miR-93靶向TLR4/NF-κB信號通路對動脈粥樣硬化大鼠血管內皮炎癥反應的影響

李豐玲 劉云霞 劉秀 劉瑜

(濰坊醫學院附屬醫院 1神經內一科,山東 濰坊 261031;2浮煙山綜合內科;3濱州醫學院煙臺附屬醫院心血管內科;4濰坊醫學院附屬醫院全科醫學科)

動脈粥樣硬化(AS)是引起心腦血管疾病發生及死亡的重要原因〔1〕。炎癥是AS血管內皮損傷發生發展及惡化的重要推動因素,也是刺激巨噬細胞活化產生炎癥應答、形成泡沫細胞,導致血管內皮脂質沉積及斑塊形成的關鍵因素,并認為抑制炎癥信號的生成、傳導及擴大,是延緩AS發生及惡化的關鍵機制〔2〕。

Toll樣受體(TLR)4可與動脈損傷過程中的內源性配體相結合,誘導核因子(NF)-κB入核活化,介導炎癥信號產生及擴大,并調控巨噬細胞極化參與AS血管內皮脂質沉積及炎癥應答〔3〕。特異性敲低TLR4及其下游炎癥因子表達,可發揮抗AS血管內皮脂質沉積及炎癥損傷作用〔4〕,預示干預TLR4/NF-κB信號活化,可能是治療AS的關鍵策略。但靶向抑制TLR4/NF-κB信號活化的基因調控機制,還不甚明確。

微小RNA(miRNA)可與蛋白質編碼基因(mRNA)的3′非翻譯區(UTR)相互結合來調控蛋白質的轉錄及表達,并參與AS等炎性疾病的發生發展〔5〕。已有報道發現,miRNA中的miR-93在AS患者血清中呈異常低表達,并推測miR-93缺失可能是引起AS患者血管白細胞聚集和脂肪物質沉積的關鍵因素〔6〕。但miR-93參與AS血管內皮脂質沉積及炎癥損傷的分子調控機制卻并不清楚。另外,也有研究發現,miR-93與TLR4之間存在靶向調控關系,miR-93的高表達可靶向抑制TLR4表達,發揮抗骨關節炎炎癥反應〔7〕,預示外源性干預miR-93表達,很可能通過抑制TLR4/NF-κB信號活化,而達到抗AS血管內皮脂質沉積及炎癥損傷目的。本研究建立大鼠AS模型,探討miR-93靶向TLR4/NF-κB信號通路對AS大鼠血管內皮炎癥反應的影響。

1 材料及方法

1.1材料 取健康清潔級SD大鼠90只,雌雄各半,體質量180～220 g,鼠齡7～8周齡,購自肇慶市瑞思元生物科技有限公司,生產許可證號:SCXK(粵)2020-0053。本研究經醫院動物倫理委員會批準同意,批號為IACUC-01(2020103029)。維生素D3(貨號:YT2462,北京伊塔生物科技有限公司);miR-93模擬物(miR-93 agomir)及其陰性對照agomir-NC均由百奧邁科生物技術有限公司合成;TLR4激活劑RS09(貨號:HY-P1431,美國MCE公司);三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度膽固醇脂蛋白(LDL-C)、白細胞介素(IL)-6、C反應蛋白(CRP)等酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒均購自南京森貝伽生物科技有限公司;Movat染色液及油紅O染色液購自上海一研生物科技有限公司;M1型巨噬細胞標記抗體(CD11)、TLR4、NF-κB、磷酸化NF(p-NF)-κB、三磷酸腺苷(ATP)結合盒轉運體(ABC)A1、載脂蛋白(Apo)A1、巨噬細胞清道夫受體(ScR)-A、凝集素型氧化低密度脂蛋白受體(Lox)-1、IL-1β、誘導型一氧化氮(iNOS)、IL-10、幾丁質酶-3樣蛋白3(YM1)等抗體均購自美國Abcam公司。

1.2AS模型建立及分組 取SD大鼠75只,經腹腔注射維生素D3(60×104IU/kg)1次后,給予高脂飼料喂養8 w建立AS模型〔8〕,并按隨機數字表法分為模型組、miR-93模擬物(miR-93 agomir)組、agomir-NC組、RS09(TLR4激活劑)組、miR-93 agomir+RS09組,每組15只。另取15只大鼠,正常飼料喂養+腹腔注射生理鹽水(共1次),8 w后,作為正常對照組。miR-93 agomir組及其陰性對照agomiR-NC組,參照文獻〔7〕經尾靜脈注射5 nmol的miR-93 agomir及agomiR-NC試劑,每兩日1次;RS09組參照文獻〔9〕經尾靜脈注射25 μg/只的RS09,每兩日1次;模型組及正常對照組經尾靜脈注射10 ml/kg的生理鹽水;各組連續給藥6 w后結束給藥,進行后續試驗。

