OPG過表達的ADSC對大鼠牙槽后槽骨缺損的修復作用

尹鵬 季于琪

[摘要]目的：探究骨保護素（Osteoprotegerin，OPG）過表達的脂肪間充質干細胞（Adipose-derived stem cell，ADSC）對大鼠牙槽后槽骨缺損修復的影響。方法：選擇SD雄性大鼠38只，其中6只用于獲得ADSC及ADSC OPG過表達轉染，鑒定轉染情況并觀察不同ADSC的形態、成骨分化、成脂分化及增殖能力；其中8只作為對照組，另外24只建立牙槽后槽骨缺損大鼠模型，隨機分為模型組、正常ADSC組和OPG過表達的ADSC組。6周后，Micro-CT掃描觀察骨缺損愈合情況；蘇木素-伊紅（Hematoxylin-eosin，HE）染色觀察骨缺損組織病理改變；免疫組化分析組織中堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）、骨鈣素（Osteocalcin，OCN）的表達；Western blot分析組織中OPG/核因子-κB受體活化因子配體（Receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）/核因子-κB受體活化因子（Receptor activator of nuclear factor-κB，RANK）通路蛋白表達。結果：攜帶空載體與OPG過表達慢病毒的轉染效率分別為75.23%和79.08%；兩種ADSC均為長梭形；OPG過表達ADSC中的OPG蛋白表達水平、增殖能力、成骨能力明顯高于正常ADSC，成脂能力明顯低于正常ADSC（P＜0.05）；與對照組相比，模型組的牙槽后槽骨缺損體積、RANKL、RANK蛋白表達水平明顯升高，Lane-Sandhu組織學評分、ALP、OCN陽性表達率、OPG蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05）；與模型組相比，正常ADSC組獲得與上述相反的結果；OPG過表達的ADSC組上述指標的變化幅度較正常ADSC組更顯著。結論：OPG過表達的ADSC能夠促進大鼠牙槽后槽骨缺損的修復。

[關鍵詞]脂肪間充質干細胞；骨保護素；牙槽后槽骨缺損；大鼠；成脂分化能力；成骨分化能力

[中圖分類號]R781.42? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2024）03-0017-05

The Osteogenesis of ADSC with OPG Overexpression Has A Great Effect on the Posterior Alveolar Bone Defect

YIN Peng，JI Yuqi

（Department of Stomatology，Leshan People's Hospital，Leshan 614000，Sichuan，China）

Abstract： Objective? To investigate the effect of adipose-derived stem cell （ADSC） overexpressed with osteoprotegerin （OPG） on the repair of posterior alveolar bone defects in rats. Methods? Thirty-eight male SD rats were selected， of which 6 were used to obtain the overexpression of ADSC and ADSC OPG. The transfection was identified and the morphology，osteogenic differentiation，adipogenic differentiation and proliferation of different ADSC were observed. Among them， 8 rats were used as control group， and 24 rats with alveolar bone defect were randomly divided into model group， normal ADSC group and OPG overexpression ADSC group. Six weeks later， Micro-CT scan was used to observe the healing of bone defect in rats. The histopathological changes of bone defects were observed by hematoxylin-eosin （HE） staining. The expression of alkaline phosphatase （ALP） and osteocalcin （OCN） in the tissue was analyzed by immunohistochemistry. The expression of OPG/ receptor activator of nuclear factor-κB ligand （RANKL） / Receptor activator of nuclear factor-κB （RANK） pathway was analyzed by Western blot. Results? The transfection efficiency of empty vector and OPG overexpression lentivirus was 75.23% and 79.08%， respectively. Both kinds of ADSC were fusiform. The expression level of OPG protein， proliferation ability and osteogenic ability in OPG overexpressed ADSC were significantly higher than those in normal ADSC， while the adipogenic ability was significantly lower than that in normal ADSC （P＜0.05）. Compared with the control group， the volume of posterior alveolar bone defect， the expression of RANKL and RANK protein in the model group increased significantly， while the histological score of Lane-Sandhu， the positive expression rate of ALP and OCN and the expression level of OPG protein decreased significantly in the model group （P＜0.05）. Compared with the model group， the normal ADSC group achieved the opposite results. The changes of the above indexes in the ADSC group with overexpression of OPG were more significant than those in the normal ADSC group. Conclusion? ADSC overexpressed by OPG can promote the repair of alveolar bone defect in rats.

