基于網絡藥理學和分子對接技術探討黃芪桂枝五物湯治療糖尿病周圍神經病變和類風濕性關節炎“異病同治”的作用機制

王惠敏 王歡歡 馮梅 高源 董瑩瑩 柏冬

黃芪桂枝五物湯原載于《金匱要略·血痹虛勞病篇》,由黃芪、桂枝、白芍、生姜、大棗組成,具有益氣溫經、和血通痹的功效,為治療血痹之常用方劑[1]。據統計,黃芪桂枝五物湯主治病證共52條,痹證有37條,其中又以血痹居多,有28條,其余痹證有痿痹、痛痹、風痹麻木等[2]。

糖尿病性周圍神經病變(diabetic peripheral neuropathy,DPN)是一組以感覺和自主神經癥狀為主要臨床表現的周圍神經病變,西醫常給予控制飲食、適當鍛煉等基礎治療和修復神經、抗氧化應激、改善微循環、改善代謝紊亂等對癥治療[3]。類風濕關節炎(rheumatic arthritis,RA)是一種慢性、破壞性的自身免疫性疾病[4],RA的相關治療以抗炎為關鍵策略[5]。中醫藥在預防疾病及并發癥方面具有許多優勢,尤其在慢性病方面有其獨特的優勢[6]。

中醫藥具有多成分、多靶點的特點,體現了中醫“一方多治”[7]的思想觀念,而網絡藥理學可以從多靶點、多途徑的角度闡釋藥理機制,探索藥物與疾病之間的靶點和通路關系,并在此基礎上闡明中藥的復雜作用機制[8-9]。因此,本研究利用網絡藥理學分析方法,從中醫“異病同治”的角度初步探討黃芪桂枝五物湯治療DPN、RA的作用機制。

1 材料與方法

1.1 黃芪桂枝五物湯活性成分的收集

以黃芪桂枝五物湯中黃芪、桂枝、白芍、生姜、大棗5味藥材為關鍵詞,利用中藥系統藥理學分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP)[10](https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)、TCM Database@Taiwan(http://tcm.cmu.edu.tw/)[11]及文獻檢索收集藥物的主要活性成分。其中,以口服生物利用度≥30%,藥物相似性≥0.18為TCMSP中藥有效成分的篩選參數;以有生物活性和藥理作用報道且含量較高但未符合篩選標準的成分也納入候選活性成分為文獻相關成分篩選標準。將以上數據庫所得的結果合并后進行去重得到相關藥物的活性成分。

1.2 黃芪桂枝五物湯潛在靶點預測

利用TCMSP數據庫對有效活性成分的蛋白靶點預測,并結合蛋白質數據庫(UniversalProtein,UniProt)(https://www.uniprot.org/)[12]數據庫中UniProKBt的檢索功能,校正靶基因名稱;通過PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)[13]數據庫獲得這些成分的Smiles號、2D Structure,然后將Smiles號導入SwissTargetPrediction(http://www. swisstargetprediction.ch/)[14]數據庫,限定研究對象為homo sapiens,以probability>0為卡值進行篩選。將2D Structure以SDF格式下載,導入Pharmmapper(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)[15]數據庫中,設置Norm Fit≥0.9為篩選條件,將篩選的靶點蛋白通過Uniprot數據庫中的ID mapping進行官方名稱校正;將得到的活性成分導入Stitch(http://stitch.embl.de/)[16]數據庫,限定研究對象為homo sapiens,combined score>0.4為篩查標準得到相關靶點。

1.3 疾病靶點的篩選

以“diabetic peripheral neuropathy”和“rheumatic arthritis”為關鍵詞,在線人類孟德爾遺傳數據庫(Online Mendelian Inheritance in Man,OMIM)(http://www.omim.org/)、基因卡(GeneCards)(https://www.genecards.org/)[17]數據庫進行檢索,選擇物種為“Homo sapiens”,搜集DPN和RA相關疾病靶點。

