基于代謝組學技術探究針灸抑制腹瀉型腸易激綜合征模型大鼠腸道炎癥反應的作用機制

邱宇馳 韓紅偉 張家瑋 付伊萌

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome,IBS)是影響著全世界高達10%的人口的功能性胃腸道疾病[1]。在我國,主要以腹瀉型腸易激綜合征(irritable bowel syndrome with predominant diarrhea,IBS-D)亞型發病為主。針灸在防治IBS顯現出獨特的優勢[2],整體調護且綠色安全。研究發現,IBS主要的發病機制之一是腸道低度黏膜炎性反應[3]。目前已有研究指出IBS模型大鼠結腸組織出現病理學改變[4-6]。研究證實電針可改善IBS-D體重增長率,亦可降低結腸黏膜組織炎性因子含量亦有一定的功用[7-8],但內在機制仍不明確。

代謝組學技術屬于系統生物學,能夠將人作為一個整體,研究疾病的發生發展和治療作用的內在機制,其分析思維與中醫的整體思維極度相似?，F已有研究者通過代謝組學技術分析IBS模型大鼠的糞便、腸道微生物從而探究中醫藥防治IBS的內在效應機制[9]。前期本團隊的研究發現針灸能通過調節血清代謝物,影響代謝通路從而抑制炎癥反應,發揮防治IBS的作用[10]?；诖?本實驗將從結腸代謝模式為切入點,采用代謝組學技術,分析篩選結腸組織代謝物及其代謝途徑,探究針灸抑制IBS腸道炎癥反應的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及實驗環境

從三峽大學實驗動物中心購進的SPF級3月齡雄性SD大鼠45只,體質量(300±20)g,許可證號:SCXK(鄂)2017-0012。在武漢體育學院飼養,SPF級環境條件控制為溫度(22±2)℃、濕度(50±10)%,光照明/暗周期為12/12小時[11]。適應性喂養1周,期間自由飲食、飲水。動物實驗倫理審核批準號:00287500。本研究所有動物實驗流程嚴格按照國家科技部2006年發布的《關于做好實驗動物實驗操作工作的指導意見》執行。

1.2 主要儀器與試劑

戊巴比妥鈉(Sigma),多聚甲醛(國藥集團),異氟醚(阿拉丁),PBS溶液(ASPEN),一次性針灸針(0.30 mm×13mm,華佗牌),Rat TNF-α ELISA Kit (ELK Biotechnology,ELK1396),Rat IL-6 ELISA Kit(ELK Biotechnology,ELK1158),Rat IL-1β ELISA Kit(ELK Biotechnology,ELK1272),甲醇(Merck),乙腈(Merck),甲酸(Aladdin),二氯苯丙氨酸(BioBioPha/Sigma-Aldrich),蘇木素(Sigma),伊紅Y(水溶性)(國藥集團),包埋石蠟(國藥集團),中性樹膠(國藥集團)。

酶標儀(Diatek公司,DR-200Bs),冷凍離心機(湖南湘儀實驗室儀器,TGL-16),制冰機(常熟市雪科電器有限公司,IMS-20),臺式離心機(上海安亭科學儀器廠,TGL-16c),水浴鍋(金壇市江南儀器廠,HH-W-600),石蠟切片機(德國Leica RM 2016輪轉式切片機),光學顯微鏡(奧林巴斯BX53型生物顯微鏡),超高效液相色譜(Ultra Performance Liquid Chromatography,UPLC)(ExionLC AD),四級桿飛行時間質譜(Quadrupole-Time of Flight)(TripleTOF 6600, AB SCIEX),串聯質譜(Tandem mass spectrometry,MS/MS)(QTRAP?),離心機(Eppendorf),恒溫金屬混勻儀(杭州米歐儀器有限公司),顯微鏡(奧林巴斯BX53型生物顯微鏡)。

