MicroRNA檢測方法研究進展

李文娜，秦 怡，彭偉盼

（天津大學生命科學學院，天津 300072）

0 引 言

MicroRNA（miRNA）是一類大約19 ～24 個核苷酸的非編碼小RNA，通過與目標mRNA 的3’-UTR 結合而抑制蛋白質的翻譯。研究發現，miRNA 可直接與蛋白質相互作用，調節基因表達或影響表觀遺傳機制［1］。研究表明，miRNA的異常表達與多種癌癥（例如乳腺癌、肺癌及口腔癌等）的發生發展密切相關，可作為一種非侵入理想的生物標志物用于腫瘤等疾病的檢測［2］。然而，miRNA具有序列短、同源性高及易降解等特點，實現其精準檢測具有較大挑戰性［3］。因此，在過去的幾十年里，研究者投入了大量精力開發miRNA 檢測方法［4］。目前，miRNA 檢測技術可分為兩類：傳統檢測與新型檢測方法。其中，傳統miRNA檢測方法主要包括印跡雜交（Northern blot）技術［5，6］、微陣列分析技術［7，8］和定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）技術［5，9，10］。為了進一步提高檢測的靈敏度和特異性，新型miRNA生物傳感器往往依賴于信號放大策略，如基于納米粒子的信號放大［11，12］及等溫核酸擴增技術的信號放大［13，14］等技術?；诖?，本文圍繞傳統檢測方法與新型檢測方法兩個方面，總結miRNA檢測方法的研究成果，并討論了其在改進miRNA生物傳感器設計方面的優勢與局限性，最后，提出miRNA檢測技術未來的發展趨勢。

1 傳統miRNA檢測方法

傳統miRNA檢測方法主要包括Northern blot 技術、微陣列分析技術和qPCR技術。

Northern blot技術：該技術不僅可用于成熟miRNA 檢測，還可用于其前體檢測。如圖1（a）所示，基本原理如下：RNA樣本經電泳分離后，轉移到硝化纖維素膜或尼龍膜上，設計含有miRNA 互補的序列及同位素或其他標記的DNA標記探針，利用對該探針的檢測實現miRNA 定量［15～17］。Northern blot技術可實現miRNA 的相對分子大小和相對豐度檢測，但存在半定量、靈敏度較低及操作復雜等弊端。

圖1 傳統miRNA檢測方法

微陣列技術：該技術廣泛應用于miRNA 的高通量檢測。如圖1（b）所示，首先，通過標記探針將目標miRNA逆轉錄為熒光團或生物素標記的cDNA。其次，利用目標miRNA序列相同的固相寡核苷酸與其配對并進行熒光檢測［18］。如果雜交的cDNA被生物素化，鏈霉親和素標記的熒光團可被標記；如果cDNA被熒光團標記，則可直接測量每孔的熒光強度，確定miRNA的表達水平。雖然微陣列技術一次性可分析數千個樣本，但存在成本高、操作復雜及特異性差等弊端。

qPCR技術：該技術具有動態范圍大及靈敏度高等優勢，已成為miRNA 常規且可靠的檢測技術。如圖1（c）所示，目標miRNA通過莖環引物或聚胸腺嘧啶適配體逆轉錄轉變成cDNA，利用PCR技術對cDNA進行實時熒光檢測，從而確定miRNA 含量。qPCR 技術可實現miRNA 高靈敏檢測，但其假陽性高及引物設計困難等弊端限制了其進一步應用。

2 新型miRNA檢測方法

針對傳統miRNA檢測方法存在靈敏度低、特異性差且往往需要大型儀器輔助等缺陷。研究學者開發了多種新型miRNA生物傳感器，實現miRNA低成本、高靈敏及高特異檢測，在臨床診斷和生物醫學研究領域具有較大應用潛力。主要包括：基于等溫核酸擴增技術信號放大的miRNA檢測方法與基于納米粒子信號放大的miRNA檢測方法。

2.1 基于等溫核酸擴增技術信號放大的miRNA檢測方法

等溫核酸擴增技術的出現，為miRNA高靈敏檢測帶來新契機，與傳統PCR 方法相比，其更適用于目標物的及時快速檢測。目前，滾環擴增（rolling circle amplification，RCA）、環介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、基于雙鏈特異性核酸酶（duplex-specific nuclease，DSN）擴增和無酶擴增等多種等溫核酸擴增方法已被用于miRNA檢測，如圖2。通常利用SYBR Green 作為DNA 熒光嵌入染料，用于熒光實時檢測，然而，SYBR Green 染料以劑量依賴方式降低擴增效率，易發生非特異性擴增。為實現擴增產物特異性檢測，TaqMan 探針被用于檢測擴增產物，但其依賴Taq 外切酶的耐高溫活性。與TaqMan 相比，分子信標（molecular beacons，MBs）和一步式鏈置換（one-step strand displacement，OSD）報告分子在檢測序列特異性核酸中具有更好的檢測性能，并可阻礙假陽性產物的生成。

