超分子水楊酸對兔耳痤瘡模型p38MAPK/NF-κB信號通路的影響

楊力 劉尚可 林新瑜 羅霞 肖媛媛

[摘要]目的：探究超分子水楊酸對兔耳痤瘡模型p38MAPK/NF-κB信號通路的影響機制。方法：將30只實驗兔隨機分成正常對照組、2%超分子水楊酸（Salicylic acid，SA）組、30%SA組、夫西地酸組、模型對照組，每組6只，并予以相應外用藥物干預，連續4周，并分別于用藥2周后、用藥4周后檢測p38MAPK、NF-κB、IL-1β、IL-8蛋白的表達。結果：結果顯示，隨著用藥時間的延長，各組的p38MAPK、NF-κB、IL-1β、IL-8均呈下降趨勢。用藥前，各組間p38MAPK、NF-κB、IL-1β、IL-8蛋白表達均差異無統計學意義（P＞0.05）。用藥2周后，2%SA組、30%SA組、夫西地酸組p38MAPK、NF-κB、IL-1β、IL-8低于模型對照組（P＜0.001）；三個用藥組之間p38MAPK、NF-κB、IL-1β兩兩比較差異無統計學意義（P＞0.05）；2%SA組IL-8低于30%SA組、夫西地酸組（均P＜0.05）；30%SA組與夫西地酸組IL-8差異無統計學意義（P＞0.05）。用藥4周后，三個用藥組p38MAPK、NF-κB、IL-1β、IL-8低于模型對照組（P＜0.05）；2%SA組、30%SA組p38MAPK、NF-κB、IL-8低于夫西地酸組（P＜0.05），2%SA組IL-8低于30%SA組（P＜0.05）；2%SA組與30%SA組p38MAPK差異無統計學意義（P＞0.05）；2%SA組、30%SA組與夫西地酸組IL-1β均差異無統計學意義（均P＞0.05）；2%SA組IL-1β低于30%SA組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。結論：超分子水楊酸可通過抑制p38MAPK/NF-κB信號通路來發揮抗炎作用，且隨著用藥時間的延長療效也在逐漸增加，并優于夫西地酸。

[關鍵詞]痤瘡；兔耳痤瘡模型；超分子水楊酸；抗炎；p38MAPK/NF-κB信號通路

[中圖分類號]R758.73+3? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2024）03-0001-05

Effect of Supramolecular Salicylic Acid on p38MAPK/NF-κB Signaling Pathway in Rabbit Ear Acne Models

YANG Li1，LIU Shangke2，LIN Xinyu3，LUO Xia1，XIAO Yuanyuan1

（1.Department of Dermatology，Affiliated Hospital of Southwest Medical University，Luzhou 646000，Sichuan，China; 2.Medical School，University of Electronic Science and Technology of China，Chengdu 611731，Sichuan，China; 3.Institute of Dermatology and Venereology，Sichuan Academy of Medical Sciences，Sichuan Provincial People's Hospital，Chengdu 610072，Sichuan，China）

Abstract： Objective? To explore the effect of supramolecular salicylic acid on p38MAPK/NF-κB signaling pathway in rabbit ear acne model. Methods? Divided thirty experimental rabbits into normal control group， 2%SA group， 30%SA group， fusidic acid group and model control group（There were 6 rabbits in each group） randomly. Gave corresponding external drug intervention for 4 weeks. Detected the expressions of p38MAPK， NF-κB， IL-1β and IL-8 after 2 weeks and 4 weeks. Results? Result display， P38MAPK， NF-κB， IL-1β， and IL-8 of each group showed a downward trend after treatment. Before treatment， there were no significant differences in expression of p38MAPK， NF-κB， IL-1β and IL-8 among groups （P＞0.05）. After 2 weeks of treatment， p38MAPK， NF-κB， IL-1β， and IL-8 of 2% SA group， 30% SA group and fusidic acid group were lower than model control group （P＜0.001）. There were no significant differences in p38MAPK， NF-κB， and IL-1β （P＞0.05）. IL-8 of 2% SA group was lower than 30% SA group and fusidic acid group （all P＜0.05）. There was no significant difference in IL-8 between 30% SA group and fusidic acid group （P＞0.05）. After 4 weeks of treatment， p38MAPK， NF-κB， IL-1β， and IL-8 of three treatment groups were lower than model control group （P＜0.05）. p38MAPK， NF-κB， IL-8 of 2% SA group and 30% SA group was lower than fusidic acid group （P＜0.05）， IL-8 of 2%SA group was lower than 30%SA group （P＜0.05）. There was no significant difference in p38MAPK between 2%SA group and 30%SA group （P＞0.05）. 2% SA group， 30% SA group and fusidic acid group had no significant difference in IL-1β （all P＞0.05）. 2%SA group IL-1β was lower than 30%SA group， the difference was Statistical significance （P＜0.05）. Conclusion? Supramolecular salicylic acid can exert an anti-inflammatory effect by inhibiting the p38MAPK/NF-κB signaling pathway， and the curative effect gradually increases with the prolongation of medication time， and is superior to fusidic acid.