1.3 模型制備

45只SD大鼠隨機分為對照組、模型組、針灸組,每組15只。對照組大鼠不做任何的處理。模型組、針灸組大鼠通過急、慢性應激相結合方法進行IBS-D模型制備[6]。采取缺水24小時、剝奪食物24小時、痛苦的夾尾巴1分鐘、45℃水中接觸5分鐘、在4℃水中游泳3分鐘、晝夜倒置12/12小時、水平振動(120 r/min)45分鐘等7種不同壓力源,以抓鬮的方式,每天隨機選擇2種壓力源進行造模,持續3周,其中連續2天保證無重復特定的壓力源,若抓鬮的壓力源重復則重新抓取,共21天。1周的休息之后,在第28天采取急性束縛應激方法,包裹大鼠的肩部、上肢前肢和胸廓1小時。當天測定內臟疼痛閾值,若模型組大鼠內臟疼痛閾值高于對照組(P<0.05),則提示造模成功[12]。

1.4 干預方法

針灸組大鼠在每日造模前,穿上自制合身的鼠衣,采用針灸干預“內關”“足三里”“關元”三穴,參照《實驗動物常用穴位名稱與定位》[13]。使用0.30 mm×13mm華佗牌毫針直刺,針刺得氣后進行手法行針,平補平瀉,頻率120次/分鐘,每隔4分鐘行針1分鐘;懸掛并進行艾灸,自制艾條長12 cm,直徑7 mm,用支架固定,置于穴位旁2～3 cm,保證大鼠在平靜的狀態下,留針及艾灸時間為15分鐘,每日1次,共28日。

1.5 檢測指標

1.5.1 稀便率測定 三組大鼠在造模前和干預后均進行稀便率測定比較。測定方法如下:將各組大鼠單獨放置在籠底為不銹鋼網格的籠具中飼養,墊有濾紙的托盤放置在網格下,每隔1小時更換濾紙,記錄大鼠糞便總粒數、稀便粒數,以濾紙上有無污跡區分干稀便,總時長為6小時。稀便率(%)=稀便粒數/糞便總粒數×100%[14]。

1.5.2 ELISA法檢測血清、結腸黏膜腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素(interleukin,IL)-6、IL-1β含量 實驗第29天,對大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉(0.2 mL/100 g)[15]進行麻醉,然后打開腹腔,采集5 mL大鼠腹主動脈血,標本血放置在4℃離心機上,3 000 r/min,離心20分鐘,然后取上層血清,-20℃保存,待測。取血后,找到大鼠結腸段并進行分離,用生理鹽水洗去內容物,剝離并洗凈腸道黏膜,-20℃保存,待測。按照ELISA試劑盒說明書測定血清、結腸黏膜TNF-α、IL-6、IL-1β含量。

1.5.2 結腸病理學觀察 麻醉后,打開腹腔,找到大鼠結腸段并進行分離,用生理鹽水洗去內容物,清理腸道黏膜,4%多聚甲醛中固定、石蠟包埋、切片烤片(厚度一般為4 μm)、脫蠟、蘇木素—伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色,最后風干鏡檢,用奧林巴斯BX53型生物顯微鏡進行觀察大鼠結腸組織的病理學改變。

1.5.3 結腸轉運功能的測定 實驗第28天,三組大鼠各隨機取6只在干預結束后給予24小時禁食,再予以異氟醚進行麻醉處理,在大鼠距肛門3 cm直腸內放入直徑3 mm的玻璃小球。待大鼠蘇醒后,立即放入籠內墊有干凈濾紙的籠具,然后喂食飲水。記錄從大鼠蘇醒至玻璃小球排出的時間[16]。

1.5.4 結腸代謝組學檢測 (1)樣本處理:從三組大鼠各隨機取6只用于結腸組織代謝組學檢測。同1.5.2步驟取結腸組織,用PBS洗干凈,液氮淬滅并存入-80℃冰箱中。檢測時,先從-80℃冰箱中取出樣品,在冰上解凍并進行后續操作,取出樣本,用濾紙吸掉樣本表面的血液,用手術刀切下一塊樣本,用鑷子夾到去皮后的EP管中,稱量(50±2)mg,并記錄重量;向稱量好的樣本中加入一粒鋼珠,在30 Hz的條件下勻漿4次,每次30秒;在勻漿好的離心管中滴入1 mL70%甲醇內標提取液;振蕩5分鐘,冰上靜置15分鐘;在4℃條件下,12 000 r/min離心10分鐘;離心后吸取上清液400 μL,放入對應的EP管中;靜置于-20℃冰箱,過夜;在4℃條件下,12 000 r/min再離心3分鐘;離心后,取上清200 μL裝到對應的樣瓶內襯管中。然后上機分析。

