基于熵權法和灰色關聯度法評價枸杞子質量

余鐘蓮，王 瑞，楊 莉，王崢濤，石燕紅，4*

（1.上海中醫藥大學中藥學院，上海 201203； 2.上海中醫藥大學交叉科學研究院，上海 201203； 3.上海中醫藥大學中藥研究所，中藥標準化教育部重點實驗室，上海 201203； 4.上海中醫藥大學中醫藥國際標準化研究所，上海 201203）

枸杞子為茄科植物寧夏枸杞LyciumbarbarumL.的干燥成熟果實，具有滋補肝腎、益精明目的功效［1］。其化學成分包括多糖、生物堿、酚酸、類胡蘿卜素等，具有調節免疫、抗腫瘤、抗衰老、降血糖血脂、保護神經等作用［2］。枸杞子廣泛種植于寧夏、新疆、甘肅、西藏等地，但自然環境和種植條件的差異導致不同產地的枸杞子質量參差不齊［3］。此外，枸杞子育化品系繁多，寧杞系列是主要的栽培品種，但不同品系間的質量差異未見系統的比較研究［4-5］。目前枸杞子的質量評價多基于甜菜堿等2020 年版《中國藥典》 規定的含測成分，檢測指標過于單一，無法全面表征枸杞子的質量屬性［6-7］。課題組前期對枸杞子中的葫蘆巴堿、枸杞酸和玉米黃素雙棕櫚酸酯（ZD） 進行分析方法和生物活性的研究，結果均表明其含量較為豐富，在抗氧化和保護肝腎等方面藥效顯著［8-13］。近年來，灰色關聯度法結合熵權法的綜合評價模式已經廣泛應用于白芷、人參、羌活等中藥材的質量研究中，熵權法對指標權重進行客觀賦值，灰色關聯度法根據關聯度進行質量排序，能更為客觀全面的評價中藥材質量［14-16］。

本研究以小分子類成分甜菜堿、葫蘆巴堿、枸杞酸和ZD 的含量為指標，結合灰色關聯度法和熵權法建立枸杞子多指標綜合評價模型，對不同產地和不同品系的枸杞子進行綜合質量比較，以期為該藥材品質評價和質量標準提升提供科學依據。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）； ACQUITY UPC2超高效合相色譜（美國Waters 公司）； HWS-24 恒溫水浴鍋（上海城獻儀器設備有限公司）；Milli-Q Advantage 型超純水系統 （美國Millipore 公司）；BT25S 型電子分析天平（德國賽多利斯公司）； KQ-250DB數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑 甜菜堿（CAS 107-43-7，純度≥98%）、葫蘆巴堿（CAS 535-83-1，純度≥98%）、枸杞酸（CAS 562043-82-7，純度≥98%） 對照品均購于上海詩丹德標準技術服務有限公司； 玉米黃素雙棕櫚酸酯對照品（ZD，CAS 144-67-2，純度≥95%） 購于美國Sigma 公司。高純度CO2（純度≥99.999%） 購于上海氯閔氣體有限公司。甲醇、乙腈均為色譜純，購于美國Thermo 公司； 甲醇、乙醇、乙酸銨均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司； 水為超純水。

1.3 藥材 枸杞子共58 批，具體見表1，經上海中醫藥大學中藥研究所吳立宏研究員和石燕紅副研究員共同鑒定為茄科植物寧夏枸杞LyciumbarbarumL.的干燥成熟果實，憑證標本保存于上海中藥標準化研究中心。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液制備 精密稱取甜菜堿、葫蘆巴堿對照品適量，甲醇制成分別含兩者2、0.2 mg/mL 的溶液； 精密稱取ZD、枸杞酸對照品適量，分別加入0.1% BHT 乙酸乙酯溶液、甲醇制成質量濃度均為1 mg/mL 的溶液，即得。