1.4 蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)網絡構建與關鍵靶點篩選

利用STRING平臺數據庫(https://string-db.org/)[18]進行共有靶點的蛋白間相互作用關系,物種設置為“Homo sapiens”,combined score>0.9,將結果利用Cytoscape3.7.2軟件中CytoNCA插件繪制PPI網絡圖,并進行拓撲分析,分析內容包括度中心性(degreecentrality,DC)、介度中心性(betweenness centrality,BC)、特征向量中心性(eigenvetor centrality,EC)、接近中心性(closenesscentrality,CC)、網絡中心性(network centrality,NC)和局部邊連通性(localaverage connectivity,LAC)等5個指標。

1.5 基因本體(Gene Ontology,GO)富集分析、京都基因和基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genesand genomes,KEGG)通路富集分析

為進一步了解黃芪桂枝五物湯異病同治相關生物途徑及機制,采用Hiplot(https://hiplot.com.cn/)數據庫,以P<0.05為篩選條件,選擇物種為“org.Hs.eg.db”進行黃芪桂枝五物湯治療DPN、RA靶基因的GO和KEGG的信號通路富集分析,得到相應的功能分析和信號通路分析數據,使用在線繪圖網站對數據進行可視化,得到富集分析條形圖、氣泡圖。

1.6 “藥物—成分—靶點—通路”網絡構建

將交集靶點與其相關的活性成分和KEGG富集得出的生物通路來源Cytoscape3.7.2軟件構建出“藥物—成分—靶點—通路”網絡。

1.7 黃芪桂枝五物湯中有效活性成分與DPN、RA作用靶蛋白的分子對接驗證

本文通過Pubchem數據庫獲取藥物主要成分的2D結構信息,采用Chem3D軟件中將2D結構轉化為MOL2格式并將其用作配體;同時通過蛋白質結構數據庫(protein data bank,PDB)[19](https://www.rcsb.org/)數據庫下載受體蛋白的3D結構,以PDBQT格式保存。使用Autodock Too1.5.6軟件分別對小分子和靶蛋白進行加氫、去水分子及小分子配體處理,借助PyMOL2.3.4軟件插件找到對接活性位點,即可在Autodock Vina軟件將處理后的成分及靶蛋白進行分子對接,最后通過PyMOL2.3.4軟件將結果進行可視化。

2 結果

2.1 黃芪桂枝五物湯活性成分及篩選的靶點

通過TCMSP、TCM Database@Taiwan及文獻篩選,獲得黃芪桂枝五物湯有效成分122個。其中黃芪29個,白芍29個,桂枝18個,大棗32個,生姜14個,刪重后獲得107個活性成分。

2.2 DPN及RA疾病靶基因收集結果

通過GeneCards、OMIM數據庫搜集DPN、RA相關疾病靶點,去重后獲得DPN疾病靶點共5175個,RA疾病靶點共1155個,將以上兩組疾病靶點與黃芪桂枝五物湯1226個作用靶點進行交集,分別獲得交集靶標690個、295個,見圖1。

注:韋恩圖為黃芪桂枝五物湯靶基因與DPN、RA疾病靶基因交集情況,重疊部分為交集靶基因的數目。

2.3 網絡的構建與分析

2.3.1 DPN 通過STRING數據庫進行PPI,并通過Cytoscape 3.7.2軟件進行可視化分析, 根據CytoNCA分別構建黃芪桂枝五物湯治療DPN與RA的核心基因。 結果顯示, 黃芪桂枝五物湯治療DPN的交集靶點進行拓撲分析, 第一次計算得到DC、BC、EC、CC、LAC、NC的中位數分別為7、265.1110536、0.007323334、0.066040975、2.3666666665、3.333333333,然后再進行第二次計算得到DC、BC、EC、CC、LAC、NC 的中位數分別為19、59.49633452、0.049733732、0.495412844、8.24、9.791666667,根據大于中位數的篩選標準,選出55個關鍵節點(660條線)。見圖2。

注:A黃芪桂枝五物湯干預DPN的PPI蛋白互作網絡圖,圖中節點表示共有靶蛋白,節點度值與顏色的深淺及節點面積呈正相關;B PPI核心靶蛋白前15個度值條形圖。

2.3.2 RA 黃芪桂枝五物湯治療RA的交集靶點進行拓撲分析,第一次計算得到DC、BC、EC、CC、LAC、NC的中位數分別為5、106.3969241、0.015385864、0.110451848、1.625、2.666666667,然后再進行第二次計算得到DC、BC、EC、CC、LAC、NC的中位數分別為12、25.202572975、0.090339437、0.521428571、6.2916666665、7.39488012,根據大于中位數的篩選標準,選出26個關鍵節點(177條線)。見圖3。

