腫瘤免疫標志物在乳腺癌免疫治療中的作用機制及應用進展

楊凱，曾天宇，殷詠梅

（南京醫科大學第一附屬醫院/江蘇省人民醫院腫瘤科，江蘇 南京 210029）

作為腫瘤藥物治療史上的第三次革命，免疫治療被譽為目前最有希望的抗腫瘤手段之一?；凇懊庖弑O視”理論，免疫治療充分調動患者自身的抗腫瘤免疫系統，從而識別并清除“非己”腫瘤細胞[1]；基于“腫瘤免疫編輯”理論，免疫治療逆轉“逃逸”、維持“均衡”甚至恢復“清除”階段，從而長期有效控制腫瘤的進展[2]。近年來，免疫治療已在黑色素瘤、肺癌和白血病等腫瘤中取得了顯著的臨床療效，而傳統被認為“弱免疫原性”的乳腺癌（breast cancer，BC），也在以免疫檢查點（immune checkpoint，IC）為代表的三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）相關臨床研究中取得了突破性進展。此外，免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitor，ICI）單藥或聯合化療的新輔助治療也有助于改善BC患者的預后[3]。然而，目前BC的免疫治療仍面臨諸多挑戰，包括篩選敏感人群、提高療效、預防耐藥和免疫相關不良反應（immune-related adverse event，IRAE）以及尋找合適的藥物靶點等[4]。

腫瘤免疫標志物是指可被客觀衡量從而評估腫瘤免疫的生物學特征或指標，可用來預測BC免疫治療的療效從而篩選獲益人群，監測免疫反應的過程從而預防IRAE，以及為BC免疫藥物的研究提供靶點從而增強免疫治療的療效[5]?；谀[瘤免疫標志物的治療，打破了既往按照不同瘤種進行統一規范化治療的理念，而是根據標志物的表達情況進行精準化、個體化治療。

腫瘤免疫標志物的表現形式多種多樣，廣義上參與腫瘤免疫各個環節的分子（如受體或細胞因子）、細胞（類型和比例）甚至微結構[如三級淋巴結構（tertiary lymphatic structure，TLS）]等均可作為潛在的標志物[6]。除了病理或生理產生的標志物外，還可人為誘導腫瘤免疫標志物的產生。例如基于BC瘤內菌的發現，基因工程細菌或病毒在特異性感染腫瘤的同時能表達相應的抗原作為免疫細胞識別腫瘤的標志，從而誘導免疫原性細胞死亡（immunogenic cell death，ICD）甚至編碼產生ICI類似物[7]。此外，標志物的獲取及檢測手段、藥物結構設計和給藥方式等也在很大程度上影響了腫瘤免疫標志物在BC中的臨床應用。本文闡述了腫瘤免疫關鍵的起止環節（即免疫識別和殺傷）中標志物的作用機制，包括腫瘤抗原的產生和釋放、固有免疫和適應性免疫的效應，并基于作用機制總結了腫瘤免疫標志物的臨床應用和前沿研究。

1 免疫細胞識別腫瘤抗原

1.1 腫瘤抗原的產生

腫瘤抗原是隨著腫瘤發生發展而異常表達的腫瘤標志物，主要來源于基因轉錄水平的異常，也可來源于轉錄后RNA剪接失調或翻譯后蛋白修飾紊亂[8]。當受到物理、化學或生物等致癌因素的影響時，腫瘤細胞會發生“經典遺傳學”的基因突變，主要表現為原癌基因和抑癌基因的平衡被打破[9]。由于基因序列發生變化，腫瘤細胞可產生正常細胞不表達的抗原，即腫瘤特異性抗原（tumor specific antigen，TSA），其具有較高的免疫原性和個體異質性[10]。理論上突變的數量越多，即腫瘤突變負荷（tumor mutational burden，TMB）越高，產生的腫瘤抗原也越多，然而BC中高TMB不一定預示著理想的免疫療效，這可能與腫瘤異質性有關[11]。