Key words： adipose-derived stem cell; osteoprotegerin; posterior alveolar bone defect; rats; adipogenic differentiation ability; osteogenic differentiation ability

口腔科骨代謝性疾病可導致大面積牙槽骨缺損，自體骨移植是目前治療無法自我修復骨缺損的首選方案，但存在供區骨量受限、增加患者機體損傷等問題[1]。組織工程學的興起和應用解決了上述不足，其中，干細胞是研究的重點[2-3]。骨髓間充質干細胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC）和ADSC是目前應用于口腔骨再生醫學中的主要非牙源性干細胞，且ADSC是良好的種子細胞[4]。但單純ADSC還不能達到理想的骨缺損修復目的。研究表明[5]，通過基因工程技術對干細胞進行修飾，能夠提高對骨缺損的修復效果。OPG主要由骨髓基質細胞和成骨細胞合成并分泌，屬于腫瘤壞死因子超家族成員。有研究證實[6]，OPG修飾的BMSC能夠抑制破骨細胞活性，提高骨質疏松大鼠的骨密度。但目前鮮見關于通過OPG修飾的ADSC對骨缺損修復的影響的研究。本研究探討OPG過表達的ADSC對大鼠牙槽后槽骨缺損修復的影響，為下一步的臨床應用提供研究基礎。

1? 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：體重為（220±20）g的4月齡雄性SD大鼠38只，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。喂養3 d，正常飲食、飲水。本研究經樂山市人民醫院實驗動物倫理委員會審核、批準（批準號：L1329-18）。

1.1.2 主要試劑及儀器：DMEM培養基、胎牛血清（美國Gibco公司）；胰蛋白酶（美國Hyclone公司）；pmirGLO表達載體（美國Promega公司）；LipofectamineTM2000試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司）；吉姆薩染液、油紅O染色試劑盒、BCA蛋白質測定試劑盒（上海碧云天）；茜素紅染液（北京Solarbio公司）；堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）抗體、骨鈣素（Osteocalcin，OCN）抗體、OPG抗體、RANKL抗體、RANK抗體（美國Abcam公司）；3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX）（上?？道缮锟萍加邢薰荆?。SZ51型光學顯微鏡（日本Olympus公司）；IX73型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；Micro-CT掃描系統（比利時Bruker公司）。

1.2 方法

1.2.1 ADSC的提取、分離培養及傳代：頸椎脫臼處死6只大鼠，獲取2 g腹部脂肪組織，PBS清洗，剪刀剪碎并置于離心管中，加入其2倍體積的0.075%的Ⅰ型膠原蛋白酶，37℃水浴震蕩消化30 min，加入等體積的DMEM培養基（含10%胎牛血清），1 500 rpm離心15 min并棄去上清，用DMEM培養基重懸細胞沉淀并經細胞篩過濾。調整細胞濃度至1×106個/毫升，接種至裝有DMEM培養基（含10%胎牛血清）的培養皿中，置于37℃、5% CO2的培養箱中培養，24 h后觀察細胞形態，3 d換液1次，當細胞生長達80%～85%融合時進行消化傳代，取第3代細胞用于實驗。

1.2.2 OPG過表達ADSC的轉染、篩選及驗證：取第3代ADSC，用DMEM培養基重懸，以1×104個/孔的細胞數量接種于96孔板中，參照文獻[7]并按照慢病毒轉染說明書，將帶有表達綠色熒光的空載體慢病毒液和OPG過表達載體慢病毒液加入96孔板中與ADSC混合，分別為正常ADSC和OPG過表達的ADSC。培養箱中培養24 h后，熒光顯微鏡觀察細胞形態及綠色熒光強度，當轉染率＞70%時即為轉染成功。Western blot分析進一步驗證轉染情況。

1.2.3 ADSC形態觀察及增殖、分化能力的檢測

1.2.3.1 細胞的形態觀察：取對數生長期的細胞，胰酶消化，細胞涂片，甲醛固定，吉姆薩染色，PBS浸泡30 s，去離子水洗滌，晾干后在顯微鏡下觀察（40×）并拍照。

