC-1)購自ATCC(美國)。非腫瘤來源的細胞系HTori-3在RPMI1640培養基中培養,癌細胞系在DMEM培養基中培養。兩種培養基均添加10%胎牛血清和雙抗。細胞培養放置在37 ℃的5% CO2的培養箱中。

1.2細胞活性檢測 噻唑藍(MTT)法測定不同處理后的甲狀腺癌細胞活性。處理后0、24、48 h,用MTT(5 mg/ml)處理細胞4 h。然后使用二甲基亞砜溶解所得的甲臜晶體及使用酶標儀(ELX800)測量570 nm 處吸光度(OD)值。

1.3實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)使用Trizol試劑從甲狀腺癌細胞中提取總RNA。使用PrimeScriptTMRT試劑盒將1 μg RNA逆轉錄為cDNA。RT-qPCR使用 SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒進行。熱循環條件如下:95 ℃ 30 s預變性,95 ℃ 10 s變性,60 ℃ 30 s退火,65 ℃ 30 s延伸,40個循環。GAPDH用作內源性對照。同樣,miRNA被逆轉錄。使用TaqMan microRNA檢測試劑盒檢測miRNA表達。U6用作內源性對照。通過2-ΔΔCt方法計算表達倍數。引物序列:miR-340-5p正向:5′-AACTGTTTGCAGAGGAAACTGA-3′,反向:5′-TCTTGGGGTTATTGGTCAGC-3′;ARID1A正向:5′-AAAAGCTGACCCCTTTAGCC-3′,反向:5′-GCTCCGGTGTTTTCTTCATC-3′;U6正向:5′-CTCGCTTCGG-CAGCACA-3′,反向:5′-AACGCTTCACGAATTTGCG-T-3′;GAPDH正向:5′-TCACCAGGGCTGCTTTTAAC-3′,反向:5′-TGACGGTGCCATGGAATTTG-3′。

1.4Western印跡 使用RIPA緩沖液從處理和未處理的甲狀腺癌細胞中提取總蛋白。使用二喹啉甲酸(BCA)定量試劑盒進行定量后,在10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠中分離30 μg蛋白質并轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。將膜在室溫下用5%脫脂牛奶封閉1 h,然后在4 ℃下與一抗孵育過夜。使用的一抗如下:anti-ARID1A(1∶1 000;ab70816;Abcam)和anti-GAPDH(1∶2 000;ab9485;Abcam)。第2天,在室溫下用0.1%TBST洗滌3次后,將辣根過氧化物酶(HRP)綴合的山羊抗兔 IgG(1∶2 000;ab6721;Abcam)在室溫下孵育2 h。用0.1%TBST洗滌3次后,將印跡與電化學發光(ECL)試劑在室溫下孵育3 min,并在成像系統上曝光。使用ImageJ軟件評估和計算蛋白質密度值。

1.5細胞轉染和雙熒光素酶報告基因檢測 甲狀腺癌細胞用miR-340-5p抑制物購自上海生工生物公司,編碼ARID1A特異性shRNA(sh-ARID1A)、相應的陰性對照(sh-NC)進行慢病毒包裝。使用Lipofectamine2000試劑轉染至細胞中。3′-UTR ARID1A基因位于1號染色體上,miR-340-5p的結合位點位于chr1:27108172-27108178。然后,在PCR擴增結合位點處的ARID1A 3′-UTR區域,使用點突變試劑盒對其進行點突變處理。將其與psiCHECK-2熒光素酶報告質粒連接得到野生型質粒(WT-ARID1A)和突變型質粒(MUT-ARID1A)。將細胞接種在24孔板上(1×105/孔)并在5% CO2中37 ℃培養。第2天,使用Lipofectamine2000試劑將細胞與miR-340-5p模擬物、miR-340-5p抑制物、WT-ARID1A、MUT-ARID1A或其對照質粒共轉染。轉染48 h后,通過Dual-Luciferase Reporter Assay 試劑盒檢測熒光素酶活性。