1.3血脂、炎性因子、循環血管內皮細胞比例檢測 末次給藥結束后,麻醉,取腹主動脈血3 ml,按ELISA方法測血脂(TG、TC、HDL-C、LDL-C)和炎癥因子(IL-6、CRP)水平;參照文獻〔10〕中方法,分離外周單核細胞,加入CD31抗體孵育30 min后,進行流式上機檢測并計算CD31陽性細胞比例,以CD31陽性細胞比例大小評價內皮細胞損傷變化。

1.4Movat及油紅O染色觀察胸主動脈血管內皮組織病理變化及斑塊面積 各組大鼠隨機取6只,麻醉后處死,取胸主動脈血管2.5 cm,于4%多聚甲醛中固定24 h后制成厚為5 μm的連續石蠟切片,每隔50 μm選1張切片(共5個切片),按Movat及油紅O染色液說明書方法染色后,于光鏡下觀察拍照,油紅O染色切片,使用Photoshop軟件計算5個切片中斑塊總面積百分比。

1.5免疫組化檢測CD11陽性表達水平 取上述連續石蠟切片,脫蠟及破膜透化處理后,滴加1∶200的CD11兔抗大鼠一抗抗體4 ℃避光孵育24 h,滴加生物素IgG二抗,室溫孵育2 h,二氨基聯苯胺(DAB)顯色處理后,光鏡下拍照,Image-Pro Plus6.0軟件分析單位面積內CD11陽性染色(棕黃色)區域的積分光密度值。

1.6實時熒光定量-聚合酶鏈反應(RT-qPCR)檢測miR-93表達 剩余大鼠斷頭處死,取胸主動脈組織2 cm,剪取1 cm血管組織粉碎勻漿后,提取總RNA,反轉錄得cDNA,行PCR(92 ℃預變性50 s、1個循環,95 ℃變性55 s、70 ℃退火60 s,共46個循環)。miR-93以U6為內參,用2-ΔΔCt法計算基因相對表達水平。各引物序列由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.7Western印跡法檢測蛋白表達 取胸主動脈組織1 cm,剪碎、裂解液裂解及勻漿后,提取胞漿及胞核中蛋白,二喹啉甲酸(BCA)法測蛋白濃度,制備分離膠及濃縮膠,取蛋白30 μg行電泳及電轉膜操作,滴加1∶500的一抗TLR4、NF-κB、p-NF-κB、ABCA1、ApoA1、ScR-A、Lox-1、CD11、IL-1β、iNOS、IL-10,YM1及1∶900的β-actin內參抗體,4 ℃避光孵育24 h,室溫滴加1∶1 100的羊抗兔二抗孵育50 min,化學發光法浸膜顯影,Quantity One軟件分析條帶相對灰度值。

1.8統計學分析 采用SPSS22.0軟件及Shapiro-Wilk軟件進行t檢驗、方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1上調miR-93對血脂水平的影響 與正常對照組相比,模型組HDL-C水平明顯降低,TC、TG、LDL-C水平明顯升高(P<0.05)。與模型組相比,miR-93 agomir組HDL-C水平明顯升高,TC、TG、LDL-C水平明顯降低(P<0.05)。RS09組HDL-C水平較模型組進一步明顯降低(P<0.05),TC、TG、LDL-C水平較模型組進一步明顯升高(P<0.05)。與miR-93 agomir組相比,miR-93 agomir+RS09組HDL-C水平明顯降低,TC、TG、LDL-C水平明顯升高(P<0.05)。agomir-NC組與模型組血脂水平變化差異不顯著(P>0.05),見表1。

2.2上調miR-93對血清炎癥因子及循環內皮細胞比例的影響 與正常對照組相比,模型組血清IL-6、CRP水平、循環內皮細胞比例明顯升高(P<0.05)。與模型組相比,miR-93 agomir組血清IL-6、CRP水平、循環內皮細胞比例明顯降低(P<0.05)。RS09組血清IL-6、CRP水平、循環內皮細胞比例較模型組進一步明顯升高(P<0.05)。與miR-93 agomir組相比,miR-93 agomir+RS09組血清IL-6、CRP水平、循環內皮細胞比例明顯升高(P<0.05)。agomir-NC組與模型組血清炎癥因子及循環內皮細胞比例變化差異不顯著(P>0.05),見表1。