1.2.3.2 細胞增殖能力的檢測：取第3代ADSC，接種于6孔板中，細胞密度為6×104個/毫升，設置3個副孔，分別于細胞培養的第1、2、3、4、5、6、7天取3個副孔中的細胞，PBS洗滌，胰酶消化，10%血清培養液終止消化，顯微鏡下觀察計數，每孔重復觀察計數3次取平均值。

1.2.3.3 ADSC成骨分化能力的檢測：取第3代細胞接種于6孔板中，密度為1×105個/ml，加入DMEM培養液培養，細胞融合至80%后，更換為成骨誘導液（胎牛血清10 ml+雙抗1 ml+DMEM培養基89 ml+抗壞血酸50μmol/L+地塞米松100 nmol/L+β-甘油磷酸鈉10 mmol/L）繼續培養21 d，期間每3 d換液一次，采用茜素紅染色法檢測鈣沉積情況。

1.2.3.4 ADSC成脂分化能力的檢測：按上述成骨分化能力檢測中的方法，將細胞培養至融合80%后，更換為成脂誘導液（胎牛血清10 ml+雙抗1 ml+DMEM培養基89 ml+吲哚美辛0.2 mmol/L+地塞米松1μmol/L+胰島素10μg/ml+IBMX 0.5 mmol/ml），每3 d換液一次，培養21 d后，采用油紅O染色法檢測脂肪囊泡的形成情況。

1.2.4 ADSC種植于明膠海綿：將大小為2 mm×2 mm×2 mm的無菌明膠海綿置于48孔板內，分別將正常ADSC與OPG過表達的ADSC接種于明膠海綿上，每孔1×105個細胞，體外培養3 d后進行后續實驗。

1.2.5 大鼠分組及牙槽后槽骨缺損大鼠模型的制備

1.2.5.1 分組：將32只雄性SD大鼠隨機分為對照組、模型組、正常ADSC組、OPG過表達的ADSC組，每組8只。每組中的2只大鼠用于Micro-CT掃描和病理學觀察，3只用于免疫組化實驗，3只用于Western blot實驗。

1.2.5.2 牙槽后槽骨缺損大鼠模型的制備：模型組、正常ADSC組、OPG過表達的ADSC組大鼠按40 mg/kg的劑量腹腔注射2%的異戊巴比妥進行麻醉，術區消毒后，無菌條件下手術暴露大鼠牙槽后槽骨，使用牙科鉆于上頜兩側后槽牙位置各造一個直徑2 mm、深2 mm的圓柱形缺損[8]。模型組、正常ADSC組、OPG過表達的ADSC組大鼠雙側缺損內分別植入明膠海綿、明膠海綿與正常ADSC的復合體、明膠海綿與OPG過表達的ADSC的復合體；對照組大鼠未進行牙槽后槽骨缺損處理，不植入明膠海綿。

1.2.6 Micro-CT掃描觀察各組大鼠牙槽后槽骨缺損區的修復情況：各組大鼠牙槽后槽骨缺損區植入明膠海綿6周后，麻醉并固定大鼠，采用Micro-CT對各組大鼠缺損區進行掃描，觀察骨缺損區的愈合情況。

1.2.7 大鼠牙槽后槽骨缺損區組織病理學觀察及評價：植入明膠海綿6周后，處死大鼠，分離獲得手術區牙槽后槽骨標本，多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，脫蠟，水化，HE染色，脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察。采用Lane-Sandhu組織學評分[9]評價各組大鼠牙槽后槽骨缺損修復情況，包括連接、松質骨、皮質骨3個評價項目，每個項目0～4分，總分0～12分，評分越高提示骨缺損愈合情況越好。

1.2.8 免疫組化分析大鼠牙槽后槽骨缺損組織中成骨相關蛋白的表達：大鼠手術區牙槽后槽骨組織標本切片于65℃烘箱中烘烤過夜，二甲苯浸泡脫蠟，逆濃度梯度乙醇復水，去離子水洗滌，抗原高壓修復，滴加3%的H2O2溶液，PBS洗滌，分別加ALP、OCN一抗，4℃孵育過夜，PBS洗滌，滴加二抗，37℃條件下孵育10 min，PBS洗滌，滴加二氨基聯苯胺（Diaminobenzidine，DAB）溶液，顯微鏡下觀察并控制染色時間，PBS洗滌，蘇木素復染，0.5%氨水返藍，脫水，透明，封片，電子顯微鏡下觀察。

