“三法三穴”推拿手法干預早期對MinoCCI模型大鼠脊髓背角IL-17A/RA、C/EBPβ信號通路影響的研究

陳金平 劉志鳳 于天源 王厚融 張英琦 楊震杰 薩出拉 官乾 徐亞靜 張潤龍 張漢鈺 劉家玥 孫佳偉

神經病理性疼痛(neuropathic pain,NP)是由于軀體感覺系統病變或者疾病導致的疼痛[1-2],其發病機制復雜,治療效果欠佳,根據損傷部位可分為周圍型神經病理性疼痛(peripherally-induced neuropathic pain,pNP)與中樞型神經病理性疼痛,其中pNP臨床發病率較高[3]。脊髓背角作為第二級神經元,在pNP后對痛覺、溫度覺信息的傳導以及最終形成痛覺的過程中發揮著極其重要的作用[4]。

推拿在pNP臨床治療中效果確切。課題組前期通過RNA-seq技術探究推拿鎮痛相關機制,發現推拿長期及早期鎮痛可能與白介素-17(interleukin-17)信號通路關系密切[5-6],pNP可引起IL-17信號表達異常。因此,對該通路中的關鍵指標白介素-17A(interleukin 17A,IL-17A)、白介素-17A受體(interleukin-17A receptor, IL-17RA)與轉錄因子CCAAT增強子結合蛋白β(transcription factor CCAAT/enhancer binding protein β, C/EBPβ)進行研究。本研究建立輕度坐骨神經慢性壓迫性損傷(Minor chronic compression injury of sciatic nerve, Minor CCI)模型大鼠,通過機械縮足反射閾值(paw mechanical withdraw threshold,PMWT)與冷敏閾值(cold sensitivity threshold, CST)觀察干預1次后大鼠痛、溫覺的恢復情況,并通過蛋白免疫印跡法(western bolt, WB)檢測L4～6脊髓背角中IL-17A與C/BEPβ表達,通過熒光定量聚合酶鏈式反應(real time-polymerase chain reaction, RT-PCR)檢測IL-17A/RA與C/BEPβmRNA表達,對推拿早期鎮痛啟動機制進行探討。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

雄性SD大鼠24只,體質量(200±10)g,購買于斯貝福(北京)生物科技有限公司,許可證號SCXK(京)2019-0010,飼養于北京中醫藥大學屏障環境動物房[SYXK(京)2020-0033],3只/籠,環境溫度為(25±1)℃,相對濕度(50±5)%,晝夜節律,大鼠自由進食,每周更換墊料2次。實驗程序經北京中醫藥大學動物使用和管理委員會批準(BUCM-4-2022082601-3039),符合動物福利與倫理原則。

適應性飼養1周后,通過電子測痛儀(BIO-EVF5)篩選痛閾值均一的大鼠,并通過隨機數字法將大鼠分為假手術組、模型組和推拿組,每組8只。

1.2 主要儀器與試劑

儀器:按摩推拿手法模擬儀(專利號200710187403.1),VonFrey電子測痛儀(BIO-EVF5,生產廠家BIOSEB),小動物氣體麻醉機(美國SurgiVet公司),電泳儀(美國BIO-RAD公司),MultiSkan3酶標儀(美國Thermo公司),電動組織勻漿器(美國FLUKA公司),Spectra Max Quick Drop型超微量分光光度計(上海美谷分子儀器有限公司),AG 22331 Hamburg PCR擴增儀(德國Eppendorf公司),CFX96TM Optics Module實時熒光定量PCR系統(美國Bio-Rad公司),凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)。

試劑:兔用IL-17A抗體(生產批號:BA11232558)、兔用C/EBPβ抗體(生產批號:AG06299152),彩虹預染蛋白marker(生產批號:BB10198356),以上試劑均訂購于北京博奧森生物技術有限公司;高效組織裂解液(生產批號:20221020),BSA標準品(生產批號:20221009),5×蛋白上樣緩沖液(生產批號:20221110),以上試劑均訂購于北京索萊寶科技有限公司;RNA提取試劑盒(廣州美基生物科技有限公司,生產批號:RLB23-01),cDNA第一鏈合成試劑盒(美國Thermo公司,生產批號:01157375)。

