瓜蔞皮注射液及其中間體中17 種氨基酸含量測定及其變化規律研究

陶 香，張靜嫻，胡 青，孫 健，董 瑩，丁金國，于 泓，沈盈盈，毛秀紅，季 申*

（1.上海中醫藥大學，上海 201203； 2.上海市食品藥品檢驗研究院，國家藥品監督管理局中藥質量控制重點實驗室，上海 201203； 3.上海第一生化藥業有限公司，上海 200240）

瓜蔞皮注射液是以瓜蔞皮為原料，利用現代工藝制成的中藥注射液，具有行氣除滿、開胸除痹功效，常用于冠心病、穩定型心絞痛、心力衰竭的治療［1-6］，具有改善心肌缺血、抗血栓、抗氧化、抗動脈粥樣硬化等藥理作用［7-9］。近年來，瓜蔞皮注射液臨床應用范圍日益擴大，在治療心、腦、肺等臟器疾病中發揮著重要作用，以因動脈阻塞引起的心肌缺血缺氧性疾病居多［10-12］。

瓜蔞皮含有豐富的氨基酸，文獻［13］ 測定了不同產地、品系該藥材中18 種游離氨基酸的含量，發現高達37.71 mg/g； 文獻［14］ 在雙邊栝樓果實各部位中檢測了19 種氨基酸，其中果皮中含量較高的有瓜氨酸、精氨酸、賴氨酸等； 文獻［15-18］ 報道了瓜蔞皮經水提醇沉、732 型陽離子交換樹脂后制成注射液，主要富集氨基酸、核苷、生物堿等兩性、堿性化合物，其中氨基酸含量最高。目前，瓜蔞皮注射液國家標準［19］采用紫外分光光度計測定總氨基酸含量，缺乏專屬性，結果不夠準確。因此，本實驗測定瓜蔞皮注射液及其中間體中天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、瓜氨酸、精氨酸、丙氨酸、γ-氨基丁酸、酪氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、鳥氨酸、亮氨酸、賴氨酸、脯氨酸的含量，并考察其變化規律，以期為該制劑質量控制關鍵因素研究提供參考。

1 材料

Agilent 1290 高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）； Milli-Q 超純水儀（美國Millipore 公司）； 電子分析天平［0.01 mg，賽多利斯科學儀器（北京） 有限公司］； 精密PH 計（瑞士Mettler-Toledo公司）。鄰苯二甲醛（OPA） 購自美國Pickering Laboratories 公司； 9-芴甲基氯甲酸酯（FMOC） 購自美國Sigma-Aldrich 公司； 巰基丙酸購自美國Alfa Aesar 公司。氨基酸混合物（批號140624-201506，包括天冬氨酸、谷氨酸、酪氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、精氨酸、絲氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、丙氨酸、賴氨酸） 及鳥氨酸（批號140847-201901）、瓜氨酸（批號110875-201607）、γ-氨基丁酸（批號100482-201601） 對照品均購自中國食品藥品檢驗研究院，純度均≥98%。瓜蔞皮注射液共6 批，批號2205203 （編號SX1）、2206201 （編號 SX2）、2206202 （編號SX3）、2205201 （編號 SX4）、2205202 （編號SX5）、2206203 （編號SX6），經水提醇沉、732 型陽離子交換柱等10 道工序后得到中間體，分別為煎煮合并液（編號Ⅰ）、減壓濃縮液（編號Ⅱ）、一次酒沉液（編號Ⅲ）、一次酒沉濃縮液（編號Ⅳ）、二次酒沉液 （編號Ⅴ）、二次酒沉濃縮液（編號Ⅵ）、氨水洗脫液（編號Ⅶ）、洗脫濃縮液（編號Ⅷ）、調酸冷藏過濾液（編號Ⅸ）、瓜蔞皮注射液制劑（編號Ⅹ），均由上海第一生化藥業有限公司生產。乙腈、甲醇為色譜純，購自德國Merck公司； 磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、硼酸均為分析純，購自中國醫藥（集團） 上?；瘜W試劑公司。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Waters XBridge C18色譜柱（4.6 mm×100 mm，3.5 μm）； 流動相磷酸鹽緩沖液（pH＝7.8，制備方法為取磷酸氫二鈉71.8 g，超純水溶解并稀釋至1 000 mL； 取磷酸二氫鈉2.76 g，去離子水溶解并稀釋至100 mL，分別取兩者915、85 mL 混合，搖勻，即得） （A） - ［甲醇-乙腈-水（45 ∶45 ∶10） ］ （B），梯度洗脫（0 ～6 min，1% ～10% B； 6 ～20 min，10% ～38% B； 20 ～28 min，38% ～40%B）； 體積流量1 mL/min； 柱溫45 ℃； 檢測波長0～20 min 338 nm，20 min 后（即賴氨酸出峰后） 262 nm； 進樣量1 μL。