(2)TM廣靶檢測技術:TM廣靶是將非靶(高分辨、廣覆蓋)與廣靶(高靈敏、精定量)結合。首先用高分辨四級桿飛行時間質譜(Quadrupole-Time of Flight)對樣本進行二級譜掃描,提取MRM離子對信息,再整合廣靶庫,例如邁維自建庫,公共數據庫HMDB、MoNA、MassBank、METLIN、NIST、MetDNA,對高分辨中的物質進行定性,隨后對定性的物質離子對和RT(Retention time)轉移到LC-MS上進行數據采集,得到峰面積,構建樣本的特異性數據庫,最后利用三重四極線性離子阱質譜儀(QTRAP)對庫中物質開展MRM精準檢測[10]。

(3)數據處理與分析:采用軟件R進行PCA分析,軟件MetaboAnalyst R (R)進行偏最小二乘判別分析(partial least squares discrimination analysis,OPLS-DA),分析代謝物,并通過京都基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)數據庫找到富集代謝通路。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 大鼠稀便率比較

造模前,各組大鼠之間稀便率無明顯差異。造模后,模型組與對照組比較,稀便率顯著升高,差異有統計學意義(P<0.05);針灸組與模型組比較,稀便率顯著降低,差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組IBS-D模型大鼠造模前后稀便率情況

2.2 大鼠血清、結腸黏膜TNF-α、IL-6、IL-1β含量比較

模型組與對照組比較,血清TNF-α、IL-6、IL-1β含量均顯著升高,差異有統計學意義(P<0.01);針灸組與模型組比較,血清TNF-α、IL-6、IL-1β含量均顯著下降,差異有統計學意義(P<0.05,P<0.05,P<0.01),見表2。

表2 各組IBS-D模型大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β含量比較

模型組與對照組比較,結腸黏膜TNF-α、IL-1β含量均顯著升高,差異有統計學意義(P<0.05);模型組與對照組比較,結腸黏膜IL-6含量差異無統計學意義(P>0.05)。針灸組與模型組比較,結腸黏膜TNF-α、IL-6、IL-1β含量差異均無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組IBS-D模型大鼠結腸黏膜TNF-α、IL-6、IL-1β含量比較

2.3 大鼠結腸組織病理學情況

鏡下觀察可見對照組大鼠結腸黏膜層有少量炎癥浸潤,腺體數量豐富,輕微損傷(藍色箭頭);模型組大鼠結腸可見明顯黏膜層厚度變薄,較多腺體消失,局部可見明顯腺體損傷,同時可見較多細胞核固縮胞體消失,空洞明顯(紅色箭頭);針灸組大鼠結腸有較多炎癥細胞浸潤于黏膜層頂端,少量腺體損傷(黃色箭頭)。見圖1。

注:A 對照組;B 模型組;C 針灸組。

2.4 大鼠結腸動力結果比較

模型組與對照組比較,玻璃小球排出時間顯著縮短,差異有統計學意義(P<0.05);針灸組與模型組比較,玻璃小球排出時間顯著延長,差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 各組IBS-D模型大鼠結腸動力結果比較

2.5 結腸代謝組學多元化分析

2.5.1結腸PCA分析 將對照組、模型組、針灸組樣品中的所有代謝物的含量采用PCA進行分析,如圖2。對照組、針灸組組內聚集情況良好,模型組有少量離散值,說明三組數據較為穩定。模型組與對照組比較結果顯示第一主成分(PC1)可以解釋原始數據24.81%特征,可以發現在第一主成分發生分離;模型組與針灸組比較顯示第二主成分(PC2)可以解釋原始數據15.31%特征,可以發現在第二主成分發生分離,但是組間差異不明顯,可能受取樣的不確定因素,還有個體差異的影響,因此進一步做OPLS-DA進行模型評價。