1.3 造模及干預方法

1.3.1 造模 根據課題組前期研究成果進行造模[7],造模前12小時禁食、禁水,模型組與推拿組制備Minor CCI模型大鼠模擬臨床pNP。模型組、推拿組造模方法:使用異氟烷對大鼠進行氣體麻醉,待大鼠完全麻醉后,將大鼠取出并按俯臥位固定在鼠板上,將右側髖股交界區剃毛、消毒;沿坐骨神經體表投影區切1 cm切口,鈍性分離,暴露坐骨神經;在坐骨神經游離處7 mm用鉻制4-0可吸收性外科縫線結扎,結扎度不可過緊,避免影響神經外膜血流,結扎完成后對組織逐層縫合,滴入適量消炎藥與生理鹽水,避免術后傷口感染。假手術組造模:只剝離暴露出坐骨神經,不進行結扎,其余步驟同模型組與推拿組。

1.3.2 干預方法 術后7天開始干預,干預前需適應環境30分鐘,待大鼠安靜后開始干預,干預期間保持安靜。假手術組與模型組:將大鼠仰臥位束縛于鼠板上束縛9分鐘。推拿組:使用按摩推拿手法模擬儀依次對患側殷門穴、承山穴、陽陵泉穴分別實行點、撥、揉法[8],每穴1分鐘/法,參數設置:力度10 N,頻率60次/分鐘。

1.3.3 行為學檢測 分別于造模前、干預前1天以及干預后即刻進行機械刺激及冷板實驗的行為學檢測。

1.3.4 PMWT 通過PWMT對大鼠痛覺敏化程度進行評價。提前20分鐘將大鼠放置于箱底部放置網格鐵絲網透明玻璃箱內,待其停止探索活動后,使用VonFrey電子機械測痛儀,將刺激探頭對準大鼠足底部進行刺激,逐步增加刺激量,每次刺激間隔時長不低于10分鐘,當大鼠出現縮足、舔足時記錄數值。

1.3.5 CST 通過CST對大鼠溫度覺敏化程度進行評價。將大鼠放置于表面溫度為(4±1)℃的冷板上適應5分鐘,上方罩一有機玻璃罩限制其活動范圍,待大鼠停止探尋活動后,記錄其5分鐘內縮足、舔足的次數。大鼠活動及體位變化引起的抬足不記入。

1.4 取材及指標檢測

1.4.1 取材 干預完成,行為學測試完畢后,每組隨機選取6只大鼠,使用濃度為10%的水合氯醛(0.35 mL/100 g)對大鼠進行腹腔注射麻醉,取L4～L6節段脊髓背角。

1.4.2 WB檢測脊髓背角中IL-17A、C/EBPβ的蛋白表達 取適量脊髓背角組織放于EP管中,并加入組織裂解混合液(PMSF∶RIPA=1∶100;樣本重量:組織裂解液=1∶10),將EP管置于冰上,將脊髓組織研磨至肉眼不可見,每次震蕩10分鐘,共4次?；旌弦?℃、12 000 r/min離心20分鐘,吸取上清液,避免吸到沉淀。37℃恒溫培養箱孵育25分鐘,酶標儀檢測吸光度并計算樣本上樣量,加5×蛋白上樣緩沖液并混勻,95℃變性5分鐘。

配12%的分離膠及5%的濃縮膠,上樣后穩定電泳分離膠60V、20分鐘;分離膠80V、90分鐘?？燹D400 mA、25分鐘,快速封閉液封閉20分鐘。根據marker裁膜,一抗(IL-17A 1∶1 000,C/EBPβ 1∶1 000,β-actin 1∶5 000)室溫搖床1小時后,4攝氏度過夜。1×PBST洗膜3次,二抗(辣根酶山羊抗兔Ig G1∶10 000)搖床1小時,顯影液均勻滴在膜上后進行顯影。