1.2.9 Western blot分析大鼠牙槽后槽骨缺損組織中OPG/RANKL/RANK通路蛋白的表達：RIPA緩沖液提取大鼠缺損牙槽后槽骨組織中的總蛋白，使用BCA蛋白質測定試劑盒測量蛋白質濃度。電泳，轉膜，5%脫脂牛奶封閉，分別添加抗OPG、RANKL、RANK一抗，4℃下孵育過夜，加入辣根過氧化物酶偶聯的二抗，37℃下孵育2 h，β-actin作內參。使用Gel Pro Analyzer 4.0對圖像進行灰度識別。

1.3 統計學分析：采用SPSS 22.0進行統計學分析，作圖軟件采用GraphPad Prism 5.0。計量資料以x?±s表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05表明差異有統計學意義。

2? 結果

2.1 OPG過表達ADSC的轉染鑒定：熒光顯微鏡觀察發現，攜帶空載體與OPG過表達慢病毒的轉染效率分別為75.23%和79.08%，見圖1A。Western blot分析結果顯示，OPG過表達的ADSC中OPG蛋白表達水平明顯高于正常ADSC（P＜0.05），見圖1B。

2.2 正常ADSC與OPG過表達的ADSC形態及增殖、分化能力的比較：正常ADSC與OPG過表達的ADSC均為纖維細胞樣長梭形，細胞核明顯，核質清晰；與正常ADSC相比，OPG過表達的ADSC增殖能力、成骨分化能力明顯增強，成脂分化能力明顯減弱，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見圖2。

2.3 Micro-CT掃描觀察各組大鼠牙槽后槽骨缺損區的修復情況：與對照組相比，模型組牙槽后槽骨缺損體積明顯增加，與模型組相比，正常ADSC組的牙槽后槽骨缺損體積明顯減小，OPG過表達的ADSC組的牙槽后槽骨缺損體積較正常ADSC組明顯減小。見圖3。

2.4 各組大鼠牙槽后槽骨缺損區組織病理染色結果的觀察：HE染色結果顯示，對照組上頜骨組織中的新生骨、新生血管及成骨細胞較為多見；模型組新生骨數量較少，可見大量的纖維結締組織；與模型組相比，正常ADSC組可見明顯的新生骨生成，但結構較為紊亂，且仍以編織骨為主，并附著大量的纖維組織，OPG過表達的ADSC組可見大量新生骨和部分新生血管，新生骨周圍存在大量的成骨細胞，但新生骨結構仍較紊亂。與對照組相比，模型組的Lane-Sandhu組織學評分明顯降低，與模型組相比，正常ADSC組的Lane-Sandhu組織學評分明顯升高，OPG過表達的ADSC組的Lane-Sandhu組織學評分較正常ADSC組明顯升高，差異均具有統計學意義（P＜0.05）。見圖4。

2.5 各組大鼠牙槽后槽骨中成骨相關蛋白表達水平的比較：與對照組相比，模型組大鼠牙槽后槽骨中的ALP、OCN蛋白陽性表達率明顯降低，與模型組相比，正常ADSC組的ALP、OCN蛋白陽性表達率明顯升高，與正常ADSC組相比，OPG過表達ADSC組的ALP、OCN蛋白陽性表達率明顯升高，差異均具有統計學意義（P＜0.05）。見圖5。

2.6 各組大鼠牙槽后槽骨中OPG/RANKL/RANK通路蛋白表達水平的比較：與對照組相比，模型組的OPG蛋白表達水平明顯下降，RANKL、RANK蛋白表達水平明顯升高，與模型組相比，正常ADSC組的OPG蛋白表達水平明顯升高，RANKL、RANK蛋白表達水平明顯下降，與正常ADSC組相比，OPG過表達ADSC組的OPG蛋白表達水平明顯升高，RANKL、RANK蛋白表達水平明顯下降，差異均具有統計學意義（P＜0.05）。見圖6。

