神經酸口服給藥后在大鼠體內藥動學研究

黃和飛，陽 劍，李 霽，徐湘婷，李孟蓮，李 波，呂小波*，張 玲*

（1.昆明醫科大學藥學院，云南省天然藥物藥理重點實驗室，云南 昆明 650500； 2.昆明和合醫學檢驗所，云南 昆明 650106）

蒜頭果MalaniaoleiferaChunet S.Lee 為鐵青樹科蒜頭果屬植物，是我國特有、云南省特色植物，其果實所含的神經酸含量高達60% 以上，是目前該成分含量最高的植物［1-5］。神經酸是一種長鏈單不飽和omega-9 脂肪酸，最早在哺乳動物神經組織中發現［3-8］，為大腦、神經發育及其正常功能維持所必需的營養物質，在體內合成極少，主要靠體外攝取補充［7］，具有促進神經細胞增殖和分化、延緩大腦老化、增強學習記憶能力、調節血脂血糖、提高免疫等功能，也是大腦神經組織和神經細胞的核心成分［1-10］，同時抑郁、注意力缺陷障礙等神經系統疾病也與體內該成分含量相關［6，11-12］，在醫學領域研究價值很高。目前，對植物型神經酸的研究尚處于起步階段，主要涉及其藥理活性、提取、分離、制備等方面，尚未涉及藥動學，故本實驗建立LC-MS/MS 法考察神經酸口服給藥后在大鼠體內的藥動學，以期為后續相關藥物開發提供理論依據。

1 材料

1.1 儀器 8050CL 高效液相色譜串聯質譜儀（日本島津公司）； 醫用高速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）； MD200-2 氮吹儀 （杭州奧盛儀器有限公司）；XA105 電子天平（十萬分之一，瑞士梅特勒-托利多公司）；多管渦旋振蕩器（杭州米歐儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 神經酸對照品（純度≥95%，白色片狀結晶） 由云南醫科萬正生物科技股份有限公司提供； 神經酸對照品（純度≥99%） 購于美國Sigma 公司。甲醇（色譜純）、乙酸乙酯（分析純） （德國Merck 公司）； 水為蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）。

1.3 動物 SPF 級SD 大鼠，雌雄各半，體質量180 ～220 g，來源于昆明醫科大學實驗動物學部，實驗動物生產許可證號SCXK （滇） K2020-0004。

2 方法

2.1 溶液制備

2.1.1 標準工作液 精密稱取神經酸對照品5 mg，轉移到10 mL量瓶中，加入8 mL 甲醇，超聲溶解10 min 后定容至刻度，即得（質量濃度為500 μg/mL），取適量，流動相逐步稀釋至0.625、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00 μg/mL。

2.1.2 含藥血漿對照品溶液 取“2.1.1” 項下標準工作液各100 μL，加到900 μL 大鼠空白血漿中，即得（外源性神經酸質量濃度分別為0.062 5、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 μg/mL，血漿隨行質控樣品中其低、中、高質量濃度分別為0.12、0.40、2.0 μg/mL）。

2.1.3 供試品溶液 稱取360 mg 神經酸對照品至燒杯中，加入食用菜籽油攪拌均勻至30 mL，得到120 mg/10 mL 高劑量油溶液，取15 mL，加入15 mL 食用菜籽油，混勻，即得60 mg/10 mL 中劑量油溶液，同法得到30 mg/10 mL低劑量油溶液。

2.2 LC-MS/MS 分析條件

2.2.1 色譜 SUPELCO Ascentis Express F5 C18反向色譜柱（10 cm×2.1 mm，2.7 μm）； 流動相水-甲醇（含0.1% 甲酸） （17 ∶83）； 體積流量0.35 mL/min； 柱溫25 ℃； 進樣量20 μL。

2.2.2 質譜 電噴霧離子源（ESI）； 正離子掃描； 多反應監測（MRM） 模式； 霧化氣體積流量3 L/min； 加熱氣體積流量10 L/min； 接口溫度300 ℃； DL 溫度250 ℃； 加熱塊溫度400 ℃； 干燥器體積流量10 L/min，其他參數見表1。