注:A 黃芪桂枝五物湯干預RA的PPI蛋白互作網絡圖,圖中節點表示共有靶蛋白,節點度值與顏色的深淺及節點面積呈正相關;B PPI核心靶蛋白前15個度值條形圖。

2.4 GO富集分析和KEGG通路富集分析

2.4.1 DPN 通過對690個預測靶點進行KEGG和GO分析,得到黃芪桂枝五物湯治療DPN的主要途徑和生物學過程(見圖4、5)。結果顯示,在GO富集分析方面,生物過程(biological process,BP)主要涉及了對脂多糖的反應、對氧化應激的反應等過程;細胞組成(cellular component,CC)主要涉及了膜筏、膜微區、膜區等過程;分子功能(molecular function,MF)主要涉及了蛋白酪氨酸激酶活性、配體激活的轉錄因子活性等過程。在KEGG通路富集方面,主要涉及了磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol trikinase/protein kinase B,PI3K/Akt)信號通路、晚期糖基化終末產物(advanced glycosylation end products,AGEs)-糖基化終末產物受體(receptor of AGEs,RAGE)信號通路等。

圖4 黃芪桂枝五物湯治療DPN的GO富集分析

圖5 黃芪桂枝五物湯治療DPN的KEGG富集分析

2.4.2 RA 通過對295個預測靶點進行KEGG和GO分析,得到黃芪桂枝五物湯治療RA的主要途徑和生物學過程(見圖6、7)。結果顯示,在GO富集分析方面,BP主要涉及了炎癥反應的調節、對細菌來源分子的反應等過程;CC主要涉及了膜筏、膜微區、膜區等過程;MF主要涉及了核受體活性、內肽酶活性等過程。在KEGG通路富集方面,主要涉及了腫瘤壞死因子(transforming necrosis factor,TNF)信號通路、Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)信號通路等。

圖6 黃芪桂枝五物湯治療RA的GO富集分析

圖7 黃芪桂枝五物湯治療RA的KEGG富集分析

2.5 “藥物—成分—共有靶點—通路”網絡構建結果

通過Cytoscape 3.7.2軟件構建“藥物—成分—靶點—通路”網絡圖,圖中共有節點863個,邊9337條,根據度值及相關文獻報道,黃芪桂枝五物湯中活性成分含量較高的化合物有黃芪甲苷、芍藥苷、肉桂酸、6-姜酚、棗樹皂苷等,在黃芪桂枝五物湯干預DPN以及RA的過程中起重要作用。見圖8、表1。

注:紅色正方形表示藥物;粉色圓形表示成分;倒立三角形代表靶點,淡綠色表示黃芪桂枝五物湯與DPN交集靶點,綠色表示黃芪桂枝五物湯與RA交集靶點,藍色表示黃芪桂枝五物湯與兩種疾病共有交集靶點;菱形代表通路,紅色表示DPN通路,橘色表示RA通路,黃色表示DPN和RA共有通路;墨綠色正三角形代表DPN和RA兩種疾病。