另一方面，腫瘤細胞會發生“表觀遺傳學”的基因表達異常，主要表現為相關基因表達的時空、數量和功能異常。由于沒有發生基因序列的改變，腫瘤細胞會產生正常細胞表達的抗原，即腫瘤相關抗原（tumor associated antigen，TAA），例如用于BC分子分型的雌激素受體、孕激素受體和人類表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2），其具有較弱的免疫原性且誘導免疫耐受[12]。相比于TAA，TSA是BC中啟動機體抗腫瘤免疫和T細胞效應器激活的關鍵[13]。然而，腫瘤抗原并非只是免疫系統識別腫瘤的“身份證”，某些腫瘤抗原在很大程度上促進了腫瘤的發生發展。例如，HER2陽性BC因高表達HER2分子從而加強生長因子信號介導的細胞增殖[14]。

1.2 腫瘤抗原的釋放

在BC的腫瘤微環境（tumor microenvironment，TME）中，能量缺乏和代謝物堆積（如缺氧、葡萄糖缺乏、乳酸堆積和氧化應激）可誘導腫瘤細胞損傷（如內質網應激）和非凋亡調節性細胞死亡（尤其是ICD）[15]。腫瘤細胞損傷會表達損傷相關分子模式（damage-associated molecular pattern，DAMP）分子（例如內質網分子伴侶鈣網蛋白和熱休克蛋白），通過與模式識別受體（pattern recognition receptor，PRR）結合從而吸引并激活固有免疫細胞。腫瘤細胞死亡也會釋放腫瘤內部抗原、三磷酸腺苷和高遷移率族蛋白1等免疫刺激因子從而促進免疫招募和浸潤[16]。

然而，腫瘤細胞的死亡不一定都有助于BC的抗腫瘤免疫。研究發現，腫瘤細胞死亡釋放的鉀離子能抑制效應T細胞（effector T cell，Teff）的抗瘤作用[17]，釋放的前列腺素E2能抑制DAMPs對巨噬細胞和樹突狀細胞（dendritic cell，DC）的激活[18]。此外，腫瘤死亡也能誘導腫瘤細胞進入“警覺狀態”。與固有免疫細胞類似，腫瘤細胞也能表達Toll樣受體（toll-like receptor，TLR）和P2X4受體（P2嘌呤能受體的亞型）等PRRs，從而識別DAMPs分子并激活胞內核轉錄因子NF-κB和絲裂原活化蛋白激酶等信號通路，最終促進腫瘤細胞存活并產生炎癥因子和趨化因子[19]。

2 免疫細胞殺傷腫瘤細胞

2.1 固有免疫的標志物

根據CD56表達的差異，可將自然殺傷（natural killer，NK）細胞分為以細胞毒作用為主的CD56dim和以免疫調節為主的CD56bright[20]。與T細胞類似，研究發現了調節性NK細胞、NK細胞耗竭以及組織駐留NK細胞等亞型。鑒于BC中NK細胞浸潤的異質性，腫瘤中NK細胞的數量和類型可在一定程度上預測BC免疫治療的療效[21]。然而與Teff不同，NK細胞不表達特異性抗原識別受體，而是通過活化性殺傷細胞受體（activated killer cell receptor，AKR）和抑制性殺傷細胞受體（inhibitory killer cell receptor，IKR）信號的平衡來調節自身的活化狀態（見圖1A）。因此，NK細胞不需要抗原呈遞，且具有更廣譜、迅速和安全（可用于同種異體移植）的抗腫瘤作用，從而推動了NK工程細胞在BC中的應用[22]。

圖1 免疫細胞表面抑制性和活化性免疫檢查點及其配體Figure 1 Inhibitory and activating immune checkpoints and their ligands on the surface of immune cells

NK細胞主要通過AKR識別腫瘤表面的非主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）I類分子被激活，而通過IKR識別MHC I類分子被抑制[23]。為逃避Teff的識別，腫瘤細胞通常會下調MHC I類分子的表達，但MHC I類分子的表達缺失反而會介導NK細胞的殺傷，即“迷失自我”效應[24]。然而在BC的TME中，腫瘤浸潤NK細胞的數量和功能會受到抑制（尤其是細胞毒性亞群）。例如，非經典HLA基因HLA-E和HLA-G被證實在BC中高表達，并能向NK細胞以及CD8+T細胞提供抑制信號，這可能與BC治療中曲妥珠單抗耐藥有關[21-25]。