衍生化試劑包括0.4 mol/L 硼酸緩沖液（pH ＝10.2），制備方法為取硼酸適量，制成0.4 mol/L溶液，40%氫氧化鈉溶液調節pH 至10.2，即得；1%OPA 溶液，制備方法為稱取OPA 80 mg，加硼酸緩沖液7 mL、乙腈1 mL、巰基丙酸125 μL，混勻，即得； 0.5% FMOC 溶液，制備方法為稱取FMOC 50 mg，適量乙腈-四氫呋喃（4 ∶6） 溶解，稀釋至10 mL，即得。柱前衍生化反應中進樣瓶1～4 分別為OPA、FMOC、水、硼酸鹽緩沖液，分別從瓶3 中吸取0 μL （水，清洗針頭）； 瓶4 中抽取7 μL （硼酸鹽緩沖液）； 吸取樣品1 μL； 瓶3 中吸取0 μL （水，清洗針頭）； “在空氣中” 以500 μL/min體積流量混合8 μL，共5 次； 瓶1 中吸取1 μL （OPA）； 瓶3 中吸取0 μL （水，清洗針頭）； “在空氣中” 以500 μL/min 體積流量混合9 μL，共25 次； 瓶2 中吸取1 μL （FMOC）； 瓶3中吸取0 μL （水，清洗針頭）； “在空氣中” 以500 μL/min 體積流量混合10 μL，共50 次； 進樣。

2.2 對照品溶液制備 精密稱取對照品谷氨酸、瓜氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、脯氨酸、丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、鳥氨酸各12.5 mg，天冬氨酸、甘氨酸、纈氨酸、賴氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸各5 mg，γ-氨基丁酸25 mg，置于同一50 mL 量瓶中，0.1 mol/L 鹽酸溶解并稀釋至刻度，制成貯備液，分別精密量取適量，0.1 mol/L 鹽酸稀釋，即得（谷氨酸、瓜氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、脯氨酸、丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、鳥氨酸質量濃度均為10～250 μg/mL，天冬氨酸、甘氨酸、纈氨酸、賴氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸質量濃度均為4 ～100 μg/mL，γ-氨基丁酸質量濃度為20～500 μg/mL）。

2.3 供試品溶液制備 分別精密移取瓜蔞皮注射液及其中間體（Ⅰ～Ⅹ） 3、1、3、1、3、1、1、1、1、1 mL 及同體積濃鹽酸，置于10 mL 安瓿瓶中，在150 ℃下水解1 h，放冷，轉移至蒸發皿中，10 mL 水分次洗滌，洗液并入蒸發皿中，蒸干，殘渣用0.1 mol/L 鹽酸溶解并分別轉移至10、25、10、25、10、25、10、25、25、10 mL 量瓶中，0.1 mol/L 鹽酸稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系考察 取對照品溶液適量，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定。以對照品峰面積（Y） 對其質量濃度（X） 進行回歸，結果見表1，可知各氨基酸在各自范圍內線性關系良好。

