滋腎丸對KKay小鼠肝臟胰島素抵抗以及PI3K-Akt-FOXO1通路的影響

陳源 吳悠 吳麗麗 秦靈靈 劉銅華

糖尿病是一類以高血糖和糖脂代謝障礙為特征的代謝性疾病,中醫認為其核心病機為“陰虛燥熱”[1-2]。滋腎丸是一首中醫經典名方,方中只有知母、黃柏、肉桂三味藥,常用于淋證、癃閉等腎系疾病。方中知母、黃柏滋陰清熱,肉桂反佐,基本符合糖尿病病機。前期動物實驗已經證實滋腎丸具有一定的降糖效果,如郭曉媛[3]用滋腎丸醇提取物對db/db小鼠干預四周后空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)水平開始下降,并能減輕糖尿病腎病腎小管早期腎損害,改善腎功能。Tang等[4]將db/db小鼠分成滋腎丸三個劑量組,發現其顯著降低小鼠血糖及糖化血紅蛋白水平,并改善其糖耐量,其降糖效果可與羅格列酮不相上下。實驗室前期研究發現滋腎丸可通過增加Occludin和ZO-1蛋白在腸道中的表達來增強腸道屏障功能和降低全身炎癥,改善骨骼肌形態,調節骨骼肌胰島素信號通路[5]。肝臟也是胰島素的重要靶器官之一,本研究將基于肝臟胰島素通路,進一步驗證其在自發性糖尿病動物模型KKay小鼠中的降糖作用,以及探討其改善肝臟胰島素抵抗的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

KKay小鼠21只,5周齡;C57BL/6J小鼠7只,5周齡,由北京華阜康生物科學有限公司提供,飼養于北京中醫藥大學SPF級動物房,室溫(25±2)℃,相對濕度(50±5)%,晝夜循環12小時/12小時人工光照條件下,自由飲水,正常維持飼料喂養。普通飼料為小鼠全價營養顆粒飼料,KKay小鼠專用高脂飼料由北京華阜康生物科學公司提供(貨號:1042)。

1.2 倫理審查

本研究的動物實驗經北京中醫藥大學動物倫理委員會批準(倫理號:BUCM-4-2019031003-1089)。

1.3 實驗藥物

知母、黃柏、肉桂中藥飲片購買于北京同仁堂制藥公司。

滋腎丸水提物提取:將中藥飲片知母300 g、黃柏300 g、肉桂45 g混合,浸泡在10倍藥重的蒸餾水中1小時,煮沸45分鐘后收集藥液。再次加入相同體積的水煮沸45分鐘,將兩次的煎劑一起放入旋轉蒸發儀中濃縮至645 mL,得到1g/mL浸膏。將濃縮的浸膏分裝收集在50 mL的EP管中并保存在-20℃冰箱中,每次灌胃前純水稀釋。

1.4 實驗儀器與試劑

便攜式血糖儀(GLUCOCARD 01-min plus,日本愛科來醫療科技有限公司,型號:GT-1970);酶聯免疫檢測儀(美國,Promega,型號:E9032);凝膠成像系統(美國,Bio-RAD公司,型號:ChemiDocTMXRS);研磨儀(上海凈信科技有限公司,型號:JXFSTPRP-24);實時熒光定量PCR儀(美國,Thermo Fisher Scientific,型號:7500);臺式高速冷凍離心機(美國Sigma Aldrich公司,型號:3K15);紫外分光光度計(瑞士梅特勒-托利多國際有限公司,型號:UV5Nano)。

RNA Easy Fast Tissue/cell Kit(北京天根生化科技有限公司,貨號:DP451);HiScript?III RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)(南京諾唯贊生物科技有限公司,貨號:R323);GO Taq?RT-Qpcr System(美國Promega生物技術有限公司,貨號:A6001);小鼠超敏胰島素ELISA試劑盒(美國ALPCO Diagnostics,貨號:80-INSMSU-E01)。