1.4.3 RT-PCR檢測脊髓背角中IL-17A、IL-17RA、C/EBPβ的mRNA表達 在超凈臺環境中取適量脊髓背角組織,用組織細胞RNA提取盒對組織RNA進行提取后,使用cDNA第一鏈合成試劑盒將RNA逆轉錄成cDNA后進行擴增。引物序列號:GAPDH上游引物:ATGACTCTACCCACGGCAAG,下游引物:TACTCAGCACCAGCATCACC;IL-17A上游引物:TGCCTGATGCTGTTGCTGCTAC,下游引物:GCGTTTGGACACACTGAACTTTGAG;C/EBPβ上游引物:GCTGAGCGACGAGTACAAGATGC,C/EBPβ下游引物:CTTGTGCTGCGTCTCCAGGTTG;IL-17RA上游引物:CCATAACAGCCGCAGACTATATTCC,下游引物:GCAGATAATCAGCAGGATGACAGAG。擴增完成后根據2-△△Ct法計算相對表達量。

1.5 統計學分析

2 結果

2.1 各組大鼠PMWT結果

PMWT基線:假手術組、模型組與推拿組相比,無顯著性差異(P>0.05);干預前:模型組、推拿組低于假手術組(P<0.01),模型組與推拿組無顯著性差異(P>0.05);干預后:模型組與推拿組低于假手術組(P<0.01),推拿組高于模型組(P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠PMWT結果

2.2 各組大鼠CST結果

CST基線:模型組、推拿組與假手術相比,無統計學差異(P>0.05);干預前:模型組高于假手術組(P<0.01),推拿組高于假手術組(P<0.05);干預后:模型組高于假手術組(P<0.01),推拿組與假手術組無顯著差異(P>0.05),模型組高于推拿組(P<0.01)。見表2。

表2 各組大鼠冷板實驗抬足次數結果次)

2.3 各組大鼠IL-17A、C/EBPβ蛋白表達量比較

IL-17A:干預后,模型組高于假手術組,有顯著性差異(P<0.05),推拿組與假手術組無顯著性差異(P>0.05),模型組高于推拿組,有顯著性差異(P<0.05)。

C/EBPβ:干預后,模型組高于假手術組,有顯著性差異(P<0.05),推拿組與假手術組無顯著性差異(P>0.05),模型組高于推拿組,有顯著性差異(P<0.05)。見表3、圖3。

注:J為假手術組,M為模型組,T為推拿組。

表3 各組大鼠IL-17A、C/EBPβ蛋白表達量

2.4 各組大鼠IL-17A、IL-17RA、C/EBPβ的mRNA表達比較

IL-17A mRNA:干預后,模型組高于假手術組,有顯著性差異(P<0.01),推拿組高于假手術組,有顯著性差異(P<0.05),模型組高于推拿組,有顯著性差異(P<0.05)。

IL-17RA mRNA:干預后,模型組高于假手術組,有顯著性差異(P<0.01),推拿組與假手術組無顯著性差異(P>0.05),模型組高于推拿組,有顯著性差異(P<0.05)。

C/EBPβ mRNA:干預后,模型組、推拿組均高于假手術組,有顯著性差異(P<0.01),模型組高于推拿組,有顯著性差異(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠IL-17A、IL-17RA、C/EBPβ的mRNA結果

3 討論

前期實驗證明,“三法三穴”推拿手法干預后可有效恢復大鼠超微結構,改善自發性疼痛、提高痛閾及溫度覺的恢復等[9-12],但尚不清楚推拿如何啟動鎮痛。本實驗根據前期實驗結果[5-6],驗證IL-17A/IL-17RA/C/EBPβ信號通路在干預1次后即刻的鎮痛作用及其啟動鎮痛的相關機制。根據研究發現,推拿干預1次后可抑制IL-17A、IL-17RA、C/EBPβ mRNA在脊髓背角的表達(P<0.05);同時也可抑制IL-17A、C/EBPβ蛋白在脊髓背角的表達(P<0.05),發揮即刻鎮痛作用。