表1 各氨基酸線性關系Tab.1 Linear relationships of various amino acids

2.4.2 精密度試驗 取對照品溶液適量，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定6 次，測得天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、瓜氨酸、精氨酸、丙氨酸、γ-氨基丁酸、酪氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、鳥氨酸、亮氨酸、賴氨酸、脯氨酸峰面積RSD 分別為2.79%、0.74%、1.09%、1.29%、0.46%、2.03%、3.59%、1.98%、1.25%、1.95%、0.73%、2.79%、4.01%、3.08%、0.69%、1.24%、2.89%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復性試驗 按“2.3” 項下方法平行制備6 份供試品溶液（SX1），在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、瓜氨酸、精氨酸、丙氨酸、γ-氨基丁酸、酪氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、鳥氨酸、亮氨酸、賴氨酸、脯氨酸含量RSD 分別為2.37%、2.48%、3.39%、3.31%、3.87%、5.29%、2.08%、1.77%、1.76%、2.38%、3.30%、2.05%、0.98%、2.80%、2.65%、3.08%、3.56%，表明該方法重復性良好。

2.4.4 穩定性試驗 取“2.4.3” 項下同一供試品溶液，室溫下于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、瓜氨酸、精氨酸、丙氨酸、γ-氨基丁酸、酪氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、鳥氨酸、亮氨酸、賴氨酸、脯氨酸峰面積RSD 分別為5.46%、3.28%、2.93%、5.18%、3.86%、3.40%、3.81%、4.19%、2.60%、2.31%、1.89%、4.71%、1.75%、3.51%、1.70%、3.87%、1.89%，表明溶液在24 h 內穩定性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗 精密吸取本品（SX1）0.5 mL，平行6 份，按100%水平加入對照品溶液，按“2.3” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、瓜氨酸、精氨酸、丙氨酸、γ-氨基丁酸、酪氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、鳥氨酸、亮氨酸、賴氨酸、脯氨酸平均加樣回收率分別為118.32%、119.48%、110.13%、117.68%、100.60%、103.85%、107.18%、111.76%、84.60%、83.42%、112.51%、111.88%、85.76%、105.20%、113.28%、97.27%、103.07%，RSD 分別為1.68%、1.29%、2.14%、2.77%、1.48%、1.75%、7.94%、1.05%、3.93%、1.38%、3.91%、6.90%、2.53%、2.17%、0.91%、1.67%、7.83%。

2.5 樣品含量測定 圖1 顯示，瓜氨酸含量從中間體Ⅵ至Ⅶ明顯升高。再測定10 道工序相應中間體中17 種氨基酸含量，結果見表2，可知中間體Ⅰ中精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、鳥氨酸含量較高，酪氨酸、瓜氨酸含量較低； 制劑中γ-氨基丁酸、丙氨酸、鳥氨酸、亮氨酸、瓜氨酸含量較高，酪氨酸、纈氨酸含量較低。

圖1 瓜蔞皮注射液制備工藝流程及代表性色譜圖Fig.1 Preparation process flow and typical chromatograms of Gualoupi Injection

表2 各氨基酸含量測定結果（μg/mL）Tab.2 Results for content determination of various amino acids （μg/mL）

2.6 主成分分析和熱圖分析 以10 道工序相應中間體的樣品編號為變量，氨基酸含量的歸一化值為觀察值，采用 UV Scaling 方式預處理后通過SIMCA-P 13.0 軟件進行主成分分析，結果見圖2。由此可知，前2 個主成分累積方差貢獻率為70.2%； 相同工序不同批次樣品較聚集，表明工藝穩定性較好； 不同工序樣品聚為3 組，分別為Ⅰ～Ⅱ（Group 1）、Ⅲ～Ⅵ（Group 2）、Ⅶ～Ⅹ（Group 3），表明工序Ⅲ、Ⅶ對氨基酸組成的影響最大，而工序Ⅶ后氨基酸組成非常相似，Group 3 中不同工序中間體難以區分； Ⅰ～Ⅱ中精氨酸、賴氨酸含量較高，而Ⅶ～Ⅹ中瓜氨酸、酪氨酸含量較高。

圖2 主成分分析結果Fig.2 Results for principal component analysis

熱圖分析見圖3。由此可知，氨基酸含量聚為3 類，與主成分分析結果基本一致； 以工序Ⅶ為分界點，精氨酸、酪氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、谷氨酸、絲氨酸在制備過程中的含量由高轉低，而脯氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、丙氨酸、γ-氨基丁酸含量恰好相反； 鳥氨酸含量由高轉低又升高，瓜氨酸在工序Ⅰ中的含量略高，Ⅱ～Ⅵ中非常低，Ⅶ中開始明顯升高； 酪氨酸含量從工序Ⅶ開始逐漸升高，最終趨于穩定。