表1 各組TC、TG、LDL-C、HDL-C水平、血清炎癥因子及循環內皮細胞比例比較

2.3上調miR-93對血管組織病理變化的影響 Movat染色及油紅O染色可見,正常對照組血管壁層次結構清晰,無脂質沉積。模型組可見血管內膜層增加,被染成紫色的泡沫細胞聚集明顯,內膜及中膜層有大量脂質彌漫,斑塊面積百分比明顯高于正常對照組(P<0.05)。miR-93 agomir組可見內膜層逐漸變薄,紫色的泡沫細胞聚集減少,脂質彌漫沉積減少,斑塊面積百分比明顯低于模型組(P<0.05)。RS09組血管內膜增厚進一步增加,紫色泡沫細胞聚集增多,脂質沉積進一步加重,斑塊面積百分比明顯高于模型組(P<0.05)。miR-93 agomir+RS09組紫色泡沫細胞聚集及脂質沉積較miR-93 agomir組嚴重,斑塊面積百分比明顯高于miR-93 agomir組(P<0.05)。agomir-NC組病理變化與模型組相似。見表2、圖1。

2.4上調miR-93對血管組織CD11陽性表達及miR-93/TLR4/NF-κB信號軸基因及蛋白表達的影響 CD11為M1型巨噬細胞標記的特異性抗體,免疫組化陽性染色呈黃棕色。與正常對照組相比,模型組CD11陽性表達、TLR4、p-NF-κB/NF-κB蛋白表達明顯升高,miR-93表達明顯降低(P<0.05)。與模型組相比,miR-93 agomir組CD11陽性表達、TLR4、p-NF-κB/NF-κB蛋白表達降低,miR-93表達明顯升高(P<0.05);RS09組CD11陽性表達、TLR4、p-NF-κB/NF-κB蛋白表達較模型組進一步明顯升高(P<0.05),miR-93表達較模型組相比差異不顯著(P>0.05)。與miR-93 agomir組相比,miR-93 agomir+RS09組CD11陽性表達、TLR4、p-NF-κB/NF-κB蛋白表達明顯升高(P<0.05),miR-93表達差異不顯著(P>0.05)。agomir-NC組與模型組相比上述指標變化差異不顯著(P>0.05),見表2、圖2、圖3。

表2 各組動脈血管斑塊面積、CD11陽性表達及miR-93、TLR4、p-NF-κB/NF-κB蛋白表達比較

圖1 各組胸主動脈血管(×40)

圖2 各組動脈血管CD11表達(免疫組化染色,×400)

2.5上調miR-93對血管組織脂質形成相關蛋白表達的影響 與正常對照組相比,模型組ScR-A、Lox-1蛋白表達明顯升高,ABCA1、ApoA1蛋白表達明顯降低(P<0.05)。與模型組相比,miR-93 agomir組ScR-A、Lox-1蛋白表達明顯降低,ABCA1、ApoA1表達明顯升高(P<0.05);RS09組ScR-A、Lox-1蛋白表達較模型組進一步明顯升高,ABCA1、ApoA1蛋白表達較模型組進一步明顯降低(P<0.05)。與miR-93 agomir組相比,miR-93 agomir+RS09組ScR-A、Lox-1蛋白表達明顯升高,ABCA1、ApoA1蛋白表達明顯降低(P<0.05)。agomir-NC組與模型組相比上述指標變化差異不顯著(P>0.05),見圖3、表3。

1～6:正常對照組、模型組、miR-93 agomir組、RS09組、agomir-NC組、miR-93 agomir+RS09組

2.6上調miR-93對血管組織巨噬細胞極化相關蛋白表達的影響 與正常對照組相比,模型組M1型巨噬細胞極化相關蛋白(IL-1β、iNOS)表達明顯升高(P<0.05),M2巨噬細胞極化相關蛋白(IL-10,YM1)表達明顯降低(P<0.05)。與模型組相比,miR-93 agomir組IL-1β、iNOS蛋白表達明顯降低,IL-10、YM1蛋白表達明顯升高(P<0.05)。RS09組IL-1β、iNOS表達較模型組明顯升高,IL-10、YM1蛋白表達較模型組明顯降低(P<0.05)。與miR-93 agomir組相比,miR-93 agomir+RS09組蛋白IL-1β、iNOS表達明顯升高,IL-10、YM1蛋白表達明顯降低(P<0.05)。agomir-NC組與模型組相比上述指標差異不顯著(P>0.05),見圖3、表3。