1.6細胞遷移和侵襲 Transwell 板插入的上室有(侵襲)或者沒有(遷移)涂有基質膠。在處理后24 h將在無血清培養基中適當處理的細胞(5×104)加入上室,同時將含有10%胎牛血清(FBS)的培養基加入下室。在37 ℃下孵育48 h后,使用棉簽小心去除留在上室中的細胞,同時使用4%多聚甲醛在室溫下將剩余的細胞染色10 min,并在6個隨機區域中的侵入細胞使用光學顯微鏡對每個樣品的視圖進行計數。

1.7統計學分析 采用GraphPad Prism8.0軟件進行方差分析、Tukey事后檢驗。

2 結 果

2.1甲狀腺癌細胞中miR-340-5p和ARID1A表達 與HTori-3細胞比較,miR-340-5p在IHH4、TPC-1、BCPAP、KTC-1細胞中明顯高表達,ARID1A mRNA及蛋白在IHH4、TPC-1、BCPAP、KTC-1細胞中明顯低表達(P<0.05)。見表1、圖1。其中BCPAP細胞系差異最為顯著,因此選其作為后續研究的細胞系。

表1 不同甲狀腺癌相關細胞中miR-340-5p和ARID1A mRNA及蛋白表達比較

1～10:HTori-3、IHH4、TPC-1、BCPAP、KTC-1、對照組、抑制物對照+sh-RNA對照組、miR-340-5p抑制物組、sh-ARID1A組、miR-340-5p抑制物+sh-ARID1A組

2.2敲降miR-340-5p減少甲狀腺癌細胞的活性、遷移和侵襲 通過轉染抑制物對照和miR-340-5p抑制物檢測miR-340-5p表達結果發現,與對照組相比,抑制物對照對miR-340-5p表達沒有明顯影響(P>0.05),miR-340-5p抑制物明顯降低了BCPAP細胞中miR-340-5p表達水平(P<0.05)。MTT檢測顯示,與對照組相比,抑制物對照對細胞活性沒有影響(P>0.05),miR-340-5p抑制物使BCPAP細胞48 h活性明顯降低(P<0.05)。與對照組相比,抑制物對照對細胞遷移和侵襲沒有明顯影響(P>0.05),miR-340-5p抑制物使BCPAP細胞遷移和侵襲個數明顯減少(P<0.05)。見表2、圖2。證明miR-340-5p對甲狀腺癌細胞系BCPAP的活性、遷移和侵襲具有調控作用。

表2 敲降miR-340-5p對甲狀腺癌細胞的活力、遷移和侵襲影響的比較

圖2 敲降miR-340-5p對甲狀腺癌細胞遷移和侵襲的影響(結晶紫染色,×100)

2.3miR-340-5p與ARID1A靶向結合關系 通過Starbase在線分析發現,miR-340-5p與ARID1A具有直接結合位點。見圖3。提示ARID1A可能是miR-340-5p的靶標基因。進一步構建了ARID1A雙熒光素酶突變載體。見圖4。通過雙熒光素酶報告基因檢測發現,WT-ARID1A與miR-340-5p模擬物共轉染后,與模擬物對照熒光活性相比,miR-340-5p模擬物明顯抑制細胞的熒光活性(P<0.05);與抑制物對照熒光活性相比,miR-340-5p抑制物共轉染則明顯增加熒光活性(P<0.05),而MUT-ARID1A與模擬物對照或者抑制物對照相比,miR-340-5p模擬物或者抑制物共轉染后細胞中的熒光活性無統計學差異(P>0.05)。見表3。表明miR-340-5p靶向調控ARID1A表達。

