VEGFA、HIF-1α在老年肺癌組織表達及對肺癌細胞血管管腔形成的影響

王清 武香梅 劉福升 宮理達 陳震 陸愛萍

(1北京老年醫院病理科,北京 100095;2北京腫瘤醫院病理科)

肺癌是臨床常見的惡性腫瘤類疾病,而老年肺癌則是導致患者死亡及產生不良預后的重要病因〔1〕。老年肺癌也是主要的轉移致死疾病之一,其復發和轉移率升高是影響老年患者生存和死亡的最關鍵因素,其中淋巴結轉移老年是肺癌當中較常見的,可及大的影響和降低肺癌患者的生存率。血管生成在肺癌的發生和發展中具有關鍵的作用,而血管內皮生長因子(VEGF)A是其中重要的調控因子,其廣泛存在于受損的血管內皮細胞中,可增加內皮祖細胞的遷移,在病理形態下對肺癌的血管生成起重要促進作用〔2〕。缺氧誘導因子(HIF)-1α是介導VEGF的關鍵執行因子,是在缺氧誘導因子中具體控制氧濃度的關鍵因子,在肺癌中具有高表達現象,可幫助癌細胞建立促進自身分泌的信號通路并增加其侵襲特性〔3〕。肺癌的產生常需依靠于多種受體、血管內皮生長因子、信號通路傳導,且血管生成是加快肺癌疾病進展的重要因素〔4〕。肺癌細胞的生長和轉移與新生血管的生成之間具有重要聯系,且當癌細胞超過一定數量時便可通過分泌各種促血管生成因子,在其組織周圍形成新生的血管網以促進腫瘤內部的血管循環〔5〕。因此,抑制肺癌中細胞內的血管生成已成為現階段老年肺癌治療的重要舉措之一。本研究探討VEGFA、HIF-1α在老年肺癌組織中表達及對肺癌細胞血管管腔形成的影響。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取北京老年醫院2020年6月至2021年12月根據世界衛生組織(WHO)病理學診斷標準確診,并在北京老年醫院進行根治手術的100例肺老年癌患者所切除的肺部病理組織作為本次研究標本。其中男63例,女37例,年齡35～73歲,平均(56.23±21.15)歲,有吸煙史患者72例,飲酒史患者78例,依據TNM分期標準,Ⅰ期39例、Ⅱ期42例、Ⅲ期19例。納入標準:患者經病理檢測確診為肺癌;術前沒有進行放、化療及其他腫瘤相關治療。排除標準:以往有腫瘤疾病史;重要組織器官產生病變。此次研究經醫院倫理委員會批準,所有患者及家屬對本次研究知情同意并簽署同意書。

1.2實驗儀器 肺癌細胞株SPC-A-1(上海冠導生物工程公司,貨號C4601),顯微鏡(上海炳宇光學儀器公司產品,型號XDS-10),倒置生物顯微鏡(北京中顯恒業儀器,貨號DSZ2000X),顯色試劑盒(中杉金橋生物技術有限公司),CO2培養箱(上海三藤儀器,貨號DH-160I),恒溫箱(北京六一,貨號DYY-6C),兔抗人VEGF、癌細胞微血管密度(MVD)單克隆抗體(博世德生物技術有限公司)。

1.3細胞培養及轉染 將肺癌SPC-A-1細胞接種在有10%胎牛血清的DMEM/F12培養基中,于含5%CO2的37 ℃常溫培養箱中進行培養,等細胞貼壁融合80%左右時,使用0.25%的胰蛋白酶進行傳代培養,1次/2 d進行傳代后,取對數生長期的細胞實驗。SPC-A-1置于含有10%胎牛血清的DMEM培養基中培養,將SPC-A-1細胞以每孔1×105個接種在6孔板中,待細胞匯合約80%時,更換新鮮無血清培養基繼續進行培養,于12 h后將細胞溶解于Opti-MEM培養基中,加入VEGFA的抑制劑(Axitinib,10 μmol/L)、HIF-1α抑制劑(YC-1,10 μmol/L)、VEGFA+HIF-1α(Axitinib+YC-1,20 μmol/L),收集轉染24 h后的肺癌細胞用于后續實驗。