注:A 對照組與模型組比較的PCA得分圖;B 模型組與針灸組比較的PCA得分圖。

2.5.2 結腸OPLS-DA分析 正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)結合了正交信號矯正(OSC)和PLS-DA方法,能夠將X矩陣信息分解成與Y相關和不相關的兩類信息,通過去除不相關的差異來篩選差異變量。根據OPLS-DA模型分析代謝組數據,去除不相關的差異來篩選差異變量,評價模型的穩定性。模型組與對照組、針灸組與模型組比較分析為有效的模型。結果顯示模型組與對照組、針灸組分離明顯。見圖3。

注:A 對照組與模型組比較的OPLS-DA得分圖及模型評價;B 模型組與針灸組比較的OPLS-DA得分圖及模型評價。

2.5.3 差異代謝物篩選 從PCA、OPLS-DA分析對照組、模型組、針灸組樣本比較所測的代謝物,然后進行單變量統計分析,比較兩組樣本代謝物的差異性,選取fold change≥2和fold change≤0.5且VIP≥1的代謝物,為差異顯著。模型組與對照組比較,差異代謝物有1183個,下調37個,上調69個;針灸組與模型組比較,差異代謝物有1260個,下調13個,上調15個。通過火山圖(Volcano Plot)進行可視化展示如圖4。

注:A 對照組與模型組比較差異代謝物;B 模型組與標本配穴組比較差異代謝物?；鹕綀D中的每一個點表示一種代謝物,橫坐標表示某代謝物在兩樣品中定量差異倍數的對數值;縱坐標表示VIP值。圖中綠色的點代表下調差異表達代謝物,紅色的點代表上調差異表達代謝物,黑色代表檢測到但差異不顯著的代謝物。

2.5.4 篩選相同差異代謝物 對照組與模型組、模型組與針灸組共有6個相同的差異代謝物。與對照組比較,模型組的代謝物肉堿C13:0上調,肉堿C7:DC水平下調,L-苯丙氨酸-L-亮氨酸水平上調,環(酪氨酸-亮氨酸)水平上調,甘油2-磷酸水平下調;與模型組比較,針灸組代謝物肉堿C13:0水平下調,肉堿C7:DC水平上調,L-苯丙氨酸-L-亮氨酸水平下調,環(酪氨酸-亮氨酸)水平下調,甘油2-磷酸水平上調。見表5。

表5 三組IBS-D模型大鼠對比相同的差異代謝物

2.5.5 代謝通路分析 將差異顯著代謝物按照KEGG中通路類型進行分類及富集,其中模型組與對照組對比差異代謝通路有2條(P<0.05),分別是色氨酸代謝、類固醇激素生物合成。針灸組與模型組對比差異代謝通路有1條(P<0.05),是卟啉與葉綠素代謝。見圖5。

注:A 對照組與模型組比較差異代謝物KEGG富集圖;B 模型組與針灸組比較差異代謝物KEGG富集圖。橫坐標為每個通路對應的Rich factor,縱坐標為通路名稱,點的顏色代表p-value,越紅表示富集越顯著。點的大小代表富集到的差異代謝物的數量。

3 討論

研究證明,無論是結腸的神經叢神經元的改變[17],還是微生物的變化[18],或是基因的改變[19]等多個層面,均參與了IBS的發病機制。本研究通過觀察稀便率、炎性因子含量、結腸動力,發現針灸后,大鼠稀便率降低,血清炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β含量降低,結腸組織黏膜層僅見少量的炎癥細胞,提示針灸能夠改善腹瀉癥狀并抑制炎癥反應。有趣的是,針灸并未通過降低大鼠結腸黏膜TNF-α、IL-6、IL-1β含量發揮抗炎作用,因此本團隊進一步利用代謝組學技術分析結腸的差異代謝物及代謝通路。本研究發現三組對比相同的差異代謝物中除曲二糖之外,其他代謝物在模型組與針灸組的趨勢相反。說明針灸能夠通過調節肉堿C13:0、肉堿C7:DC、L-苯丙氨酸-L-亮氨酸、環(酪氨酸-亮氨酸)、甘油2-磷酸的水平,發揮抗炎的作用。