3.1 Minor CCI模型適合模擬pNP的早期研究

Minor CCI模型模擬臨床pNP,適合短期研究設計。前期研究證實,相較于經典CCI模型,Minor CCI與經典CCI模型在機械縮足痛閾趨勢保持一致,且模型更加穩定,自殘現象更少[7]。而經典CCI模型則會出現不同程度的自殘現象,同時還會產生異常的熱性痛覺亢進,但熱性痛覺過敏并不是臨床中NP的表現之一[13]。因此選擇Minor CCI模型作為本次實驗研究對象,能避免因模型損傷過重,在早期研究中出現效果不明顯的情況,同時本實驗根據臨床患者出現疼痛以及怕冷的臨床表現[14],對機械痛覺以及對冷敏化程度進行研究。

根據行為學結果可以發現,造模后,模型組與推拿組的痛閾值明顯低于假手術組(P<0.01),表現經典,提示造模成功。而在“三法三穴”推拿手法干預1次后,推拿組較模型組在PMWT以及CST可出現較為明顯的改善(P<0.01)。比較有趣的一點是推拿組相較于假手術組的CST無顯著性差異(P>0.05),與PMWT相比,CST數據較不穩定,樣本之間差異較大。針對該結果,主要考慮有以下幾點:首先是個體差異性,個體樣本之間的表現在機械痛閾上隨保持一致,但在對冷的感受上則不一致,該現象與臨床患者表現一致;另一點考慮則是超出推拿即刻鎮痛作用維持的時效,但該觀點還需進一步驗證?；谛袨閷W結果,證實推拿1次既可發揮即刻鎮痛作用又可改善冷敏化狀況。

3.2 IL-17A與NP關系密切

IL-17A主要是由Th17細胞產生,介導炎癥及自身免疫性疾病[15]。IL-17可通過間接招募損傷神經元區域中的免疫細胞,進而釋放炎性因子,參與NP的發生與發展[16-17]。受損區域神經元中IL-17A表達上調的同時,可通過其受體IL-17RA將信號傳遞給感覺神經元,從而促進神經再生[18]。IL-17可直接或間接激活神經系統中小膠質細胞和星形膠質細胞,釋放多種炎癥介質及趨化因子進而對神經元產生損害[19-20]。CCI造模后第3天,背根神經節中C/EBPβ表達升高,可引起自發性疼痛、機械性痛閾以及溫度覺的敏化,而當抑制C/EBPβ的表達時則可緩解其敏化癥狀[21]。C/EBPβ過多表達可促使脊髓小膠質細胞活化,加劇神經炎癥反應[22]。因此,抑制IL-17A/RA的結合及其下游的傳導,可能成為治療pNP新思路[23],但目前還未有相關研究在IL-17A介導的C/EBPβ通路在pNP早期進行研究,因此本實驗基于上述理論進行研究。研究結果顯示,相較于模型組,推拿干預后可抑制脊髓背角中IL-17A/RA表達(P<0.05),并且抑制了下游通路中C/EBPβ mRNA與蛋白的表達(P<0.05),從而發揮即刻止痛的作用,此結果與前人認為的IL-17A/RA為潛在性治療靶點的相關研究成果吻合[24]。因此可以認為推拿干預1次后可通過抑制IL-17A、IL-17RA、C/EBPβ信號通路實現早期鎮痛。

綜上所述,本實驗揭示了“三法三穴”推拿手法干預即刻便可有效緩解因pNP導致的疼痛,其啟動機制與抑制IL-17A、IL-17RA、C/EBPβ信號通路有關。但是本實驗還存在一定局限性,如未驗證干預1次后鎮痛效果的維持時長,尤其是對冷敏化情況的研究。此外,也未對早期鎮痛過程中脊髓背角IL-17A對膠質細胞形態的影響進行研究,后期實驗可從這兩方面入手進一步驗證,為臨床推拿治療pNP提供更多證據,為推拿學的發展提供科學支撐。