BC中的巨噬細胞主要來源于循環單核細胞和組織駐留巨噬細胞，二者在TME的影響下形成腫瘤相關巨噬細胞（tumor-associated macrophage，TAM）[26]。在免疫反應早期，TAM主要發揮殺傷作用，高表達CD80、CD86、MHC II和CD68；而在免疫反應后期，TAM主要發揮免疫抑制作用，高表達CD206、CD204和CD163[27]。研究表明，TAM細胞頻率與BC的免疫細胞浸潤和免疫治療反應有關[28]。與NK細胞類似，TAM通過“吃我”和“不吃我”信號的平衡來調節自身的活化狀態（見圖1B）。

2.2 適應性免疫的標志物

不同于急性感染的經典激活模式，BC中T細胞的激活分為2個階段，即腫瘤引流淋巴結（tumor-draining lymph node，TDLN）中經典樹突狀細胞（conventional dendritic cell，cDC）抗原提呈的初始激活以及隨后TME內的效應器激活。效應器激活主要包括3個信號：T細胞受體（T-cell receptor，TCR）-pMHC、共刺激分子和細胞因子[29]（見圖1C）。

目前，關于BC免疫的基礎研究大多聚焦于CD8+T細胞和腫瘤組成性表達的MHC I類分子，然而CD4+T細胞的細胞毒作用和腫瘤誘導性表達的MHC II類分子也值得關注。研究發現，干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）通過轉錄主調節因子Ⅱ型反式激活因子誘導腫瘤細胞表達MHCⅡ類分子，從而被CD4+細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）識別并殺傷[30]。與MHC I類分子不同，MHCⅡ類分子能結合多樣性的抗原肽，從而促進CD4+CTL識別TSA[30]。更重要的是，研究發現MHCⅠ和MHCⅡ類分子在腫瘤免疫中受到獨立調節，二者的表達可能對BC免疫治療具有獨立意義[31]。

在BC的腫瘤免疫中，腫瘤細胞可通過調節TME中IC的表達來逃避T細胞的殺傷，其中最重要的是上調負性共刺激分子[例如程序性死亡受體-1（programmed death receptor-1，PD-L1）]，從而使T細胞維持在耗竭狀態，即T細胞耗竭（T cell exhaustion，Tex）[32]。雖然Tex與T細胞失能在抑制性受體的表達上有重疊，但失能T細胞主要出現在免疫激活早期，而Tex則由晚期Teff轉變而來[33]。有研究根據Ly108（由人轉錄因子TCF1表達）和CD69將Tex分為4個階段，即耗竭前期1（TexProg1）、耗竭前期2（TexProg2）、耗竭中期（TexInt）和耗竭末期（TexTerm）。從TexInt開始，Tex逐漸失去TCF1的表達，即Ly108陰性，而抗PD-1治療能恢復前3個階段Tex的功能[34]。然而并非所有耗竭T細胞都失去功能，有研究發現部分T細胞耗竭后還能擁有多能性和再生性，即耗竭T細胞前體（Tpex）[35]。Tpex對維持Tex庫和響應BC免疫治療至關重要，進一步研究發現cDC1通過TCR信號使Tpex與持續存在的腫瘤抗原隔絕從而防止其進一步耗竭[36]。值得注意的是，之前研究認為腫瘤內Tex是響應BC免疫治療的關鍵，然而后續研究表明響應BC免疫治療的T細胞主要是外源性（TDLN）而并非局部TME中原本存在的[37]。最近有研究證實腫瘤細胞表達的PD-L1不能直接抑制T細胞毒性而是抑制T細胞浸潤轉移灶，DC和TAM等免疫細胞表達的PD-L1才是抑制T細胞毒性的關鍵，這部分解釋了BC臨床研究中PD-L1表達情況與免疫治療療效不匹配的問題[38]。