Key words： acne; rabbit ear acne models; supramolecular salicylic acid; anti-inflammatory; p38MAPK/NF-κB signaling pathway

尋常痤瘡是發病率極高的慢性炎癥性皮膚病，為全球八大流行病之一，共計約9.4%的人口受累[1]。目前其公認的發病機制中包括毛囊漏斗部角化過度、P.acnes繁殖、皮脂分泌過度、炎癥反應及宿主的免疫反應、性激素變化及精神心理等因素[2]。其中P.acnes引起的炎癥反應在痤瘡發病機制中至關重要。組織病理、免疫以及臨床研究等多方面均已經證實炎癥反應參與了痤瘡整個發病周期，組織病理甚至證實痤瘡患者正常皮膚也已經存在炎癥反應[3-4]，但由于該病理過程涉及了一系列由細菌及生化反應引起的細胞增殖異常和免疫微環境功能紊亂，故其具體的分子機制目前仍不清楚。有部分學者提出p38MAPK/NF-κB信號通路與P.acnes誘導的炎癥因子產生相關[5]。本研究旨在探討超分子水楊酸對兔耳痤瘡模型的療效及其抗炎機制，擬初步探究超分子水楊酸對p38MAPK/NF-κB信號通路的影響。

1? 材料和方法

1.1 實驗動物：12周齡健康雄性新西蘭兔30只，體重2.0～2.2 kg，由西南醫科大學實驗動物中心提供，質量合格證號：No.0044147。生產許可證號：SCXK（川）2018-17。

1.2 主要實驗試劑：痤瘡丙酸桿菌標準菌株（廣東省微生物研究所菌種保藏中心）、VITEK MS-CHCA基質液（法國生物梅里埃公司）、組織標本固定液（國藥集團化學試劑有限公司）、兔p38MAPK、NF-κB、IL-1β、IL-8抗體（北京博奧森生物技術有限公司）、山羊抗兔工作液、山羊血清封閉液、濃縮型DAB試劑盒（北京中杉金橋生物有限公司）、夫西地酸乳膏（香港澳美制藥廠有限公司，國藥準字H20243096）、2%超分子水楊酸調理凝露（四川亞姿宣生物科技有限公司，滬G妝網備字2017012089）、30%超分子水楊酸煥顏面膜（四川亞姿宣生物科技有限公司，滬松械備20170017號）。

1.3 主要實驗儀器：MALDI-TOF MS 質譜儀（法國生物梅里埃公司）、TSJ-Ⅱ型全自動封閉式組織脫水機（常州市中威電子儀器有限公司）、BMJ-Ⅲ型包埋機（常州郊區中威電子儀器廠）、PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀（常州市中威電子儀器有限公司）、BA400Digital數碼三目攝像顯微鏡（麥克奧迪實業集團有限公司）、圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0（美國Media Cybernetics公司）。

1.4 實驗方法：將30只實驗兔隨機分成正常對照組、2%SA組、30%SA組、夫西地酸組、模型對照組，每組6只。正常對照組不做任何處理，其余四組參照Kligman法[6]構建兔耳痤瘡模型，用玻璃棒蘸取煤焦油并均勻涂在雙耳內側面耳管開口處，范圍約2 cm×2 cm，每次約0.5 ml，每日1次，連續14 d。造模第7天時，皮下多點注射P.acnes菌懸液約50微升/耳（濃度：0.5麥氏比濁單位）。造模結束后，對造模組兔耳造模處行組織病理檢查，鏡下確認造模成功后開始外用藥物干預。動物實驗經過筆者醫院倫理委員會審批。