圖2 基于等溫核酸擴增技術信號放大的miRNA檢測方法

2.1.1 基于RCA的miRNA檢測方法

RCA技術因其高靈敏度、高特異性的優勢，廣泛應用于核酸檢測中，其中，miRNA可作為啟動RCA所需連接反應的理想模板。近年來，為提高特異性與擴增效率，研究學者基于Phi29 DNA聚合酶的強鏈置換活性，提出多種RCA改良技術，例如設計特殊的掛鎖或啞鈴探針、添加第二個引物等。如圖2（a）所示，Deng R等人［19］通過將RCA與支鏈介導的鏈置換也稱Toehold 介導DNA 鏈置換（Toehold mediated strand displacement，TMSD）反應技術相結合，開發了一種新型miRNA原位檢測方法。該研究設計了啞鈴狀封閉探針在TMSD 和RCA 中均發揮了關鍵作用。目標miRNA通過啟動TMSD過程介導探針結構的變化，從而觸發RCA反應產生大量報告分子。與傳統的RCA 反應，該系統依賴TMSD和啞鈴狀封閉探針的作用，與連接反應或酶識別無關，提高了檢測的特異性。同時，基于RCA 的高效擴增，與熒光原位雜交技術相比，該檢測平臺具有較高的靈敏度。

2.1.2 基于LAMP的miRNA檢測方法

LAMP是一種特異性強、靈敏度高及擴增效率高的等溫核酸擴增技術［4］，通過4～6 種不同的引物同時識別6～8種不同的目標序列，從而明顯提高檢測的特異性。在大多數基于LAMP的miRNA定量檢測中，miRNA可作為觸發器啟動反應（圖2（b）），當目標miRNA 存在時，引物在DNA聚合酶的作用下進行聚合延伸，并進行鏈置換合成高分子量的DNA產物。Tian W 等人［23］將RCA 與LAMP 相結合，設計了快速且超靈敏RCA-LAMP 技術實現miRNA檢測。目標let-7a可直接以鎖狀探針連接為模板，進而觸發RCA反應，產生重復串聯的擴增產物。其次，RCA 產物可進一步作為模板，生成大量具有功能序列的雙莖環DNA，作為后續LAMP反應的起始原料。該生物傳感器通過目標物介導連接反應，依次觸發RCA與LAMP級聯反應，顯著提高擴增效率與檢測靈敏度，檢測限低至10 amol／L。該傳感器為miRNA的分析提供了廣闊的應用前景，并可擴展至多種基因生物標志物的檢測。

2.1.3 基于DSN擴增的miRNA檢測方法

目前，上述RCA 與LAMP 反應仍依賴復雜的序列設計，包括莖環引物與模板。從整體上看，等溫核酸擴增技術設計復雜，并存在可能發生副反應和檢測背景高等問題?；诖?，研究學者開發了以酶為基礎的等溫切刻擴增技術用于miRNA 檢測。DSN 可水解DNA／RNA 或雙鏈DNA（double strand DNA，dsDNA）中DNA結構，而對核苷酸序列無特殊要求?；贒SN的特性，miRNA可在該反應中實現循環使用，有效放大檢測信號。如圖2（c）所示，Yin B C等人［21］報道了一種基于DSN的簡便快速的miRNA檢測系統。該系統無需設計復雜探針、鏈延伸或置換等過程。該方法僅需目標miRNA 與Taqman 探針簡單配對雜交，可實現序列特異性miRNA 的定量檢測，檢測限低至fmol／L級別，比傳統MBs的檢測限低近5 個數量級。該生物傳感器靈敏高、特異性強、重現性強且操作簡單，有望成為組織或細胞中多種miRNA定量分析常規工具，并為生物醫學研究和臨床早期診斷提供應用平臺。

2.1.4 基于無酶擴增的miRNA檢測方法

無酶擴增是一種由支鏈介導的DNA鏈置換反應，因其無需變溫操作且無酶的優點，在miRNA檢測等方面引起了廣泛關注。其中，催化發夾組裝（catalytic hairpin assembly，CHA）具有良好的信號放大能力及可忽略的背景干擾等優勢，廣泛應用于miRNA檢測領域。如圖2（d）所示，Kim H等人［22］基于目標物觸發CHA 反應和DNA-銀納米團簇（DNA-Ag nanoclusters，AgNCs）的熒光增強技術，構建了一種簡單、無酶及無標記的miRNA 檢測策略，并可進一步應用于人血清樣本檢測。然而，該策略的靈敏度仍受到發夾組裝效率差和目標與染料修飾的探針之間結合率低的限制?；诖?，Zhen S J等人［24］利用捕獲探針將染料修飾探針固定在氧化石墨烯（graphene oxide，GO）表面，構建了高靈敏miRNA生物傳感器。當目標miRNA-21 觸發CHA 反應，產生H1-H2探針時，染料修飾的探針才脫離GO 表面。通過收集熒光信號，實現miRNA 定量檢測，檢測限低至47 pmol／L。