表3 各組動脈血管組織ScR-A、Lox-1、ABCA1、ApoA1蛋白、IL-1β、iNOS、IL-10、YM1表達比較

3 討 論

AS是引起心腦血管疾病患病率及死亡率逐年攀升的重要原因,防治AS對阻止AS性心腦血管疾病流行有重要作用〔11〕。炎癥是促進AS脂質沉積及斑塊形成的關鍵因素。大量研究發現,AS患者機體中存在促炎因子如IL-6及CRP升高現象〔12〕,且IL-6及CRP等促炎介質的升高,一方面可刺激并損傷血管內皮細胞,導致血管收縮功能降低,機體循環內皮細胞比例升高而促進血管內皮損傷后再重構〔13〕,另一方面可招募巨噬細胞,使巨噬細胞活化并通過內皮細胞間隙進入血管內壁,氧化LDL-C成為ox-LDL后,吞噬ox-LDL轉化為泡沫細胞,來介導炎癥應答及脂質沉積〔14〕,加劇AS斑塊形成、導致血管內皮功能異常及血栓形成,最終引起心血管事件的發生。本研究結果提示,AS大鼠造模成功。

另外,AS炎癥刺激單核巨噬細胞活化過程中,巨噬細胞一方面可極化成具有促炎表型的M1型細胞并釋放IL-1β、iNOS等促炎介質,來加劇巨噬細胞吞噬ox-LDL轉化為泡沫細胞,導致斑塊形成,另一方面可極化成具有抗炎表型的M2型巨噬細胞并分泌IL-10、YM1抗炎因子,來抑制ScR-A及Lox-1表達,從而延緩ox-LDL的攝取及泡沫細胞的形成〔15〕。感染、脂代謝紊亂、炎癥等因素刺激動脈內皮損傷過程中,TLR4可迅速識別并結合動脈損傷過程中釋放的內源性配體,誘導NF-κB入核活化,來釋放大量炎癥介質,刺激巨噬細胞極化,調控LDL-C修飾成ox-LDL而介導脂質形成及炎癥應答,并促進炎癥細胞趨化及脂質沉積,加劇AS斑塊形成及內皮細胞損傷〔16〕。本研究結果提示,TLR4/NF-κB介導的炎癥及巨噬細胞極化激活,可能是導致AS血管內皮損傷、泡沫細胞聚集及脂質沉積形成的關鍵通路。

目前已有用炎癥特異性抑制劑〔IL-1受體抑制劑、NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白(NLRP)3受體阻斷劑〕來靶向抑制炎癥因子的表達,發揮抗AS炎癥及斑塊形成,但這些靶向抑制劑并不能完全降低炎癥反應的復發及心血管事件的發生〔17〕,并認為AS血管內皮炎癥損傷及脂質沉積,可能與miRNA的異常表達有關,且炎癥特異性抑制劑的使用,并不能逆轉miRNA異常引發的炎癥靶蛋白轉錄翻譯的異?！?8〕。故尋找抑制TLR4/NF-κB炎癥信號的上游miRNA,內源性靶向調控TLR4/NF-κB炎癥應答信號,可能是防治AS的有效策略。miRNA中的miR-93是TLR4的上游調節因子〔19〕,已有研究發現,miR-93可靶向負調控TLR4表達,阻斷TLR4/NF-κB炎癥應答信號活化,來抵抗骨關節、肺炎等炎癥性疾病的進一步惡化〔20,7〕。另外,miR-93已被發現在AS患者外周單核細胞中表達降低,且AS患者miR-93表達的缺失可能與ABCA1、ApoA1等脂肪轉運相關蛋白的缺失有關〔6〕。但外源性上調miR-93表達,是否能靶向抑制TLR4/NF-κB炎癥應答信號活化,緩解AS內皮炎癥損傷及斑塊形成,還未見報道。本研究結果提示,外源性上調miR-93表達,可靶向抑制TLR4/NF-κB炎癥應答信號活化,降低炎癥刺激引起的內皮細胞損傷、泡沫細胞聚集、脂質沉積。TLR4/NF-κB特異性激活劑-RS09可拮抗miR-93 agomir的抗炎、抗M1型巨噬細胞極化、抗泡沫細胞聚集及抗脂質沉積作用。

綜上,外源性上調miR-93表達可能通過靶向抑制TLR4/NF-κB通路活化,發揮抗炎、抗M1型巨噬細胞極化、抗泡沫細胞聚集及抗脂質沉積作用,改善AS大鼠血管內皮損傷及斑塊形成。但引起miR-93表達異常的上游調控機制還不甚清楚,有待后續繼續研究。