1.4細胞分組 將未轉染的肺癌細胞進行常規培養基進行培養作為SPC-A-1細胞組;將Axitinib與SPC-A-1細胞進行培養的作為Axitinib組;將YC-1與SPC-A-1細胞進行培養的作為YC-1組;將轉Axitinib+YC-1與SPC-A-1細胞進行培養的作為Axitinibt YC-1組。

1.5免疫組織化學染色法檢測VEGFA、HIF-1α陽性表達 使用免疫組化法檢測VEGFA、HIF-1α在癌組織及癌旁組織中的表達情況。標本均在24 h內采集于距病灶3 cm以外的癌旁組織和癌中心部位各取1塊,二甲苯脫蠟,15 min/次,乙醇梯度浸泡水化,清洗擦干后過氧化氫溫室下孵育15 min,磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次,檸檬酸鹽緩沖液微波熱修復,于37 ℃,2%牛血清白蛋白(BSA)環境下封閉30 min,依據說明書用封閉液稀釋一抗VEGFA(1∶1 000)、HIF-1α(1∶500),4 ℃冰箱過夜后洗膜,加入稀釋的生物素標記的二抗(1∶200),37 ℃水浴30 min,洗膜后二氨基聯苯胺(DAB)顯色,PBS洗滌3次后用蘇木素復染進行中性樹膠封片,HIF-1α、VEGFA胞質中呈棕黃色顆粒沉淀為陽性,每張切片隨機取5個高倍鏡視野,計數100個細胞,陽性細胞數≤5%為0分,6%～25%為1分,26%～50%為2分,51%～75%為3分,>75%為4分,陽性強度黃色為1分,棕黃色為2分,褐色為3分,0～6分表示陽性(+),8～12分表示高陽性()所得積分相乘,將+、歸為表達陽性組計算陽性率。

1.6基質膠小管形成實驗檢測血管生成 將96 孔培養板、無菌移液槍頭等所有實驗中將接觸基質膠的器材放置在-20 ℃冰箱中預冷,-20 ℃保存的基質膠于4 ℃冰箱中解凍,待基質膠呈液態時向培養板每孔加入60 μl,再置于4 ℃ 15 min,常規30 min成膠。培養24 h后收集各組肺癌細胞培養上清液,將1×105個/ml單細胞懸液以每100 μl的體積接種于96孔培養板,分別加入200 μl肺癌細胞培養上清液,加200 μl RPMI1640培養液于對照組,細胞培養箱中培養24 h,使用顯微鏡觀察類血管結構形成情況并拍照記錄,使用Im-age-Pro Plus軟件分析成管數量。

1.7免疫印跡檢測VEGF、MVD蛋白 取對數生長期的細胞加入裂解液中裂解,裂解后的細胞于10 000 r/min離心15 min,取上清液并收集細胞裂解物,Bradford法對蛋白濃度檢測,取20 μg總蛋白在1×十二烷基硫酸鈉(SDS)緩沖液中,沸騰5 min,10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE),電轉移至硝酸纖維素膜,用5%脫脂奶粉的PBS-T于室溫下封閉2 h后處理硝酸纖維素膜,加兔抗人VEGF(1∶1 000)、MVD(1∶800)、β-actin(1∶2 000),10%分離膠,稀釋后抗體4 ℃搖床孵育過夜,TBST洗滌3次,用辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶5 000)室溫下孵育2 h,TBST洗滌3 次,采用電化學發光(ECL)法檢測蛋白表達量,圖片灰度值進行膠片條帶的分析。