3? 討論

隨著組織工程學的發展，干細胞移植修復骨缺損已成為目前醫學界研究的熱點，避免了自體骨移植來源不足及異體骨移植和骨替代材料移植受到種間差異限制等問題[10-11]。ADSC作為理想的種子細胞，具有多向分化潛能，通過移植至骨缺損組織并分化為成骨細胞發揮骨缺損修復的作用，但修復效果有限[5]。OPG能夠抑制破骨細胞增殖活化，促進破骨細胞凋亡[12]。有研究發現[13]，骨形態發生蛋白2過表達能夠提高ADSC的增殖和成骨分化能力，促進顱骨大段骨缺損組織的愈合。還有研究證實[14]，OPG修飾的牙周膜干細胞有利于其成骨分化，促進新西蘭兔牙槽骨組織的再生修復。但目前關于OPG是否會增強提高ADSC的增殖及成骨分化的能力尚未明確。

在本研究中，OPG過表達ADSC中的OPG蛋白表達水平明顯升高，表明ADSC中OPG過表達轉染成功。此外，OPG過表達ADSC的增殖能力及成骨分化能力明顯增強，成脂分化能力明顯減弱，表明OPG過表達能夠促進ADSC的增殖和成骨分化。目前關于通過OPG修飾的ADSC對骨缺損愈合的影響也尚未闡明。Song J等[15]的研究表明，凝血酶抑制劑通過上調BMSC中Wnt的表達，促進細胞增殖，并誘導BMSC的成骨分化，抑制牙周病模型小鼠的牙槽骨丟失，促進骨缺損的修復。在本研究中，牙槽后槽骨缺損模型大鼠骨缺損部位分別植入明膠海綿與正常ADSC的復合體、明膠海綿與OPG過表達ADSC的復合體6周后，骨缺損體積均明顯減小，組織病理染色結果顯示骨缺損區組織的成骨細胞數量及新生骨數量明顯增加，且應用OPG過表達ADSC的改善效果更顯著，表明OPG過表達ADSC能夠促進大鼠牙槽后槽骨缺損組織的愈合。

成骨細胞和破骨細胞平衡被打破是牙槽后槽骨缺損及骨缺損后難以自主愈合的重要原因[16]。ALP、OCN與骨鈣化相關，分別是成骨細胞分化成熟的早期標志和晚期標志物[17-18]。裘吉雨等[19]的研究結果顯示，骨形成蛋白9過表達的人牙周膜干細胞能夠明顯增強大鼠牙周缺損區ALP、OCN的活性，增強干細胞的成骨分化能力，促進新骨形成，修復牙槽骨缺損。在本研究中，正常ADSC組與OPG過表達的ADSC組大鼠骨缺損區牙槽后槽骨組織中的ALP、OCN陽性表達率較模型組均明顯增加，表明ADSC能夠促進大鼠牙槽后槽骨缺損區新骨的形成，OPG過表達的ADSC組大鼠骨缺損組織中的ALP、OCN陽性表達率更高，提示OPG過表達能夠促進ADSC成骨細胞分化，有利于骨缺損愈合。OPG是RANK的假性受體，競爭性阻斷RANKL與RANK的結合，從而抑制骨吸收和骨破壞。OPG/RANKL/RANK是調節成骨與破骨偶聯的信號通路[20]。在本研究中，正常ADSC組與OPG過表達的ADSC組大鼠骨缺損區牙槽后槽骨組織中的OPG蛋白表達水平較模型組明顯升高，RANKL、RANK蛋白表達水平較模型組明顯下降，且OPG過表達的ADSC組的改善作用更明顯，表明OPG過表達的ADSC可能通過調節OPG/RANKL/RANK信號通路對大鼠缺損組織起到促進成骨和抑制破骨的作用。

綜上所述，OPG過表達能夠增強ADSC的增殖和成骨分化能力，抑制ADSC的成脂分化能力，OPG過表達的ADSC能夠促進大鼠牙槽后槽骨缺損組織的愈合及新生骨形成，上調ALP、OCN成骨相關蛋白的表達，其作用機制可能與調節OPG/RANKL/RANK信號通路有關。

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[收稿日期]2022-10-31

本文引用格式：尹鵬，季于琪.OPG過表達的ADSC對大鼠牙槽后槽骨缺損的修復作用[J].中國美容醫學，2023，33（3）：17-21，25.