2.6 分子對接結果

選取每個藥物中含量較高且度值較高的成分,利用分子對接篩選可能的有效成分,故選取黃芪中的黃芪甲苷(Astragaloside IV)、白芍中的芍藥苷(Paeoniflorin)、桂枝中的肉桂酸(Cinnamic acid)、生姜中的6-姜酚(6-gingerol)、大棗中的棗樹皂苷(Jujubasaponin V)這5個成分作為對接成分,分別對應DPN度值排名靠前關鍵靶蛋白Src非受體酪氨酸激酶(Src non-receptor tyrosine kinas,SRC)、信息轉導及轉錄激活因子3(Signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)、絲裂原活化蛋白激酶3(mitogen-activated protein kinase 3,MAPK3)及RA的關鍵靶蛋白相關因子A(related A,RELA)、JUN(Activator protein-1,AP-1)、STAT3進行分子對接驗證。若結合能<0,表明配體分子均能和受體蛋白能自發的結合,結合能<-4.0 kcal/mol,表明其結合良好。其中Jujubasaponin V-MAPK3、JUN、RELA以及astragaloside IV-RELA結合最穩定,均≤-9.6 kcal/mol(見表2、3)。就化合物Jujubasaponin V小分子配體與受體MAPK3大分子蛋白質的結合方式而言,SER-110、GLN-372、LYS-224、TYR-24、ARG-41的氨基殘基與Jujubasaponin V小分子配體形成疏水相互作用(如圖9A);對于Jujubasaponin V小分子配體與受體JUN大分子蛋白質的結合方式而言,ASP-464、ARG-541、GLN-166、ASP-163的氨基殘基與Jujubasaponin V小分子配體形成疏水相互作用(如圖9B);圖9C顯示的是Jujubasaponin V小分子配體與受體RELA大分子蛋白質的結合方式,ASP-53、THR-52、ARG-260、GLU-222、GLN-241、ILE-224的氨基殘基與Jujubasaponin V小分子配體形成疏水相互作用;圖9D顯示的是astragaloside IV小分子配體與受體RELA大分子蛋白質的結合方式,ARG-260、ARG-50、LYS-28、GLN-241、LYS-221、ILE-224的氨基殘基與Astragaloside IV小分子配體形成疏水相互作用。

表3 分子對接得分結果

注:A 綠色為Jujubasaponin V,藍色為MAPK3氨基酸殘基;B 綠色為Jujubasaponin V,藍色為JUN氨基酸殘基;C 綠色為Jujubasaponin V,藍色為RELA氨基酸殘基;D 綠色為Astragaloside IV,藍色為RELA氨基酸殘基。

3 討論

DPN在中醫上屬于消渴病的變證,屬于“血痹”范疇,其基本病機為氣血虧虛,陰陽兩虛,筋脈失養,導致寒、麻、肌萎縮[20-21];RA在中醫上歸屬于“痹證”范疇,機體肝腎虧損、氣血不足等是其發病的內因,風、寒、濕、熱等外邪侵襲是其外因,最終導致氣血痹阻而發為痹[22]。DPN和RA雖為“異病”,但是兩病都具有病程長且久病多虛多瘀的特點,因此兩病的發病過程中伴有氣虛血瘀證,根據中醫理論“證同治亦同”[23], 對于氣虛血瘀證臨床就可以采用補氣活血化瘀的方法。方中黃芪為君,甘溫益氣,補在表之衛氣。桂枝散風寒而溫經通痹,與黃芪配伍,益氣溫陽,和血通經。桂枝得黃芪益氣而振奮衛陽;黃芪得桂枝固表而不致留邪。芍藥養血和營而通痹,與桂枝合用調營衛而和表里,兩藥為臣。生姜辛溫,疏散風邪以助桂枝之力;大棗甘溫,養血益氣以資芪、芍之功;與生姜為伍,又能和營衛,調和諸藥,以為佐使,共奏益氣溫經、和血通痹的功效。

大量的臨床研究表明,補氣活血方治療RA和糖尿病的臨床療效確切,具有減少西藥副作用、提高療效的作用。郭洪濤等[24]通過數據挖掘發現,RA和糖尿病雖然是兩種不同的疾病,但都是以高頻率的補氣活血藥物和祛除瘀血來治療。針對這些癥狀,均采用了益氣溫經、和血通痹的治療方法,證實了兩種疾病在其證候特點的相同點,也推出了兩者“異病同治”的客觀存在性。李征鋒等[25]通過臨床觀察患者治療前后的血糖、關節腫脹和C反應蛋白(C-reactionprotein,CRP)水平,證明降糖藥和抗風濕藥的聯合使用可以提高益氣活血方對RA合并糖尿病患者的臨床療效。這也為本文通過黃芪桂枝五物湯的網絡藥理學和分子對接研究“異病同治”的機制提供了理論依據。