綜上所述，工序Ⅶ對氨基酸組成的影響最大。732 型陽離子交換柱的填料為7%苯乙烯·二乙烯共聚體上帶有磺酸基（-SO3） 的陽離子交換樹脂，在溶液中解離出H＋，樹脂解離后產生的SO3-能與溶液中帶正電荷的物質結合，主要用于富集堿性物質或強酸性物質。瓜蔞皮煎煮液水提醇沉后主要富集了多肽、氨基酸、核苷等親水性化合物，與離子交換劑的結合能力主要取決于其物理化學性質和等電點，pH＜pI，氨基酸和多肽帶正電； pH＞pI，兩者帶負電［20］，并且環境pH 與等電點差值越大，與離子交換劑的結合能力越強； 被分離肽的電荷密度越大，與離子交換劑的結合能力也越強，以1 mol/L氨溶液（pH 約9.25） 洗脫陽離子交換柱時，pI＞pH 的氨基酸和多肽帶正電，與樹脂交換基團中的H＋發生交換而結合于柱上，如賴氨酸、精氨酸； pI＜pH 的兩者帶負電，無法與離子交換柱結合而被氨溶液洗脫下來，如脯氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、瓜氨酸、鳥氨酸、γ-氨基丁酸、酪氨酸等，同時一些帶正電荷、密度較大的肽與樹脂交換基團中的H＋發生交換，結合于柱上，而帶負電荷的肽被洗脫下來。另外，瓜氨酸通過陽離子交換柱后含量明顯升高，結合文獻［21］ 報道，推測可能是由于氨水洗脫過程中精氨酸在有氧條件下氧化生成瓜氨酸和一氧化氮，最后被富集到制劑中，從而使該成分含量大大增加。

3 討論

3.1 氨基酸篩選 預實驗選擇20 種氨基酸進行色譜條件考察，發現組氨酸、甲硫氨酸、色氨酸含量較低，衍生試劑在相應色譜峰處有干擾，影響結果準確性，故未測定三者； 在谷氨酸、甘氨酸色譜峰之間存在一個較大的未知峰，對比空白試劑色譜圖發現并非衍生試劑峰，并且經谷氨酰胺、天冬酰胺、羥脯氨酸、組氨酸、甲硫氨酸等對照品比對后也均不符合，后期將繼續對其進行鑒定。

3.2 衍生條件優化 衍生化法檢測氨基酸是在一定pH 和3-巰基丙酸（3-MPA） 存在下，OPA 首先與一級氨基酸反應，而二級氨基酸不與OPA 反應，與3-MPA 結合后可降低氨基酸疏水性，再用FMOC 對二級氨基酸脯氨酸進行衍生，故OPA 衍生化產物出峰時間比FMOC 衍生化產物更早，而過剩的FMOC 及其降解產物在二級氨基酸后出峰，不會干擾分析［22］。本實驗考察了OPA、FMOC 在500 μL/min 速率下混合5、10、20、25、50、70、100 次時的衍生氨基酸峰面積，最終分別確定為25、50 次。

3.3 水解條件優化 本實驗通過文獻調研發現，一般在150 ℃下水解60 min 即可將結合氨基酸全部水解為游離型氨基酸，再對常用水解時間（30、60、90 min） 進行考察，為了確保注射液中結合型氨基酸全部水解，最終確定為60 min。

4 結論

本實驗采用OPA-FMOC 在線衍生法測定瓜蔞皮注射液中天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、瓜氨酸、精氨酸、丙氨酸、γ-氨基丁酸、酪氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、鳥氨酸、亮氨酸、賴氨酸、脯氨酸的含量，具有良好的準確性、重復性和穩定性，對提高該制劑質量標準提供重要方法。然后，對10 道工序相應中間體中上述氨基酸含量進行測定，并開展主成分分析和熱圖分析，闡釋生產過程中其變化規律，發現醇沉和陽離子交換樹脂對其組成的影響最大，可為指導優化瓜蔞皮注射液生產工藝提供科學依據。