1.5 造模、分組與給藥

在適應性喂養3周后,所有小鼠禁食不禁水12小時,尾尖采血法測量FBG。據FBG及體重結果按隨機區組設計將KKay小鼠分為3組:滋腎丸高劑量組、滋腎丸低劑量組、模型組;C57BL/6J小鼠為正常組。滋腎丸高劑量組根據人劑量10 g黃柏、10 g知母、1.5 g肉桂,換算小鼠生藥給藥量2.8 g/kg。小鼠每天同一時間段灌胃給藥一次,滋腎丸高劑量組予2.8 g/kg,滋腎丸低劑量組予1.4 g/kg,模型組及正常組予等體積蒸餾水,連續給藥6周。

1.6 標本采集

第6周末次給藥后,禁食不禁水12小時,摘取眼球取血,置于離心管中,不抗凝,室溫下靜置30分鐘后在4℃,3 000 r/min條件下離心15分鐘,吸取上清液于-20℃保存;取出肝臟,將組織的一小部分固定在多聚甲醛溶液中用于形態學觀察,其余部分收集在管中并立即用液氮冷凍。

1.7 指標檢測

1.7.1 FBG測定 每周固定時間,將小鼠禁食不禁水12小時,取尾尖血,用葡萄糖氧化酶法測定FBG,采用配套血糖儀及試紙。

1.7.2 口服葡萄糖耐量試驗(oral glucose tolerance test,OGTT) 第6周末次給藥后,禁食不禁水12小時,測小鼠FBG作為0分鐘血糖,按2 g/kg給小鼠灌胃葡萄糖溶液進行OGTT試驗,測定30分鐘、60分鐘、120分鐘血糖,計算曲線下面積(area under curve,AUC)。

AUC=0.5×(Bg0min+Bg30min)/2+0.5×(Bg30min+Bg60min)/2+1×(Bg60min+Bg120min)/2

其中Bg0min為0分鐘血糖,以此類推。

1.7.3 酶聯免疫吸附法測定胰島素水平 將吸取的血清冷凍保存后檢測空腹血清胰島素(fasting insulin,FINS)水平,并計算胰島素抵抗指數(homeostasis model assessment-insulin resistance,HOMA-IR)。

HOMA-IR=FBG·FINS/22.5

1.7.4 肝臟組織染色 新鮮肝臟組織經4%多聚甲醛固定24小時后,石蠟包埋,3～5 μm切片,根據蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin staining,HE)染色試劑盒及糖原過碘酸雪夫染色(periodic Acid-Schiff staining,PAS)試劑盒使用說明書步驟進行,常規光學顯微鏡高倍鏡鏡檢,觀察肝臟組織形態及糖原分布情況,拍照保存圖片。

1.7.5 qRT-PCR法測定相關基因表達水平 將肝臟組織從-80℃冰箱取出,試劑盒提取總RNA,按照PCR操作要求及Promega試劑盒說明書進行逆轉錄合成cDNA并擴增,反應條件: 50℃2分鐘,95℃10分鐘,(95℃15秒,60℃1分鐘,40循環),95℃15秒,60℃1分鐘,95℃30秒,60℃15秒。以模型組的基因表達為對照,采用2-△△Ct法計算得到各個樣本之間相對的基因表達水平。檢測基因為胰島素受體底物(insulin receptor substrate,IRS)、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/Akt)、叉頭框蛋白1(forkhead box O1,FOXO1)、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase,PEPCK)、葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase,G6pase)、葡萄糖激酶(glucokinase,GCK)基因表達水平。所測基因引物序列如表1所示。

表1 qRT-PCR引物序列

1.8 統計學方法

2 結果

2.1 滋腎丸對KKay小鼠空腹血糖的影響

與正常組相比,模型組小鼠的血糖顯著升高(P<0.05);與模型組相比,滋腎丸低劑量組小鼠在第3、5、6周血糖顯著降低(P<0.05),從第1周開始至用藥結束,滋腎丸高劑量組小鼠空腹血糖顯著降低,差異有統計學意義(P<0.05),且下降幅度比滋腎丸低劑量組大。見表2。

表2 滋腎丸對KKay小鼠空腹血糖的影響

2.2 滋腎丸對KKay小鼠糖耐量的影響

與正常組相比,模型組小鼠的0分鐘、30分鐘、60分鐘、120分鐘血糖及AUC均顯著升高(P<0.05);與模型組相比,滋腎丸高、低劑量組0分鐘、30分鐘、60分鐘、120分鐘血糖及AUC均顯著下降(P<0.05)。見表3。