據研究報道,肉堿穩態與糖尿病、慢性腎功能衰竭、乳糜瀉、心血管疾病、炎癥性腸病等疾病的發生發展有關[20]。在不同的研究中也證實了肉堿與抑郁癥、雙相情感障礙和其他精神疾病的相關性[21-22]。提示針灸可能通過調節肉堿穩態在抑制炎癥反應和改善情感狀態兩個方面發揮防治IBS的作用。對冠心病心血瘀阻證的研究發現,隨著L-苯丙氨酸和L-異亮氨酸含量的下降,氨基酸的轉運和代謝將會受到影響[23-24]。氨基酸代謝異常是IBS發病機制“腦—腸”軸異常的重要影響因素,關乎著外周和中樞的神經反應,影響IBS臨床癥狀。此外,L-苯丙氨酸-L-亮氨酸水平還可以影響血管新生[25]。提示針灸可能通過調節L-苯丙氨酸和L-異亮氨酸含量影響氨基酸代謝,維持血管穩態,調節神經反應,改善IBS臨床癥狀。研究發現,甘油2-磷酸也多與血管的鈣化有關[26]。因此,本團隊推測針灸可能是通過調節肉堿C13:0、肉堿C7:DC、L-苯丙氨酸-L-亮氨酸、環(酪氨酸-亮氨酸)、甘油2-磷酸的水平,影響肉堿穩態和氨基酸代謝,從而調節神經反應,維持血管穩態,抑制炎癥反應。

通過KEGG代謝通路分析發現,IBS-D大鼠結腸的代謝通路主要涉及色氨酸代謝通路和類固醇激素生物合成。針灸干預后,發現差異代謝物主要是參與了卟啉與葉綠素代謝通路。卟啉與葉綠素代謝參與人體很多生理功能,但對卟啉與葉綠素代謝代謝與消化系統疾病相關性的研究報道不多。Khaled等報道卟啉代謝紊亂可能會干擾與自閉癥神經系統表型相關的病理學,糞卟啉和前丙哌啉可用作自閉癥患兒可能的生物標志物[27]。Katarzyna等報道褪黑激素對24日齡苜蓿幼苗在百草枯誘導的氧化應激期間會影響葉綠素代謝[28]。提示針灸可能通過調節卟啉與葉綠素代謝通路,影響神經系統,抑制氧化應激反應,從而改善IBS臨床癥狀。

精神心理因素是IBS的重要病因之一,已被專家達成共識[29]。中醫學認為IBS屬于“腸郁”范疇。筆者分析該病的病機為心神失調,腸腑失司。在中醫治病求本思想和標本理論的指導下,采用標本配穴法,選擇“關元”“足三里”固護先天、后天之氣,固護腸腑;選擇“內關”祛除邪氣,調養心神,標本兼治。由于針刺聯合艾灸療效高于單純的針灸或者艾灸[30],因此本研究采用的針灸并用防治IBS。本研究證實了針灸能夠通過調節結腸組織卟啉與葉綠素代謝通路,調節肉堿C13:0、肉堿C7:DC、L-苯丙氨酸-L-亮氨酸、環(酪氨酸-亮氨酸)、甘油2-磷酸代謝物含量,抑制炎癥反應。推測針灸抑制炎癥反應可能是通過參與神經傳導反應,改善精神狀態,從而調節炎性因子。

不同于前期采用代謝組學技術分析標本配穴針灸對IBS-D大鼠血清代謝物及代謝通路的研究結果,此次的研究從結腸的角度初步發現了針灸防治IBS的重要靶標。針灸不僅能夠通過這些靶標調節免疫,抑制炎癥反應,從而減輕IBS腹瀉腹痛的臨床癥狀,更有可能這些靶標參與結腸相關的神經傳導反應,改善了精神心理狀態,從而發揮防治IBS的作用。本研究所得結果為針灸通過調控“腦-腸”軸防治IBS提供了實驗依據,為臨床防治IBS提供新的治療思路。但這些靶標如何參與發揮的內在作用機制仍需進一步更深入的研究。