1.4.1 干預方法：各組干預方法具體如下。2%SA組：外用2%超分子水楊酸調理凝露，每日1次，連續4周；30%SA組：外用30%超分子水楊酸煥顏面膜，每周1次，每次待藥物發揮作用15 min左右即用清水將其洗凈，連續4次；夫西地酸組：外用夫西地酸乳膏，每日1次，連續4周；模型對照組：外用生理鹽水，每日1次，連續4周。

1.4.2 取材方法：分別在造模結束后、用藥2周后、用藥4周后進行實驗兔處死取材。先剃除兔耳耳背的兔毛，再從耳緣靜脈快速注射10 ml空氣處死后用直徑5 mm打孔器鉆取全層皮膚，無菌紗布拭干血液，經4%多聚甲醛溶液固定。

1.4.3 組織病理學觀察：將病理切片經脫水、透明、浸蠟與包埋、切片脫蠟、HE染色后于電子顯微鏡下觀察。

1.4.4 p38MAPK、NF-κB、IL-1β、IL-8免疫組化檢測：固定組織經脫水、浸蠟、包埋、切片、脫蠟后，進行免疫組化染色并采用BA200 Digital數碼三目攝像顯微攝像系統觀察并采集切片圖像，每張切片先于100倍下觀察全部組織，再選取3個視野分別采集400倍顯微圖像。采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統測定全部切片圖像的積分光密度（Integrated optical density，IOD）和面積，并計算每張圖的平均光密度（Mean optical density，MOD），再用3張圖的MOD計算均值，即為每例樣本的MOD。

1.5 統計學分析：采用SPSS 21.0對數據進行統計分析，計量資料用均數±標準差（x?±s）表示，兩獨立樣本的均數比較進行t檢驗；單因素多水平重復測量設計的多組均數比較進行重復測量方差分析，P＜0.05有統計學意義。

2? 結果

2.1 兔耳痤瘡造模結果：通過肉眼觀察、組織病理學觀察來判定造模成功與否，并進行免疫組化檢測p38MAPK、NF-κB、IL-1β、IL-8蛋白的表達，與正常對照組進行對比。

2.1.1 肉眼觀察結果：正常對照組兔耳軟而薄，透光可，毛細血管網清晰，耳管開口處毛囊口排列規則，分布均勻、細密、平整（見圖1A）。造模組兔耳水腫明顯，局部變硬、粗糙增厚，透光度降低，毛細血管網難以辨別，毛囊口擴張，可見明顯堵塞的黑色角栓，兼有散在紅色炎性丘疹和膿皰（見圖1B）。

2.1.2 組織病理學觀察結果：正常對照組兔耳組織表皮結構清晰，角質層較??；真皮膠原纖維交錯排列，胞質紅染，間質可見少量毛囊及皮脂腺等附屬器結構，毛囊體積正常、內容物少，毛囊壁未見增生，皮脂腺體積正常，附屬器周圍無炎細胞浸潤；真皮肌層肌纖維平行排列，未見明顯增生（見圖2A）。造模組兔耳組織表皮結構不清，局部增厚，可見角化過度，棘層肥厚；真皮內成纖維細胞增生，膠原纖維灶狀壞死，胞質崩解，輪廓模糊不清，毛囊體積明顯增大，其內出現大量角化物質并擴大成壺狀，毛囊壁顯著增厚，皮脂腺體積增大，分葉增多，附屬器周圍可見大量炎癥細胞浸潤（見圖2B）。

2.1.3 免疫組化檢測p38MAPK、NF-κB、IL-1β和IL-8蛋白表達結果：造模組p38MAPK、NF-κB、IL-1β和IL-8蛋白呈強表達，正常對照組呈弱表達，免疫組化MOD測定結果對比見表1。兩組免疫組化染色見圖3～6。