表3 滋腎丸對KKay小鼠糖耐量的影響

2.3 滋腎丸對KKay小鼠胰島素水平及胰島素抵抗指數的影響

與正常組相比,模型組FINS水平顯著降低(P<0.05),提示早期胰島調節功能受損;與模型組相比,高、低劑量滋腎丸均顯著提升FINS水平(P<0.05),考慮滋腎丸可以改善早期胰島功能。與正常組相比,模型組HOMA-IR顯著升高(P<0.05),提示胰島素抵抗。與模型組相比,高、低劑量滋腎丸均顯著降低HOMA-IR水平(P<0.05),提示滋腎丸可以改善胰島素抵抗。見表4。

表4 滋腎丸對KKay小鼠胰島素水平及胰島素抵抗指數的影響

2.4 肝臟組織病理學觀察

2.4.1 HE染色 光鏡下觀察小鼠肝臟細胞HE染色情況。正常組肝組織肝小葉結構清晰,肝索排列規則整齊,以中央靜脈為中心呈放射狀分布,未見脂質沉積;模型組肝臟形態紊亂,肝小葉肝索結構消失,肝細胞腫大變性,存在大量脂肪空泡及脂質沉積。與模型組相比,滋腎丸高、低劑量組肝小葉結構較為清晰完整,肝索排列較正常,肝竇排列較為規則,中央靜脈結構較完整,空泡樣改變明顯減少。見圖1。

注:A 正常組;B 模型組;C 滋腎丸低劑量組;D 滋腎丸高劑量組。

2.4.2 PAS染色 光鏡下觀察小鼠肝臟糖原染色,胞質PAS反應陽性物質即為糖原,顯示為紫紅色,細胞核為藍色。正常組肝細胞內紫紅色糖原顆粒分布均勻,數量適中,提示血糖正常平穩。與正常組相比,模型組肝細胞內紫紅色顆粒顯著減少,提示肝臟糖原合成減弱;與模型組相比,滋腎丸高、低劑量組紫紅色顆粒數量顯著增加,提示糖原顯著增多,與PCR結果相一致,表明滋腎丸劑量依賴性促進糖原合成,抑制肝糖輸出從而起到降低血糖的作用。見圖2。

注:A 正常組;B 模型組;C 滋腎丸低劑量組;D 滋腎丸高劑量組。

2.5 滋腎丸對KKay小鼠IRS-1、PI3K、AKT2、FOXO1、PEPCK、G6pase、GCK基因表達量的影響

與模型組相比,滋腎丸各劑量組FOXO1、PEPCK、G6pase的mRNA表達量均顯著降低(P<0.05),且滋腎丸高劑量組下降幅度比低劑量組大。與正常組相比,模型組FOXO1的mRNA表達量顯著上升(P<0.05),但PEPCK、G6pase的組間差異不符合預期。

與正常組相比,模型組GCK mRNA表達量顯著降低(P<0.05);與模型組相比,滋腎丸低劑量組GCK mRNA表達量有上升趨勢,但無統計學意義(P>0.05);高劑量組GCK mRNA表達量顯著上升(P<0.05)。

與模型組相比,滋腎丸給藥后IRS-1、PI3K及Akt2的mRNA有上升趨勢,但組間差異無統計學意義(P>0.05)。見表5。

表5 滋腎丸對KKay小鼠肝組織相關靶基因的影響

3 討論

中藥治療糖尿病具有多通路、多靶點的優勢特點,在當前時代背景下運用現代技術探究及闡明其內在作用機制是極其必要的。滋腎丸是來源于中醫古籍中的經典方劑,組方精妙,量小藥少而力專,方中以等量知母、黃柏為主,二者皆氣寒味苦入腎經,瀉火堅陰,在組方配伍中常相須而用?！侗静萁浗狻费灾浮爸飨薀嶂?除邪氣”,《本草經疏》云黃柏“以至陰之氣,補至陰之不足,虛則補之,以類相處”。二者相合,少佐溫陽化氣之肉桂共同起到滋陰化氣之效,尤宜于消渴病之下消證。本實驗參考既有文獻研究[4],以10∶10∶1.5的比例制成水提物,探究其降糖機制及量效關系,以冀對臨床中方劑應用提供幫助。