現代藥理研究表明,黃芪桂枝五物湯具有較強的抗炎[26-27]、抗氧化、免疫調節、促進神經修復作用等功效[28]。根據上述分析結果顯示,黃芪桂枝五物湯中的活性成分黃芪甲苷、芍藥苷、肉桂酸、6-姜酚等活性成分含量較高且有較多的靶點富集,在干預疾病中有重要的作用。黃芪甲苷是黃芪的主要活性成分之一,據報道,它能有效降低糖尿病大鼠的血糖及血脂水平,改善抗氧化酶生物活性,減少氧化應激造成的病理性損傷[29],并且可以使巨噬細胞從M1樣表型向M2樣表型再極化促進骨細胞存活,減輕關節炎癥狀、減少炎性細胞因子等作用[30];芍藥苷具有抗炎、抗氧化、抗高血糖等多種生物功能[31],它能抑蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信號的過度激活從而減輕母胎妊娠糖尿病大鼠血糖和胰島素水平的失調[32],并且可以減輕氧化應激,增加細胞增殖和遷移,減少凋亡[33]。楊新偉等[34]研究發現,芍藥苷通過激活DPN小鼠的核因子E2-相關因子2/抗氧化反應元件(nuclear factor-E2 related factor2/antioxidant response element,Nrf2/ARE)通路和B細胞淋巴瘤2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)相關凋亡通路來減輕氧化應激,從而發揮神經保護作用。6-姜酚具有強心、保肝利膽、調血脂、抗血小板凝聚、抗氧化、抗腫瘤等作用[35]。孫立等[36]通過鏈脲佐菌素方法誘導糖尿病小鼠模型發現,姜酚對糖尿病小鼠腎損傷具有良好的保護作用,其作用機制可能與干預NADPH氧化酶源性活性氧(reactive oxygen species,ROS)信號,發揮抗氧化作用密切相關。馬武開等[37]研究發現,姜酚通過下調模型大鼠血清白介素17(interleukin 17,IL-17)和白介素23(interleukin 23,IL-23)的表達,可以使滑膜增生減輕,炎細胞浸潤、水腫改善,達到治療RA的目的。并且6-姜酚、肉桂酸已被證明在各種神經系統疾病中具有抗氧化和抗炎作用,如缺血性腦損傷、奧沙利鉑引起的周圍神經病變等[38-40],為DPN、RA的治療提供積極意義。

PPI網絡顯示了黃芪桂枝五物湯不同靶點之間的相互作用,在這些靶點中,SRC、STAT3、RELA等具有較高度值,可能是治療疾病關鍵的靶點。同時通過分子對接技術對篩選得到的活性成分及靶點進行了驗證,結果顯示黃芪桂枝五物湯在治療DPN時大棗皂苷與MAPK3靶蛋白結合活性最好,在治療RA時大棗皂苷與RELA、 AP-1結合活性最好,提示黃芪桂枝五物湯在干預DPN、RA均發揮著重要作用。STAT3的激活可導致促炎細胞因子的產生和免疫反應增加,通過抑制其可以改善實驗性自身免疫性關節炎的嚴重程度,有助于調節細胞間的平衡[41-42]。并且通過p-KO小鼠相關研究表明,STAT3調節胰島細胞血管內皮生長因子A(vascular endothelial growth factor,VEGF)是內分泌胰腺和胰島微血管網絡的正常發育和維持所必需的[43],在調節細胞命運、炎癥和自身免疫疾病方面發揮著關鍵作用[44]。RELA是核因子κB (nuclear factor-kappa B,NF-κB)家族一個重要的成員,可精準調控NF-κB的轉錄活性,在調節炎癥、腫瘤、代謝以及免疫應答等方面起重要作用[45-46]。由此推測黃芪桂枝五物湯對于DPN、RA的干預涉及多種靶蛋白,這些可能是黃芪桂枝五物湯對于兩者異病同治的潛在治療靶點。