2.2 各用藥組免疫組化檢測p38MAPK、NF-κB、IL-1β、IL-8蛋白表達結果

2.2.1 各用藥組p38MAPK蛋白表達檢測結果：由于時間和分組存在交互效應，故本研究限定時間對p38MAPK蛋白表達的影響，僅考慮分組對其產生的影響，進行簡單效應分析，組間比較結果如下。用藥前，各組間兩兩比較p38MAPK蛋白表達均差異無統計學意義（P＞0.05）。用藥2周后，2%SA組、30%SA組、夫西地酸組p38MAPK蛋白表達低于模型對照組（P＜0.001）；2%SA組與夫西地酸組、30%SA組與夫西地酸組、2%SA組與30%SA組p38MAPK蛋白表達差異無統計學意義（P＞0.05）。用藥4周后，2%SA組、30%SA組、夫西地酸組p38MAPK蛋白表達低于模型對照組（P＜0.001）；2%SA組、30%SA組p38MAPK蛋白表達低于夫西地酸組（P＜0.001）；2%SA組與30%SA組p38MAPK蛋白表達差異無統計學意義（P＞0.05）。此外，限定分組對p38MAPK蛋白表達的影響，僅考慮時間對其產生的影響，進一步進行簡單效應分析，組內比較結果如下：四個組的p38MAPK蛋白表達均隨著時間的延長呈下降趨勢，且每個組的各時間點間均有差異（P＜0.05）。p38MAPK蛋白表達測定結果見表2。

2.2.2 各用藥組NF-κB蛋白表達檢測結果：簡單效應分析組間比較結果如下。用藥前，各組間兩兩比較NF-κB蛋白表達均差異無統計學意義（P＞0.05）。用藥2周后，2%SA組、30%SA組、夫西地酸組NF-κB蛋白表達低于模型對照組（P＜0.001）；2%SA組與夫西地酸組、30%SA組與夫西地酸組、2%SA組與30%SA組NF-κB蛋白表達差異無統計學意義（均P＞0.05）。用藥4周后，2%SA組、30%SA組、夫西地酸組NF-κB蛋白表達低于模型對照組（P＜0.05）；2%SA組、30%SA組NF-κB蛋白表達均低于夫西地酸組（P＜0.001）；2%SA組與30%SA組差異無統計學意義（P＞0.05）。組內比較結果如下：四個組的NF-κB蛋白表達均隨著時間的延長呈下降趨勢，模型對照組用藥前與用藥2周后NF-κB蛋白表達差異無統計學意義（P＞0.05），其余三組的各時間點間均有差異，差異具有統計學意義（P＜0.05）。NF-κB蛋白表達測定結果見表3。

2.2.3 各用藥組IL-1β蛋白表達檢測結果：簡單效應分析組間比較結果顯示，用藥前，各組間兩兩比較IL-1β蛋白表達均差異無統計學意義（P＞0.05）。用藥2周后，2%SA組、30%SA組、夫西地酸組IL-1β蛋白表達低于模型對照組（P＜0.001）；2%SA組與夫西地酸組、30%SA組與夫西地酸組、2%SA組與30%SA組IL-1β蛋白表達差異無統計學意義（均P＞0.05）。用藥4周后，2%SA組、30%SA組、夫西地酸組IL-1β蛋白表達低于模型對照組（P＜0.05）；2%SA組、30%SA組與夫西地酸組IL-1β蛋白表達均差異無統計學意義（P＞0.05）；2%SA組IL-1β蛋白表達低于30%SA組（P＜0.05）。四個組的IL-1β蛋白表達均隨著時間的延長呈下降趨勢，且每個組的各時間點間均有差異（P＜0.05）。IL-1β蛋白表達測定結果見表4。

2.2.4 各用藥組IL-8蛋白表達檢測結果：簡單效應分析組間比較結果顯示，用藥前，各組間兩兩比較IL-8蛋白表達均差異無統計學意義（P＞0.05）。用藥2周后，2%SA組、30%SA組、夫西地酸組IL-8蛋白表達低于模型對照組（P＜0.001）；2%SA組IL-8蛋白表達低于30%SA組、夫西地酸組（均P＜0.05）；30%SA組與夫西地酸組IL-8蛋白表達差異無統計學意義（P=0.436）。用藥4周后，2%SA組、30%SA組、夫西地酸組IL-8蛋白表達低于模型對照組（P＜0.05）；2%SA組、30%SA組IL-8蛋白表達低于夫西地酸組（均P＜0.05）；2%SA組IL-8蛋白表達低于30%SA組（P＜0.05）。組內比較結果如下：四個組的IL-8蛋白表達均隨著時間的延長呈下降趨勢，且每個組的各時間點間均有差異（P＜0.05）。IL-8蛋白表達測定結果見表5。