1.8聚合酶鏈反應(PCR)檢測肺癌細胞中HIF-1α、VEGFA mRNA的表達 肺癌細胞培養48 h后,采用Trizol試劑提取各組細胞總RNA并測定其濃度,按照試劑盒說明書合成cDNA,使用反轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA后,進行實時PCR分析。進行Real time PCR,反應條件為95 ℃ 3 min預變性,90 ℃ 5 s變性,75 ℃ 1 min退火,70 ℃ 30 s延伸,共40個循環,以β-actin作為內部標準化參照,應用2-△△Ct對基因進行相對定量計算,引物序列:HIF-1α上游引物:5′-CTGCCACTGCCACCACAACTG-3′、下游:5′-TGCCACTGTATGCTGATGCCTGAG-3′,VEGFA上游引物:5′-GTACCTCCACCATGCCAAAGT-3′、下游:5′-CTACCAGGGTCTCGATTGGA-3′,β-actin上游引物:5′-ACTGATCAGGCTAGCAC-3′、下游:5′-ACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3′。

1.9統計學分析 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗,χ2檢驗。

2 結 果

2.1肺癌組織及癌旁組織VEGFA、HIF-1α陽性表達 與癌旁組織比較,肺癌組織中VEGFA、HIF-1α陽性表達明顯較高(均P<0.001),見圖1,表1。

圖1 肺癌及癌旁組織中VEGFA、HIF-1α陽性表達(免疫組織化學染色,×200)

表1 肺癌組織及癌旁組織VEGFA、HIF-1α陽性表達〔n(%),n=10〕

2.2VEGFA、HIF-1α與患者淋巴轉移關系 肺癌組織中患者HIF-1α陽性、VEGFA陽性是否發生淋巴結轉移差異有統計學意義(P<0.05),見表2。

表2 VEGFA、HIF-1α陽性與患者淋巴轉移關系〔n(%)〕

2.3抑制VEGFA、HIF-1α對SPC-A-1細胞血管管腔形成數量的影響 與SPC-A-1細胞組比較,Axitinib組、YC-1組、Axitinib+YC-1組管腔形成數量均明顯降低(P<0.05);與Axitinib組、YC-1組比較,Axitinib+YC-1組管腔形成數量均明顯降低(均P<0.05),見表3、圖2。

2.4抑制后的VEGFA、HIF-1α mRNA在SPC-A-1細胞中的表達 與SPC-A-1細胞組比較,Axitinib組、YC-1組、Axitinib+YC-1組VEGFA、HIF-1α mRNA表達均明顯降低(P<0.05);與Axitinib組、YC-1組比較,Axitinib+YC-1組VEGFA、HIF-1α mRNA表達均明顯降低(P<0.05),見表3。

2.5抑制后的VEGFA、HIF-1α對SPC-A-1細胞管腔形成因子的蛋白表達 與SPC-A-1細胞組比較,Axitinib組、YC-1組、Axitinib+YC-1組VEGF、MVD蛋白表達明顯降低(P<0.05);與Axitinib組、YC-1組比較,Axitinib+YC-1組VEGF、MVD蛋白表達明顯降低(P<0.05),見表3、圖3。

表3 各組細胞血管管腔形成數量、VEGF、MVD蛋白表達、VEGFA、HIF-1α mRNA比較

圖2 肺癌細胞血管管腔形成數量(基質膠法,×100)

3 討 論

肺癌是現階段對人類健康造成較大威脅的疾病之一,且預后相對較差。HIF-1作為細胞在缺氧條件下所產生的一種核轉錄相關因子可促進癌細胞形成,且HIF-1α的降低能夠一定程度上抑制癌細胞的增加,其原因可能是由于HIF-1所調節的血管內皮生成因子表達下降相關〔6〕。在肺癌產生的過程中,HIF-1α一方面能夠促進VEGF表達,而另一方面VEGF表達又加劇了肺癌疾病的發展〔7,8〕。