表1 神經酸質譜條件

2.3 分組、給藥與采血 參考文獻［13-15］ 報道，24 只大鼠隨機分為4 組，分別為對照組（食用菜籽油） 及神經酸低、中、高劑量組（30、60、120 mg/kg），禁食16 h 后以10 mL/kg 劑量灌胃給藥，于給藥前及給藥后0.5、1、1.5、2、4、6、8、10、12、14、24、36 h 眼眶取血各300 μL （其間每4 h 灌胃給予生理鹽水），4 000 r/min 離心15 min，取上層血漿，在-80 ℃下保存。

2.4 樣品前處理 取“2.1.2” 項下含藥血漿對照品溶液或“2.3” 項下血漿樣品100 μL，置于1.5 mL 離心管中，加入800 μL 乙酸乙酯，渦旋混勻5 min 后離心10 min，取700 μL上清，N2吹干，100 μL 甲醇復溶后振蕩混勻1 min，高速離心10 min，取上清液進行分析。

2.5 數據處理 通過DAS 2.0 軟件中的擬合一室模型計算主要藥動學參數，SPSS 23.0 軟件進行組間方差分析。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 方法學考察

3.1.1 專屬性試驗 取按“2.4” 項下方法前處理的空白血漿、含藥血漿對照品溶液 （0.12 μg/mL）、含藥血漿（24 h，30 mg/kg） 適量，在“2.2” 項條件下進樣測定，結果見圖1。由此可知，血漿中神經酸出峰時間一致，均在3.7 min 左右，并且其色譜峰分離度和峰型均良好； 空白血漿中可見內源性神經酸色譜峰，其質量濃度低于30 ng/mL，對測定不會造成實質性干擾，表明該方法專屬性良好。

圖1 神經酸專屬性色譜圖

3.1.2 基質效應試驗 取不同體質量大鼠的空白血漿6份，按“2.4” 項下方法前處理，提取空白基質，加入神經酸，制成低、中、高質量濃度，即 0.12、0.40、2.0 μg/mL，混勻，在“2.2” 項條件下進樣測定，以神經酸在空白基質血漿中的響應峰面積與不含基質甲醇中的響應峰面積比值為基質因子，測得3 個質量濃度下分別為90.83% ～ 114.17%、93.05% ～ 104.53%、91.24% ～107.30%，總基質因子為99.47%，在（100±15）% 以內；RSD 分別為8.82%、4.16%、5.58%，總RSD 為6.19%，均小于15%，符合2020 年版《中國藥典》［16］所規定的生物樣品定量分析方法驗證指導原則。

3.1.3 線性關系考察 按“2.1.2” 項下方法制備標準工作液，在“2.2” 項條件下各進樣20 μL 測定。以對照品峰面積為縱坐標（Y），質量濃度為橫坐標（X） 進行回歸，得方程為Y＝31 684.8X＋5.273 31 （r＝0.999 4），在0.062 5～4.00 μg/mL 范圍內線性關系良好。再按3 倍信噪比確定檢測限為0.31 ng/mL，10 倍信噪比確定定量限為1 ng/mL，并且最低限定量低于Cmax的1/20 ～1/10，在3 ～5個t1/2后仍能檢測，符合相關要求。

3.1.4 精密度、加樣回收率試驗 取不同時間段3 批樣品溶液（“3.1.2” 項下低、中、高質量濃度），平行5 份，采用同一臺儀器于同一天內在“2.2” 項條件下進樣測定，計算日內精密度； 同法測定3 d，每天1 次，計算日間精密度。取大鼠含藥血漿適量，分別加入“3.1.2” 項下低、中、高質量濃度樣品溶液，按“2.4” 項下方法前處理，在“2.2” 項條件下進樣測定3 次，計算回收率。結果，低、中、高質量濃度下日內精密度RSD 分別為3.44%、2.82%、3.54%，日間精密度RSD 分別為5.12%、4.42%、5.32%，均小于15%，表明該方法精密度良好； 神經酸平均加樣回收率分別為（96.67±5.00）%、（95.75±0.75）%、（105.15±4.25）%，均在（100±15）%以內。