2.2 供試品溶液制備

2.2.1 甜菜堿、葫蘆巴堿 參考文獻［17］ 報道，精密稱取1.0 g 研碎的枸杞子，加25 mL 二氯甲烷加熱回流提取30 min，過濾，殘渣加25 mL 80%乙醇（pH＝1.0），加熱回流提取30 min，過濾，濾液濃縮至2 mL。另取玻璃層析柱（直徑1～2 cm，長度20 ～30 cm），稱取30 g 堿性氧化鋁（甲醇浸泡過夜），濕法裝柱至8 ～10 cm，加入10 mL 0.1 mol/L 鹽酸平衡，吸取2 mL 濾液上樣（控制體積流量為1 滴/s），80 mL 5%氨水甲醇洗脫，收集洗脫液，濃縮至近干膏狀，甲醇定容至10 mL，0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.2.2 枸杞酸 參考文獻［18］ 報道，精密稱取0.5 g 研碎的枸杞子，置于具塞錐形瓶中，加入25 mL 蒸餾水，稱定質量，超聲（250 W、40 kHz、20 ℃） 處理40 min，放冷至室溫，蒸餾水補足減失的質量，搖勻，過濾，取上清液1 mL，甲醇定容至5 mL，0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.2.3 ZD 氯化膽堿與丙二酸按1 ∶1 比例混合，在80 ℃下磁力攪拌至澄清均勻無色液體，作為低共熔試劑（DES）。參考文獻［19］ 報道，精密稱取1.0 g 研碎的枸杞子，加入2.0 g DES 溶液、30 mL 甲醇、10 mL 正己烷，超聲（250 W、40 kHz、20 ℃） 處理4 h，離心后將上清液與10 mL 水-正己烷（6 ∶4） 混合萃取，靜置后分層，收集正己烷層，下層液體用正己烷多次萃取至完全，合并上層萃取液，回收正己烷，加入含0.1% BHT 的乙酸乙酯定容至10 mL，0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得，置于閉口塞棕色液相瓶中備用。

2.3 色譜條件

2.3.1 甜菜堿、葫蘆巴堿含量測定（HPLC） 菲羅門Titank HILIC 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流動相乙腈-水（81 ∶19）； 體積流量0.7 mL/min； 柱溫40 ℃； 檢測波長195 nm； 進樣量10 μL。色譜圖見圖1。

2.3.2 枸杞酸含量測定（HPLC） YMC Triart-Diol-Hilic色譜柱 （250 mm×4.6 mm，5 μm）； 流動相乙腈-66.7 mmol/L 乙酸銨（85 ∶15）； 體積流量0.7 mL/min； 柱溫40 ℃； 檢測波長260 nm； 進樣量10 μL。色譜圖見圖1。

2.3.3 ZD 含量測定 （UPC2） Acquity HSS C18色譜柱（150 mm×3.0 mm，1.8 μm）； 流動相CO2（A） -甲醇（B），梯度洗脫（0～8 min，20% ～50%B； 8～11 min，50%B）； 背壓1 500 psi （1 psi ＝6.895 kPa）； 體積流量0.8 mL/min； 柱溫35 ℃； 檢測波長450 nm； 進樣量2 μL。色譜圖見圖1。

2.4 方法學考察 4 種成分線性關系見表2； 精密度、重復性、穩定性試驗中各成分RSD 均小于3.0%，表明儀器精密度、方法重復性、溶液72 h 內穩定性良好； 甜菜堿、葫蘆巴堿、枸杞酸、ZD 平均加樣回收率分別為98.04%、97.65%、92.40%、99.15%，RSD 分別為2.15%、2.88%、1.96%、1.15%。