3 腫瘤免疫標志物在乳腺癌中的臨床應用

除了尋找更合適的標志物外，如何最大程度發揮標志物在BC臨床應用的價值更值得深思，包括標志物的獲取及檢測手段、藥物結構設計和給藥方式等。在標志物獲取及檢測手段方面，由于腫瘤的時間和空間異質性，來自活檢等侵入性檢查的標志物只能反映某一時刻部分腫瘤組織的靜態情況，故其檢查結果不具時效性且可能以偏概全；而來自血液等非侵入性檢查的標志物，雖然便于實時動態反映腫瘤的整體情況，但由于表達水平低且干擾因素多，其結果難以檢測且不夠精準[39]。例如，對于BC的PD-1/PD-L1檢測，除了傳統活檢外，BC的新型液體檢測手段正在研究中，包括循環腫瘤PD-L1（PD-L1+CTCs）和外泌體型PD-L1檢測[40]。在藥物結構設計方面，BC中圍繞腫瘤抗原的藥物結構大多類似于抗體藥物偶聯物，即彈頭[如靶向腫瘤抗原的抗體、TCR或嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR）]加上彈藥（如殺傷腫瘤細胞的毒素、藥物或免疫細胞）以及二者的連接結構，其影響因素包括裂解性、脂溶性、藥物抗體偶聯比及旁觀者效應等[41]。圍繞IC的藥物結構以大分子抗體為主，或可只保留Fab段來降低相對分子質量、增加腫瘤滲透率并降低免疫原性，但Fc段能誘導抗體依賴細胞介導的細胞毒性作用[42]。在給藥方式上，鑒于腫瘤慢性病的特征和長期用藥的需求，皮下瘤內注射（尤其對于較為淺表的BC）甚至口服給藥是未來抗瘤藥物的發展方向[43]。

鑒于單藥療效不理想，BC的免疫治療更注重聯合策略，包括聯合化療、靶向治療和局部放療來逆轉BC的“冷腫瘤”狀態。例如，ICD誘導劑聯合ICI在增強免疫細胞浸潤的基礎上又能維持其抗瘤功能[44]；ICI聯合轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）抗體有助于藥物滲透到腫瘤內部[45]；雙特異性抗體（bispecific antibodie，BsAb）同時靶向免疫細胞和腫瘤細胞的標志物，從而輔助免疫細胞接近并殺傷腫瘤細胞。此外，BsAb對于工程化免疫細胞的重定向作用能夠逆轉細胞免疫療法的脫靶和耐藥[46]。

3.1 基于腫瘤抗原的治療策略

靶向腫瘤抗原的治療策略主要包括ICD誘導劑、腫瘤疫苗、過繼細胞療法（adoptive cell therapy，ACT）和抗腫瘤抗體（見圖2）。與TAA相比，TSA具有更高的免疫原性和腫瘤特異性，因而不易誘導免疫耐受、自身免疫反應和耐藥[47]。TSA已成為BC腫瘤抗原治療策略中極具潛力的標志物。然而，由于TSA具有較強的異質性和個體差異，確定特定突變與TSA之間的聯系較為困難。目前已鑒定出的TSA數量遠少于TAA，且針對TSA的個體化治療需要更高的時間和經濟成本[48]。因此，需要積極尋找腫瘤患者中共享表達的TSA，例如KRASG12D2突變產生的TSA[49]。

圖2 基于腫瘤抗原的乳腺癌免疫治療策略Figure 2 Tumor antigen-based immunotherapy for breast cancer

對不同來源腫瘤抗原優先級研究顯示，從臨床效果、免疫原性、特異性、腫瘤相關性、表達水平和陽性率以及細胞表達分布等方面來看，腫瘤內部抗原（主要是TSA）比腫瘤表面抗原或可溶性分泌抗原（主要是TAA）更具臨床應用價值[50]。然而，BC中大多數基于腫瘤抗原的治療策略（例如CAR-T細胞療法和抗腫瘤抗體）很難直接靶向腫瘤細胞內部。因此，誘導腫瘤細胞死亡有助于腫瘤內部抗原的暴露[48]。此外，鑒于MHC能夠結合胞內抗原并形成pMHC表達在細胞表面，TCR-T細胞療法通過TCR-pMHC的結合能夠識別大范圍、低水平變異的腫瘤內部抗原。然而MHC表達的適應性調節及個體化，阻礙了TCR-T細胞療法開發出更具臨床價值的通用型TCR-T，這在一定程度上也限制了TCR-T的使用[51]。表1從作用機制的角度對腫瘤疫苗、ACT和抗腫瘤抗體進行了分類，對比了各種療法的優缺點并重點總結了未來發展方向及相關臨床研究[47-51]。