3.1.5 穩定性試驗 分別考察在4 ℃、室溫、-80 ℃下放置1、3、6、9、12、24、48、72 h，以及在-80 ℃至室溫下反復凍融5 次時含藥血漿穩定性，平行3 份。結果，含藥血漿在4 ℃下穩定性良好，RSD 為2.67%； 室溫下神經酸含量RSD 為6.30%，可穩定放置24 h； 48、72 h 神經酸含量略有下降； 反復凍融3 次后神經酸含量RSD 為9.55%，但第4～5 次時其含量逐漸降低，RSD 升高。

3.2 體內藥動學研究 單次灌胃給予30、60、120 mg/kg神經酸后，大鼠體內代謝過程均符合一室模型，給藥前，大鼠血漿中神經酸含量RSD 為38.73%，但對照組及各劑量組無顯著性差異（P＞0.05）； 對照組在不同時間點的神經酸含量也無顯著性差異（P＞0.05），血藥濃度-時間曲線見圖2。

圖2 神經酸血藥濃度-時間曲線（±s，n＝6）

采用基線校正法［17-19］，DAS 2.0 軟件中的擬合一室模型計算主要藥動學參數，結果見表2，可知AUC0～36h、AUC0～∞、Cmax均隨神經酸劑量增加而升高 （P＜0.01）；Tmax、t1/2、MRT 分別為10.44、5.24、12.52 h，不同劑量組之間無顯著性差異（P＞0.05）。圖3 顯示，AUC0～36h、AUC0～∞、Cmax呈線性相關，R2分別為0.950 6、0.954 9、0.998 6。

圖3 AUC0 ～36 h （A）、AUC0 ～∞ （B）、Cmax （C） 與神經酸劑量的線性關系

表2 神經酸主要藥動學參數（±s，n＝6）

表2 神經酸主要藥動學參數（±s，n＝6）

注： 與低劑量組（30 mg/kg） 比較，**P＜0.01。

參數單位低劑量組（30 mg/kg）中劑量組（60 mg/kg）高劑量組（120 mg/kg）t1/2h5.05±1.574.51±1.076.17±1.95 Ke1·h-10.27±0.090.21±0.060.23±0.08 V1/FL·kg-167.47±25.2545.52±9.3665.97±13.41 CL/FL·h-1·kg-113.07±4.787.59±0.9610.19±2.10 AUC0 ～36 hng·h·mL-17 282.93±1 265.7714 345.99±581.03**20 620.56±1 601.48**AUC0 ～∞ng·h·mL-18 062.52±1 470.8715 129.34±813.39**21 636.73±1 956.68**MRT0 ～36 hh13.18±1.3212.83±0.4111.53±0.68 MRT0 ～∞h14.23±2.1214.52±0.7912.97±1.33 Tmaxh11.33±1.1211.00±1.009.00±0.45 Cmaxng·mL-1491.80±26.76959.12±31.91**1 764.34±93.03**

4 討論與結論

本實驗采用乙酸乙酯進行液液萃取，提取率較高，并建立LC-MS/MS 法測定大鼠血漿中神經酸血藥濃度，其穩定性良好，符合定量分析要求［15-16，19-20］。文獻［11-12，21-22］ 報道，人乳、血漿（清） 中含有內源性神經酸，但個體有差異； 本實驗采用大鼠混合空白血漿作為基質繪制標準曲線，排除了基底值干擾和基質效應，同時在藥動學研究中采用基線校正法［17-19］，以對照組進行對點校正，即各劑量組血藥濃度在所有采樣時間點均減去對應時間點對照組血漿樣品濃度平均值，以排除溶劑、節律等可能產生的影響。

藥動學結果顯示，單次給予大鼠神經酸后血藥濃度對數-時間曲線具有雙峰現象，高劑量下更明顯，可能與胃排空時間和/或肝腸循環有關。另外，神經酸藥動學符合一室模型，在30～120 mg/kg 口服劑量范圍內AUC、Cmax與劑量呈線性相關，即呈現劑量依賴性。

綜上所述，本實驗開展神經酸在大鼠體內藥動學的研究，可為該成分進一步藥效學機制考察及安全性評價提供參考，為防治神經系統疾病相關藥物開發提供思路，同時也為云南省特色植物蒜頭果開發利用、打造優勢產品奠定理論基礎。