表2 各成分線性關系

2.5 含量測定 表3 顯示，寧夏產藥材中各成分含量最高，以舟塔、石嘴山產較優，寧杞7 號整體質量高于寧杞1 號。

表3 各成分含量測定結果（%，±s，n＝3）

表3 各成分含量測定結果（%，±s，n＝3）

編號甜菜堿葫蘆巴堿枸杞酸ZD Goji-10.892±0.0340.046±0.0030.995±0.0140.255±0.005 Goji-20.980±0.0330.049±0.0011.192±0.0050.260±0.010 Goji-30.820±0.0210.039±0.0031.401±0.0020.176±0.001 Goji-40.792±0.0120.034±0.0010.900±0.0010.261±0.001 Goji-50.982±0.0030.037±0.0011.369±0.0100.215±0.005 Goji-60.851±0.0260.031±0.0031.238±0.0040.197±0.008 Goji-70.844±0.0350.034±0.0021.053±0.0150.280±0.016 Goji-81.014±0.0040.048±0.0011.471±0.0210.260±0.002 Goji-91.131±0.0280.044±0.0070.972±0.0220.214±0.001 Goji-101.174±0.0040.073±0.0011.552±0.0150.393±0.007 Goji-111.208±0.0040.079±0.0011.257±0.0130.329±0.033 Goji-120.862±0.0050.058±0.0011.316±0.0090.168±0.001 Goji-130.899±0.0020.064±0.0011.544±0.0040.212±0.003 Goji-140.789±0.0020.058±0.0011.329±0.0210.340±0.005 Goji-150.840±0.0030.063±0.0011.305±0.0100.336±0.016 Goji-160.959±0.0010.057±0.0011.185±0.0040.124±0.004 Goji-170.762±0.0150.051±0.0021.084±0.0160.161±0.004 Goji-180.851±0.0140.047±0.0021.133±0.0150.147±0.007 Goji-190.805±0.0110.021±0.0011.109±0.0130.314±0.012 Goji-200.731±0.0170.022±0.0011.483±0.0080.181±0.007 Goji-210.770±0.0190.023±0.0011.065±0.0040.152±0.012 Goji-220.828±0.0100.043±0.0011.553±0.0090.142±0.004 Goji-230.931±0.0060.045±0.0031.450±0.0010.180±0.004 Goji-240.890±0.0110.048±0.0011.254±0.0170.170±0.003 Goji-250.868±0.0050.031±0.0011.155±0.0070.344±0.009 Goji-260.795±0.0080.027±0.0010.916±0.0140.422±0.003 Goji-270.733±0.0010.022±0.0040.887±0.0130.234±0.003 Goji-280.780±0.0080.025±0.0011.459±0.0020.461±0.015 Goji-290.827±0.0030.024±0.0010.877±0.0050.202±0.008 Goji-300.963±0.0010.036±0.0010.932±0.0130.360±0.010 Goji-311.174±0.0040.042±0.0011.094±0.0110.230±0.014 Goji-320.845±0.0040.044±0.0011.469±0.0020.271±0.005 Goji-330.806±0.0010.028±0.0011.247±0.0120.161±0.010 Goji-341.019±0.0100.039±0.0010.924±0.0080.218±0.008 Goji-351.058±0.0010.036±0.0010.958±0.0100.525±0.017 Goji-360.712±0.0110.041±0.0011.512±0.0010.153±0.002 Goji-370.738±0.0150.043±0.0020.936±0.0140.195±0.001 Goji-380.843±0.0030.052±0.0011.459±0.0030.092±0.001 Goji-390.713±0.0050.040±0.0031.150±0.0170.123±0.002 Goji-400.882±0.0010.046±0.0011.104±0.0130.139±0.002 Goji-410.715±0.0010.035±0.0011.008±0.0170.265±0.001 Goji-420.844±0.0220.025±0.0010.992±0.0080.230±0.003 Goji-430.839±0.0030.030±0.0030.965±0.0050.125±0.001 Goji-440.755±0.0380.037±0.0011.180±0.0070.122±0.002 Goji-451.002±0.0340.035±0.0021.121±0.0190.098±0.001 Goji-460.819±0.0350.045±0.0021.329±0.0040.184±0.002 Goji-470.801±0.0010.050±0.0040.940±0.0050.097±0.001 Goji-480.984±0.0050.043±0.0021.114±0.0060.256±0.006 Goji-491.013±0.0120.043±0.0010.750±0.0080.268±0.008 Goji-500.796±0.0670.044±0.0011.072±0.0030.191±0.004 Goji-510.967±0.0610.043±0.0011.030±0.0100.190±0.004 Goji-520.732±0.0190.033±0.0010.918±0.0140.196±0.008 Goji-530.830±0.0140.023±0.0021.052±0.0080.356±0.048 Goji-540.956±0.0080.026±0.0011.004±0.0140.199±0.012 Goji-550.740±0.0220.029±0.0031.257±0.0040.168±0.006 Goji-560.743±0.0120.035±0.0011.255±0.0050.392±0.001 Goji-570.982±0.0190.033±0.0011.022±0.0040.298±0.007 Goji-580.909±0.0050.036±0.0011.128±0.0120.175±0.002