表1 基于腫瘤抗原的乳腺癌免疫治療策略Table 1 Tumor antigen-based immunotherapy for breast cancer

3.2 基于免疫檢查點的治療策略

調節免疫細胞活化狀態的IC主要包括NK細胞的AKR和IKR、巨噬細胞的“吃我”和“不吃我”受體以及T細胞的正性和負性共刺激分子[52-53]。表2總結了NK細胞、巨噬細胞和T細胞表面IC的受體-配體結合和分布情況，各個IC的作用特點及其在BC免疫治療中的研究進展[52-53]。

表2 基于免疫檢查點的乳腺癌免疫治療策略Table 2 Immune checkpoint-based therapeutic strategies against breast cancer

作為機體正常免疫調節器，IC對維持正常免疫耐受以及控制免疫反應的持續時間和范圍至關重要，然而IC可被腫瘤“劫持”并異常表達從而介導免疫抑制。在BC免疫治療中，為了篩選敏感人群、預防耐藥以及副反應，在以關鍵IC為主要治療靶點的基礎上，許多研究報道了其他標志物用于輔助預測并監督腫瘤免疫反應，包括基因水平（如微衛星不穩定和TMB）、分子水平（如趨化因子和代謝相關分子）、細胞水平（如免疫細胞頻率、TLS和TDLN）以及微生物水平（如病毒和腸道微生物）[54-55]。

ICI的抗瘤效果往往伴隨著IRAE的發生，某些IRAE的出現可能預示著良好的免疫治療效果[56]。然而IRAE的嚴重程度取決于共享IC表達的細胞類型、分化階段和作用機制等。例如紅細胞同樣能表達巨噬細胞“不吃我”受體CD47，從而針對該靶點的BC免疫治療易導致貧血[57]。此外，BC免疫治療中抗CTLA-4主要影響了初始T細胞（Th0）從而過度激活免疫反應，而抗PD-1主要影響了晚期Teff，從而促使免疫反應恢復正常[58]。值得注意的是，有些IC的作用機制較為復雜，甚至對腫瘤具有雙重作用，這導致單純的阻斷或加強活化信號不能取得理想的抗瘤效果。例如，隨著BC的進展，腫瘤細胞自身可耐受TGF-β的作用，但免疫細胞仍受其抑制從而導致腫瘤的免疫逃逸，提示恢復BC對TGF-β的敏感性可能更有助于解決TGF-β抗體治療所面臨的問題[59]。

4 結語與展望

不同于以BC分子分型作為治療指導，免疫治療主要根據腫瘤免疫標志物的表達情況去調控腫瘤免疫反應的平衡。免疫治療不再只是用于晚期BC患者的“沒有辦法的辦法”，而是逐漸成為BC重要的治療方式之一，積極用于輔助甚至新輔助治療，并聯合其他抗瘤藥物[60]。目前，BC免疫治療主要針對缺乏有效內分泌治療和靶向治療的TNBC，并在腫瘤疫苗、腫瘤抗體和免疫調節劑等方面取得了顯著進展，但其大多數仍處于臨床前或臨床試驗階段，僅部分ICI被批準用于臨床[61]。此外，BC免疫治療仍存在諸多問題，包括篩選敏感人群、提高療效、預防耐藥和IRAE以及尋找合適的藥物靶點等。這需要深入研究腫瘤免疫發生發展的各個環節（尤其是免疫激活和免疫效應），進而探索更加合適的腫瘤免疫標志物作為監測和治療的靶點，同時進一步改進標志物的獲取及檢測手段、藥物結構設計和給藥方式等，從而最大程度發揮腫瘤免疫標志物的臨床應用價值[4]。