根據KEGG通路富集分析結果,黃芪桂枝五物湯可以通過相同的信號通路和不同的信號通路來治療兩種疾病,它們有一定的相似性和內在關系,但也有不同之處,以便關注不同的方向,為研究提供新的啟迪。首先,在共性方面,在本文中用黃芪桂枝五物湯治療兩種疾病的過程中發現AGEs、RAGE信號通路貫穿始終。AGE-RAGE信號通路中AGE的主要受體(RAGE或AGER)屬于免疫球蛋白超家族[47],它激活多個細胞內信號通路,包括NADPH氧化酶、蛋白激酶C和促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPKs)[48],而且可以在各種類型的細胞和器官中誘導氧化應激和炎癥[49-50]。黃芪桂枝五物湯可減輕DPN的機制可能與阻斷AGEs/RAGE/NF-κB信號通路中組織細胞表面RAGE的表達、抑制NF-κB激活及其引發TNF- α觸發的氧化應激和過度炎癥反應有關,從而避免細胞受損和功能紊亂有關[51]。同時,晚期糖基化終產物受體可激活促炎因子的分泌,導致關節炎癥,并且和炎癥細胞因子結合將進一步激活誘導氧化應激和基質金屬蛋白酶(matrix metallo-proteinase,MMP)的NF-κB通路,這些分子有助于軟骨的進一步降解,增加一般炎癥[52-53]。因此,我們發現黃芪桂枝五物湯可能是通過調節細胞基本功能、抗炎、調整免疫、抗氧化、修復神經等作用參與治療DPN、RA。

其次,它們的特征方向不同。在DPN中,細胞凋亡為DPN發病的重要機制,在DPN病程中伴隨施萬細胞功能紊亂與凋亡、大量周圍神經元凋亡等病理特征[54]。相關研究發現[55],線粒體凋亡途徑在促進DPN的發生中有重要作用,如PI3K/Akt、mTOR、JAK激酶/信號傳導及轉錄激活因子(janus kinase /signal transducer and activator of transcription,JAK/STAT)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38 MAPK)、腺苷酸活化蛋白激酶/過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子-1α(adenylate activated protein kinase/peroxlsome proliferator-activated receptor-γcoactivator-1α,AMPK/PGC-1α)通路經線粒體機制誘導DPN細胞凋亡。近年來研究發現,PI3K/Akt信號通路參與神經元和膠質細胞增殖、凋亡等過程,另外,作為胰島素信號關鍵的下游通路,可調控體內的糖代謝,是高血糖胞內靶點之一,當其表達異常時促進諸多疾病的發生,與DPN的發病密切相關[55-56]。梁俊清等[57]研究發現,在高糖損傷條件下,周絡通提取物Z-6上調nNOS蛋白磷酸化水平,抑制促凋亡因子及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cysteiny laspartate specific 3,Caspase-3)關鍵蛋白酶的表達,降低Schwann細胞凋亡率,從而提高糖損傷細胞的存活率,這些作用與PI3K/Akt通路有關。并且研究證實,胰島素樣生長因子I可以顯著抑制Caspase-9和Caspase-3前體的剪切活化從而抑制高糖影響下細胞的凋亡,這主要是通過PI3K/Akt信號通路發揮其作用的[58]。綜上所述,本文結果分析顯示,PI3K/Akt信號通路富集了大多數的靶基因,是黃芪桂枝五物湯治療DPN的主要途徑,黃芪桂枝五物湯通過激活PI3K/Akt通路,抑制神經細胞凋亡[59]、刺激神經細胞突觸再生[60],從而發揮保護神經作用。

RA屬中醫學“痹證”范疇。其主要病機為肢體筋脈、關節、肌肉、經絡閉塞不通,中醫治療以祛邪通絡、養血活血為法。黃芪桂枝五物湯具有益氣溫經、和血通痹之效,符合本病的病機,在治療上可取得較好療效。同時許多臨床研究亦報道黃芪桂枝五物湯治療RA臨床療效可靠[61]。在本文中,發現黃芪桂枝五物湯的有效成分對應的靶點有一系列炎癥相關因子,如TNF、IL-6、IL-7、IL-2等。KEGG通路分析顯示,TNF信號通路、IL-17信號通路、NOD樣受體(Nod-like receptors,NLRs)信號通路、TLRs信號通路與黃芪桂枝五物湯的炎癥相關。據報道,黃芪桂枝五物湯的有效成分,如黃芪甲苷具有調節免疫、保護心臟、抗炎和抗腫瘤等作用[62]。同時,研究發現黃芪桂枝五物湯中總苷、皂苷、總黃酮對患者機體免疫功能有調節作用[63-65]。這說明黃芪桂枝五物湯可以通過減少炎癥因子、調節免疫等來達到治療RA的目的。