HIF-1可在缺氧環境下介導區域性和系統性的缺氧反應及相關適應性反應〔9〕。以往實驗研究發現,VEGFA、HIF-1在人類結腸癌、乳腺癌及子宮癌前病變中等多種癌癥疾病中均具有過表達現象,且在正常組織中并無相關表達〔10～12〕。本研究結果提示,VEGFA、HIF-1α與淋巴結轉移呈顯著正相關,分析原因可能VEGFA陽性率升高使肺癌細胞的遷移活動增強且更易出現淋巴結轉移現象相關。

本研究中肺癌細胞中抑制VEGFA與HIF-1α可抑制血管管腔形成,提示有效抑制VEGFA、HIF-1α表達對抑制肺癌細胞具有重要作用。抑制VEGFA與HIF-1α后使得肺癌細胞的滋養和增殖力進行性減退并且導致肺癌細胞管腔生成發生障礙使其重鑄不足,同時也在一定程度上降低了血管內皮細胞對VEGFA、HIF-1α的敏感特性,有效抑制了血管的形成重建及新生。張文英等〔13〕研究發現,在肺腺癌中抑制VEGF可一定程度上降低肺腺癌體外微血管的形成,與本研究結果相類似。肺癌的發生及癌細胞的惡性轉移都需要持續的新生血管,而VEGF為促進血管形成的關鍵因子,不僅能夠通過與血管內皮細胞相結合而促進癌細胞的血管新生,還對促進癌轉移概率、提高血管通透性、增進淋巴內皮細胞轉移等具有關鍵調節作用〔14〕。相關研究表示,MVD的增加反映了癌細胞的血管生成增多,同時提示肺癌細胞的惡性行為能力也有所增加〔15〕。本研究發現,抑制VEGFA、HIF-1α能夠顯著降低肺癌細胞中的血管管腔形成因子VEGF及MVD表達。相關研究表示,VEGF可在一定程度上激活蛋白酶表達致使細胞外的基質被降解,進而在肺癌細胞的生成和發展中誘導血管因子生成而加快MVD形成〔16〕。以往在VEGF和MVD的關系研究中發現,抑制肺癌中的VEGF、MVD表達可抑制小細胞肺癌侵襲轉移〔17〕。成龍等〔18〕在VEGF抑制劑治療肺癌的療效和安全性的研究中表示,VEGF抑制劑可提高患者的生存率。由此本文推測,抑制VEGFA、HIF-1α可使癌細胞中的血管新生、形成、成熟等受限,破壞癌細胞血管的完整性的同時抑制VEGF的血管芽生,進而阻止肺癌細胞的生長。

本研究結果提示,抑制后的VEGFA、HIF-1α對抑制肺癌細胞中的VEGFA、HIF-1α mRNA表達具有一定作用。以往研究發現,當對常規細胞進行相關有氧因子的抑制處理后,可在一定程度上使得VEGF mRNA的可逆性表達被抑制〔19〕。在該環節中HIF-1α作為主要的參與因子可通過結合VEGF周圍的缺氧反應元件抑制相關因子活性并干擾VEGF mRNA的穩定性。因此,HIF-1α可能在疾病中可在轉錄及轉錄后調節VEGF的相關表達。Zhang等〔20〕研究發現,HIF-1α同VEGF表達呈正相關,在疾病中通過降低HIF-1α、VEGF可達到抑制不良腫瘤形成及腫瘤血管新生的作用。而經抑制的VEGFA、HIF-1α可通過降低肺癌中淋巴細胞、內皮細胞、血管生長因子等的生成,進而降低肺癌細胞生長和轉移率。

綜上,VEGFA、HIF-1α均在老年肺癌組織中呈高表達現象,并與患者淋巴結轉移具有一定聯系,而經抑制的VEGFA、HIF-1α對降低肺癌細胞血管管腔形成及肺癌的發生發展具有重要作用,并對預測老年肺癌患者的疾病具有積極意義。