3? 討論

目前公認的痤瘡發病機制為毛囊角化異常、P.acnes定植、皮脂分泌過多、炎癥反應及內分泌等。其中炎癥反應在痤瘡的發生、發展中尤為重要，貫穿了痤瘡發病的始終[7]。目前關于痤瘡炎癥通路研究較成熟的為p38MAPK/NF-κB信號通路，該通路可促使單核-巨噬細胞分泌過多的IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等促炎因子，從而介導天然免疫[8]。

超分子水楊酸具有抗炎、調節角化、控油、抗菌、抗血凝（促進微循環）以及美白（抑制酪氨酸酶）等多重作用[9-10]，不僅可抑制痤瘡主要發病機制，還可改善色素沉著及瘢痕。由于其具有控緩釋能力、生物利用度高、皮膚刺激性小、患者耐受度高等特點[11]，規避了傳統水楊酸的不足，已被廣泛用于治療痤瘡。臨床研究發現，超分子水楊酸既可和異維A酸、鹽酸米諾環素等口服藥物聯用，也可和激光、紅藍光、光動力、粉刺擠壓術等物理治療聯用，還可單獨使用治療輕中度痤瘡，均可獲得較好的療效及較高的患者滿意度，且極少發生不良反應。

兔耳易于觀察皮損，方便采樣，具有造模時間短、可靠性及成功率高、重復性好的特點，是研究尋常型痤瘡的經典模型[12]。1989年美國皮膚病學會制定了兔耳痤瘡模型的規范方法，即Kligman法[13]，該法已被廣泛用于痤瘡模型的研究并被證實可以很好地模擬痤瘡的毛囊皮脂腺導管角化異常。要同時研究痤瘡炎癥，還需要構建炎癥模型。痤瘡丙酸桿菌的定植和增殖在痤瘡炎性皮損的發生發展起著重要作用[14]，它的細胞壁由較厚的肽聚糖組成，可被TLR2識別，激活NF-κB信號通路，啟動IL-1β、TNF-a、IL-8、IL-12等細胞因子參與局部炎癥反應和機體對其的免疫反應。痤瘡模型發現在造模第7天時局部注射P.acnes混懸液后可形成明顯的丘疹、膿皰等驗證皮損表現[15]。本研究通過改良Kligman法，將外涂煤焦油和局部注射P.acnes混懸液聯合應用，很好地構建了兔耳痤瘡的毛囊皮脂腺導管角化異常和炎癥模型，有利于下一步試驗的開展。

本研究發現兔耳痤瘡模型中p38MAPK、NF-κB、IL-1β和IL-8蛋白表達顯著增多，進一步驗證了p38MAPK/NF-κB信號通路在痤瘡炎癥中可能發揮了一定作用。2%SA組、30%SA組、夫西地酸組兔耳痤瘡模型中的p38MAPK、NF-κB、IL-1β和IL-8蛋白降低程度均優于模型對照組，結果顯示2%SA、30%SA、夫西地酸均可能通過抑制痤瘡p38MAPK/NF-κB信號通路而發揮抗炎作用?？傮w而言治療2周后2%SA、30%SA的抗炎作用與夫西地酸組相似，治療4周后2%SA、30%SA的抗炎作用優于夫西地酸組。

綜上，本研究證實超分子水楊酸可通過抑制p38MAPK/NF-κB信號通路來發揮抗炎作用，且隨著用藥時間的延長療效也在逐漸增加，并優于夫西地酸，對于臨床工作中超分子水楊酸在痤瘡炎性皮損的治療具有重要意義。

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[收稿日期]2022-12-26

本文引用格式：楊力，劉尚可，林新瑜，等.超分子水楊酸對兔耳痤瘡模型p38MAPK/NF-κB信號通路的影響[J].中國美容醫學，2024，33（3）：1-5.