細胞凋亡是RA的發病機制之一[66]。實驗數據表明,通過抑制信號通路或抑制抗凋亡分子的表達來誘導巨噬細胞、滑膜成纖維細胞或淋巴細胞的凋亡,可能對RA有治療作用[67]。并且有相關研究表明,促炎細胞因子TNF-α和白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)在RA患者中刺激滑膜細胞增殖并通過凋亡抑制滑膜細胞死亡。因此,促炎細胞因子導致的細胞凋亡缺陷可能有助于滑膜細胞的生長,最終導致RA患者的增生或血管翳形成和關節破壞[68]。

TLRs信號通路是I型跨膜蛋白受體,TLRs介導免疫的信號轉導途徑中的TLRs/NF-κB信號通路在免疫調節中發揮著極其重要的作用[69]。已經有很多研究者發現多種TLRs在RA和實驗性關節炎的滑膜組織、成纖維細胞樣滑膜細胞(fibroblast-like synovial cells,FLS)、滑膜組織中的巨噬細胞和血單核細胞等細胞中高表達,同時也發現了在關節局部存在著一些TLRs的內源性配體[70]。其中,TLR2和TLR4在RA的發病中起重要作用。小鼠關節炎模型研究表明,早期階段通過活化TLR2,促進血管發生炎癥細胞黏附與侵襲,活化的TLR4在發病后期增加金屬蛋白酶介導的破骨細胞形成[71]。髓樣分化因子88是存在于所有TLRs信號轉導通路中的一個關鍵的接頭蛋白,對TLR4和IL-1R信號起負性調控作用[72]。根據本文KEGG結果顯示,此信號通路在黃芪桂枝五物湯治療RA中起到關鍵作用。

TNF信號通路是黃芪桂枝五物湯治療RA的主要途徑,主要涉及炎癥反應、細胞免疫、腫瘤免疫等方面[73]。據報道,黃芪桂枝五物湯通過下調TNF-α誘導的人類風濕關節炎成纖維樣滑膜細胞中的胱天蛋白酶3(Recombinant Caspase 3,CASP3)、TNF、RELA和B細胞編碼κ輕鏈多肽基因抑制激酶B(inhibitor of kappa light polypeptidegene enhancer in B-cells,kinase beta,IKBKB)蛋白表達,從而發揮抑制炎癥反應、調節免疫功能及調控細胞凋亡的作用[74]。據報道,過量的TNF-α不僅可以使其信號通路發生異常,還可以和其他促炎性細胞因子刺激破骨細胞分化和活化,而引起骨丟失,刺激滑膜成纖維細胞和軟骨細胞產生降解軟骨的蛋白酶[75],導致RA患者滑膜中免疫細胞的活化、滯留和生存等,最終導致關節和軟骨的破壞[76]。綜上所述,黃芪桂枝五物湯治療RA有效?，F代藥理研究表明,黃芪桂枝五物湯具有良好的抗炎、調節免疫活性及抗細胞凋亡。本文的網絡藥理學研究也顯示了黃芪桂枝五物湯對RA炎癥因子和通路的廣泛作用。

總之,黃芪桂枝五物湯通過網絡藥理學研究,根據其治療DPN、RA等病的共同機制,理解“同治異病”的策略,試圖揭示“異病同治”的科學內涵,也說明了黃芪桂枝五物湯可以通過相同的通路及不同的通路治療兩種疾病。兩者有一定共性,并具內在聯系,但也有不同之處,以便側重方向的不同,為研究提供新的啟示。

在本文中,以黃芪桂枝五物湯的益氣溫經、和血通痹作用為例,了解中醫“同治異病”的策略。黃芪桂枝五物湯對DPN、RA的治療作用主要是通過對AGE-RAGE信號通路整體調節來實現的,但對不同的病變有不同的側重。DPN的治療主要依靠抑制神經細胞凋亡、刺激神經細胞突觸再生,從而發揮保護神經作用。而RA的治療往往依賴TNF信號通路、Toll樣受體信號通路等炎癥相關通路的調控,減少炎癥因子、調節免疫。結果表明,黃芪桂枝五物湯通過多靶點、多途徑的復雜調控,達到了“異病同治”的效果,可為中醫藥關于“異病同治”研究提供一定的啟示。但由于目前網絡藥理學的研究仍有局限性,后續仍需要進行體內、外實驗驗證,以進一步確認本文預測結果的準確性。