圖3 miR-340-5p與ARID1A存在結合位點

圖4 構建ARID1A雙熒光素酶載體

表3 miR-340-5p與ARID1A靶向結合關系

2.4miR-340-5p通過調控ARID1A對甲狀腺癌細胞的活性、遷移和侵襲的影響 與對照組和抑制物對照+sh-RNA對照組相比,miR-340-5p抑制物組miR-340-5p表達明顯減少,敲降ARID1A對miR-340-5p表達沒有明顯影響(P<0.05),且miR-340-5p抑制物組與miR-340-5p抑制物+sh-ARIT1A組相比,miR-340-5p表達無顯著差異(P>0.05);與對照組及抑制物對照+sh-RNA對照組相比,miR-340-5p抑制物組ARID1A mRNA和蛋白表達明顯增加,sh-ARID1A組ARID1A mRNA和蛋白質表達明顯減少(P<0.05);miR-340-5p抑制物組+sh-ARID1A組ARID1A mRNA和蛋白表達較sh-ARID1A組明顯升高(P<0.05)。證實ARID1A為miR-340-5p的下游基因。進一步分析細胞活性、遷移和侵襲變化發現,與對照組及抑制物對照+sh-RNA對照組相比,miR-340-5p抑制物組細胞48 h活性、遷移和侵襲數明顯減少(P<0.05),sh-ARID1A組細胞48 h活性、遷移、侵襲數顯著增加(P<0.05)。而同時敲降ARID1A明顯逆轉了單獨敲降miR-340-5p對48 h活性、遷移、侵襲的抑制作用。見圖1、圖5、表4。表明miR-340-5p通過調控ARID1A影響甲狀腺癌細胞活性、遷移和侵襲。

圖5 各組BCPAP細胞遷移和侵襲(結晶紫染色,×100)

表4 同時敲降miR-340-5p和miR-340-5p對甲狀腺癌細胞活力、遷移和侵襲影響的比較

3 討 論

預計到2030年,甲狀腺癌將成為第四大癌癥〔17〕。雖然高分化甲狀腺乳頭狀癌具有良好的預后,但50%淋巴結轉移率和20%復發率仍然使甲狀腺癌備受關注〔18〕。本研究在甲狀腺癌多個細胞系中發現miR-340-5p和ARID1A的表達失調。

miRNA通常通過調控下游mRNA的穩定性和翻譯活性來影響下游基因的表達〔19〕。miR-340-5p在癌癥中具有抑癌和促癌兩種調控作用〔9〕。在結直腸癌〔20〕和乳腺癌〔21〕中miR-340-5p具有抑癌作用。與正常黏膜相比,miR-340-5p在結直腸癌組織中的表達水平顯著降低且與較差的預后相關〔22〕。轉染miR-340-5p降低了結腸癌細胞的遷移和侵襲〔23〕。而在胃癌〔24〕、甲狀腺癌〔11〕等癌癥中miR-340-5p則具有促癌基因作用。研究發現,miR-340-5p過表達促進了腎癌細胞增殖、遷移、侵襲、細胞外丙氨酸水平和糖酵解水平〔25〕。Zhao等〔11〕研究發現,在甲狀腺癌組織中miR-340-5p過表達,具有較高病理分級的腫瘤具有較高水平的miR-340-5p。并且miR-340-5p過表達通過抑制BMP4顯著增強了甲狀腺癌細胞活力和集落形成,與本研究一致。miR-340-5p在不同癌癥中具有不同調控作用,推測可能是miR-340-5p具有疾病特異性。關于miR-340-5p對于癌癥調控機制仍需深入探究。

ARID1A編碼多功能SWI/SNF的復合亞基。ARID1A表達異常常見于多種癌癥類型,如卵巢癌、結直腸癌、膽管癌等〔26〕。研究表示,在肺腺癌中ARID1A的缺失導致組蛋白去乙?；?HDAC)1募集缺失,并隨后增強了糖酵解相關基因的驅動轉錄從而促進癌癥發展〔27〕。本研究證實,ARID1A是miR-340-5p的靶標下游。敲降ARID1A能夠逆轉miR-340-5p抑制劑對甲狀腺癌細胞活性、遷移和侵襲的抑制作用。本研究只在甲狀腺癌細胞中進行研究,由于癌癥的轉移可能涉及多種因素影響,后續將在小鼠體內進行深入驗證。