肝胰島素通路有轉錄水平以及蛋白磷酸化水平兩方面的調節作用,相關研究已證實IRS、PI3K、Akt是通路上的三個重要節點[6]。在生理條件下,胰島素分泌入血后,沿著IRS-1/PI3K/Akt2/FOXO1信號通路發生級聯反應,首先與肝細胞膜上的特定INSR結合,通過募集底物IRS-1,IRS-1多個酪氨酸殘基磷酸化,募集PI3K催化二磷酸磷脂酰肌醇生成三磷酸磷脂酰肌醇,后者進一步與下游Akt結合并磷酸化激活Akt。目前發現Akt有3種亞型,Akt1表達于大部分組織,Akt2主要表達于胰島素效應組織,Akt3則高度表達于腦和睪丸組織[7]。目前的研究表明Akt2是葡萄糖代謝所必需的[8]。肝臟Akt2激活后進一步磷酸化FOXO1使其失活,從而釋放下游糖異生基因轉錄及抑制葡萄糖產物生成。胰島素通過這些受體激活和信號蛋白的招募/磷酸化,在肝細胞質膜上啟動近端胰島素的一系列蛋白磷酸化反應。

FOXO1是肝臟胰島素信號級聯的關鍵一步,是代謝信號到細胞核的延續與轉接[9]。資料顯示,在高脂喂養的小鼠中肝臟FOXO1 mRNA表達降低40%也足以降低基礎的肝臟葡萄糖生成[10]。正常生理條件下,FOXO1停留在細胞核內,進食狀態時在胰島素作用下磷酸化失活從細胞核轉移到細胞質,從而禁用其轉錄因子活性;在糖代謝紊亂及炎癥狀態下,FOXO1會發生細胞核移位從而被激活,激活的FOXO1結合轉錄輔激活因子過氧化物酶體增殖激活受體γ共激活因子1α[9](peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α,PGC1-α),以協調糖異生轉錄程序,可以靶向提高PEPCK、G6pase兩個關鍵酶的基因表達水平來促進糖異生?；钚訤OXO1還與輔阻遏子SIN3A結合,降低GCK的表達,進一步促進葡萄糖輸出[11]。

GCK是己糖激酶的一種,僅存在于肝細胞和胰島β細胞中,具有絕對專一性,其作用是催化葡萄糖生成葡萄糖-6-磷酸(glucose6-phosphate,G6p)。后者是糖原合成酶(glycogen synthase,GS)的底物,也是別構激活劑[12-13],可以促進糖原合酶的激活,提高糖原合成水平。GCK還受血糖濃度影響,在生理條件下,高血糖也可導致葡萄糖激酶從細胞核轉移到細胞質[14],從而促成葡萄糖-G6p流動。GCK催化G6p的生成同時也是有氧氧化的開始,所以GCK同時控制著肝臟葡萄糖的利用與儲存[3]。目前GCK已成為潛在的治療靶點,且已經出現了小分子的激活劑[15]。

本實驗以基因突變的KKay小鼠為2型糖尿病對照,在遺傳易感的基礎上飼以高脂飼料[16],造成外周組織對胰島素敏感性降低,與人類2型糖尿病表現極為相似。實驗結果表明,滋腎丸可顯著降低KKay小鼠的FBG、OGTT AUC及HOMA-IR,PCR顯示滋腎丸可以降低小鼠FOXO1、PEPCK、G6pase基因表達,提高小鼠的GCK基因表達,另外通過PAS染色也證實給藥后肝臟糖原增加。這些證據均提示藥物可能通過降低FOXO1從而上調GCK基因表達、下調糖異生酶基因表達,抑制糖異生及促進肝糖原合成,從而改善肝臟胰島素抵抗,降低血糖水平,可能跟IRS-1-PI3K-Akt2胰島素信號通路有關。PCR結果提示上游IRS-1、PI3K、Akt2基因表達水平改變無統計學意義?？紤]到胰島素在上述位點的作用與轉錄后蛋白磷酸化有關,仍需完善蛋白免疫印跡實驗進一步驗證。此外,滋腎丸復方成分復雜,本實驗只探索了該復方對胰島素通路上的其中一條進行了研究,有可能還涉及到其他的胰島素通路,仍有待進一步探索。