2.6 質量評價

2.6.1 熵權法

2.6.1.1 原始數據規格化處理 設有m個樣品，每個樣品有n項評價指標，由此組成單元序列｛Xij｝ （i＝1，2，3，……，m；j＝1，2，3，……，n，本研究中m為58，n為4）。按照公式Yij＝ ［Xij-min （Xi） ］ / ［max （Xi） -min（Xi） ］ 進行處理。

表4 熵權法所得信息熵及權重

2.6.2 灰色關聯度法

2.6.2.1 參考序列 設有m個樣品，每個樣品有n項評價指標，由此組成單元序列｛Xij｝ （i＝1，2，3，……，m；j＝1，2，3，……，n，本研究中m為58，n為4）。同時，設最優參考序列為｛Xsj｝ （j＝1，2，3，……，n），最差參考序列為｛Xtj｝ （j＝1，2，3，……，n），其中最優、最差參考序列中各項內容分別為各評價指標的最大值、最小值。

2.6.2.2 原始數據規格化處理 由于各評價指標之間數據差異較大，故按照公式Yij＝Xij/Xj進行處理，其中Yij為規格化處理后的數據，Xij為原始數據，Xj為第j個指標的平均值。

2.6.2.3 關聯系數 評價指標相對于最優、最差參考序列的關聯系數分別按照公式計算（i＝ 1，2，3，……，m；j＝ 1，2，3，……，n），ρ為分辨系數，計算各指標權重Wj，結果見表5。

表5 評價指標相對于最優、最差參考序列的關聯系數

2.6.2.4 關聯度及相對關聯度 相對于最優參考序列的關聯度ri（s）和最差參考序列的關聯度ri（t）分別按照公式計算。最佳評價單元定義為相對于最優參考序列的關聯度ri（s）最大，相對于最差參考序列的關聯度ri（t）最小者，故將評價單元序列同時相對于最優、最差參考序列的相對關聯度ri作為評價指標，ri越大，藥材質量越好，再按照公式ri＝ri（s）/［ri（s）＋ri（t）］ 計算相對關聯度，結果見表6～7。

表6 不同批次枸杞子關聯度及排序

3 討論

目前對枸杞子的質量研究大多集中于枸杞多糖，忽視了其他小分子成分在枸杞子質量評價中的重要性。因此，本實驗綜合考慮枸杞子的水溶性與脂溶性成分，除2020 年版《中國藥典》 規定的甜菜堿外，還增加了葫蘆巴堿、枸杞酸和ZD 進行枸杞子藥材質量的綜合評價研究。

熵權法結果顯示甜菜堿的權重最大，表明其對枸杞子的質量評價影響最大，之后依次為葫蘆巴堿、ZD 和枸杞酸。枸杞子的相對關聯度范圍為0.247 ～0.770，表明不同批次的枸杞子在質量上存在一定的差異。表7 結果顯示，寧杞1 號的平均相對關聯度均小于相應產地的寧杞7 號，寧杞7 號的質量相對優于寧杞1 號； 對于寧杞1 號和寧杞7號，寧夏產區枸杞子的平均相對關聯度均高于其他產地，以上結果說明寧夏作為寧夏枸杞的道地產區，枸杞子的藥材質量相對于其他產地更佳，其中以舟塔地區最優。寧杞4號（Goji-8） 和科杞608 （Goji-35） 的質量評價雖然較高，但由于樣本量較少，后續需要更多樣品進行驗證。

4 結論

本研究對不同產地和品系58 批枸杞子中的4 種活性成分進行含量測定，采用熵權法對各指標客觀賦權后以相對關聯度為測度比較不同批次枸杞子藥材的質量優劣，質量評價結果與傳統枸杞子的道地產區及目前藥材市場主流品種相符合，這說明通過測定枸杞子中甜菜堿、葫蘆巴堿、枸杞酸和ZD 的含量并基于熵權法和灰色關聯度法建立多指標綜合評價模型可以較好地反映枸杞子的質量，為枸杞子藥材質量評價標準研究提供參考。