2.2 基于納米粒子信號放大的miRNA檢測方法

近幾年，隨著納米技術的蓬勃發展，納米粒子，例如金納米粒子（Au nanoparticles，AuNPs）、AgNCs、銅納米粒子（Cu nanoparticles，CuNPs）和多壁碳納米管-氧化石墨烯納米帶（MWCNTs-GONPs）等已成為改善傳統檢測方法性能的有力工具，可有效實現信號放大，提高檢測靈敏度，廣泛應用于miRNA檢測研究領域，如圖3所示。

圖3 基于納米粒子信號放大的miRNA檢測方法

AuNPs具有強表面等離子體共振吸收和高消光系數等優良光學性質，廣泛應用于生物檢測技術的開發?；贏uNPs的比色檢測技術，可實現miRNA快速簡便且無需昂貴儀器輔助檢測。通過Au-S鍵結合目標捕獲探針，實現AuNPs核酸探針的制備。目標物存在時，通過觸發分散的AuNPs發生聚集反應，產生強表面等離子體共振吸收，導致溶液顏色從紅色變為紫色。Persano S 等人［25］基于AuNPs表面等離子體共振吸收特性，構建了比色生物傳感器用于生物樣品中miRNA 的檢測。如圖3（a）所示，當目標物存在時，觸發等溫切刻酶擴增反應，隨后擴增產物和AuNPs、磁納米粒子偶聯，實現miRNA裸眼比色檢測。該檢測平臺靈敏度高且特異性強，檢測限低至amol／L 級別，同時可實現乳腺癌相關miRNA-10b檢測，并應用于乳腺癌細細胞裂解液和乳腺癌小鼠模型的血清樣本檢測。同樣地，Li R D等人［26］受Park K W等人［27］實驗的啟發，基于等溫指數擴增反應（exponential amplification reaction，EXPAR）與AuNPs信號放大，構建了快速且靈敏的miRNA 比色生物傳感器。在50 fmol／L ～10 nmol／L的線性范圍內，該檢測技術可實現miRNA定量，檢測限低至46 fmol／L，同時具備區分同源miRNA之間單核苷酸差異能力。

AgNCs具有高生物相容性、光穩定性及亞納米尺寸等優勢，可在生物檢測中作為新的信號轉換器。與AuNPs不同，當富含鳥嘌呤的DNA序列與AgNCs結合時，可顯著增強其熒光強度，避免了其與核酸之間的共價連接。研究學者基于等溫擴增策略與AgNCs信號放大，構建了多種高靈敏miRNA生物傳感器［19，28］。然而，由于AgNCs 對蛋白酶及酶促反應條件比較敏感，可能導致實驗重復性差。為克服此弊端，科研工作者將AgNCs 與無酶擴增技術（如CHA［22］和SDA［29］）結合，顯著提高檢測的靈敏度、特異性及穩定性。

CuNPs具有無毒、高生物相容性和易合成等優勢，引起研究者的廣泛關注，開發了多種生物傳感器用于miRNA高靈敏檢測［30，31］。如圖3（b）所示，Park K W等人［27］基于目標輔助EXPAR技術結合聚（胸腺嘧啶）修飾熒光CuNPs作為信號探針，構建了快速且超靈敏miRNA檢測平臺。同樣地，Borghei Y S等人［32］基于CuNPs熒光發射的變化，通過寡核苷酸置換CuNPs，成功實現人血清樣品中miRNA-155檢測。

近年來，碳納米材料也被廣泛應用于miRNA 檢測領域，主要包括石墨烯和碳納米管（carbon nanotubes，CNTs），其在硬度、機械性能、耐熱性和導電性等方面均優于其他材料。如圖3（c）所示，Wang J等人［33］將單鏈DNA捕獲探針固定于MWCNTs-GONPs修飾的電極表面，通過DSN 輔助靶標循環擴增技術，實現了miRNA-21 高靈敏且高特異性檢測，檢測限低至0.034 fmol／L。

基于不同納米粒子信號放大的miRNA檢測方法如表1。

表1 基于不同納米粒子信號放大的miRNA檢測方法匯總

3 結束語

綜上所述，本文圍繞傳統miRNA 檢測方法與新型miRNA生物傳感器2 個方面，總結了多種miRNA 檢測策略，其進一步推動了等溫核酸擴增策略與納米技術在生物檢測領域的應用，為相關疾病的診斷與預防提供了新思路。然而，上述策略仍存在較大改進空間，目前亟需開發更為便攜和智能化的多功能核酸生物傳感平臺，助力于miRNA和納米材料在臨床診斷中的實際應用。