扶正解毒方對病毒性心肌炎大鼠氧化應激及Sirt1/FoxO3a 通路的影響

姜 花，沈延梅，馬馴凱

（青海紅十字醫院心內科，青海 西寧 810001）

病毒性心肌炎（viral myocarditis，VMC） 指由病毒感染心臟，引起的心肌實質性或彌漫性病變［1-2］，其發病機制還未完全闡明。臨床報道發現，VMC 患兒心臟損傷程度與氧化應激損傷程度呈正相關［3］，體內外研究證實柯薩奇病毒B3 （CVB3） 入侵心肌細胞，引起的氧化應激、凋亡激活是造成心肌細胞損傷的關鍵因素之一［4］。沉默信息調節因子2 相關酶1 （Sirt1） 可與叉頭蛋白O3a （FoxO3a） 相互作用，抵抗氧化應激損傷，參與疾病的發生發展過程［5］，但Sirt1/FoxO3a 通路在VMC 疾病過程中的作用研究較少。

近年來，中醫藥開始被更多用于病毒性心肌炎的臨床治療，可通過抗病毒、抗炎、抗氧化、調節免疫等機制發揮作用，療效頗為明顯［6-7］。扶正解毒方能夠扶助正氣，清熱解毒，調節患者機體免疫功能，常用于白血病、肝癌、肺癌等腫瘤患者放化療后的輔助治療。有研究表明扶正解毒方用于兒童病毒性肺炎也具有較好的療效［8-9］，能夠減輕炎癥，改善癥狀，但尚無該方劑用于VMC 的報道。本院前期采用扶正解毒方治療VMC 取得了較好療效，但具體機制還不甚明確。因此，本研究建立大鼠VMC 模型，從Sirt1/FoxO3a 通路及氧化應激方面，探究扶正解毒方緩解VMC癥狀的機制，以期為扶正解毒方的開發應用提供參考。

1 材料

1.1 動物與病毒 Wistar 大鼠90 只，健康雄性，清潔級，6～8 周齡，體質量200 ～220 g，購自吉林大學實驗動物中心［實驗動物生產許可證號SCXK （吉） 2020-0003］。CVB3 病毒懸液由中國科學院院武漢病毒研究所王漢中教授實驗室所饋贈。本實驗經本院動物倫理委員會審批通過（倫理號IACUC-105000296），實驗過程遵循3R 原則。

1.2 試劑與藥物 扶正解毒方（黨參20 g、白術15 g、茯苓15 g、黃芪15 g、黃芩12 g、連翹10 g、敗醬草15 g、薏苡仁30 g、西洋參10 g、北沙參12 g、白芍12 g、五味子10 g、麥冬15 g、瓜蔞15 g、漏蘆10 g、干姜10 g、炙甘草9 g） 藥材購自張仲景大藥房，參考文獻［9］ 報道進行常規煎藥，濃縮成含生藥量2.8、11.2 g/mL 的藥液（即成人用量的1、4 倍），備用。HE 染色液（貨號G1122，上海信帆生物科技有限公司）； TUNEL 染色液（貨號XYA114，上海信裕生物科技有限公司）； 肌酸激酶同工酶（貨號SNDM192，滁州仕諾達生物科技有限公司）； 肌鈣蛋白（貨號MM-0427M1，杭州鉑賽生物科技有限公司）； 肌紅蛋白等ELISA 試劑盒（貨號XG-E101848，上海西格生物科技有限公司）； 丙二醛（MDA） ELISA 試劑盒（貨號YS-E8429，上海研生實業有限公司）； 超氧化物歧化酶（SOD） ELISA試劑盒（貨號NS7247，上海江萊生物科技有限公司）； 晚期氧化蛋白產物（AOPP） ELISA 試劑盒（貨號LCS30824，廈門侖昌碩生物科技有限公司）； Sirt1、FoxO3a、磷酸化FoxO3a （p-FoxO3a）、SOD、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）、過氧化氫酶（CAT）、細胞周期抑制蛋白p27、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3 （caspase3） 抗體 （貨號ab189494、ab109629、ab154786、ab83108、ab256470、ab32572、ab32034、ab184787，英國Abcam 公司）。

1.3 儀器 Gel Doc EZ 型化學發光儀（美國伯樂公司）；CX43 熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

2 方法

2.1 模型建立及分組 參考文獻［10］ 報道方法制備VMC 模型。通過超聲心動圖檢測大鼠Tie 指數，若Tie 指數高于正常值，則認定造模成功。本研究共75 只大鼠造模成功，隨機分為模型組、扶正解毒方低劑量組（28 g/kg）、扶正解毒方高劑量組（112 g/kg）、EX527 組（1 μg/kg）、扶正解毒方＋EX527 組 （28 g/kg 扶正解毒方＋1 μg/kg EX527），每組15 只，另取15 只大鼠，腹腔注射0.1 mL 生理鹽水，作為正常組。扶正解毒方組大鼠灌胃給予2.8、11.2 g/mL 藥液，劑量10 mL/kg，每天1 次； EX527 組大鼠尾靜脈注射1 μg/kgEX527［10］，每3 d 注射1 次； 扶正解毒方＋EX527 組在灌胃給予低劑量扶正解毒方的基礎上尾靜脈注射EX527，各組均連續給藥1 周。給藥期間，監測大鼠一般狀態及死亡數量等。

2.2 心功能檢測 大鼠末次給藥結束后，麻醉，通過彩色多普勒超聲心動圖檢測心臟等容收縮時間（ICT）、等容舒張時間（IRT） 及射血時間（ET），計算Tei 指數用以評估心肌損傷程度，公式為Tei 指數＝ （ICT＋IRT） /ET。

2.3 血清學指標檢測 大鼠麻醉后，腹主動脈采血6 mL，按ELISA 法檢測肌酸激酶同工酶、肌鈣蛋白、肌紅蛋白水平，以及氧化應激指標丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、晚期氧化蛋白產物（AOPP） 水平。

2.4 HE 及TUNEL 法檢測心肌組織病理變化和心肌細胞凋亡率 大鼠處死后，迅速解剖獲取心臟，一部分裝于凍存盒凍存于-80 ℃冰箱； 另一部分采用4%多聚甲醛固定，包埋，制備5 μm 切片。取心肌組織切片，行HE 及TUNEL染色后，于顯微鏡下觀察并拍照，計算細胞凋亡率。

2.5 免疫組化法檢測心肌組織Sirt1 表達 取心肌組織切片，經脫蠟、抗原修復等處理后，加入Sirt1 一抗抗體（1 ∶500） 室溫孵育3 h，加入山羊抗兔IgG 二抗抗體（1 ∶500） 室溫孵育2 h，DAB 顯色，于光鏡下觀察并拍照，通過ImagePro plus 6.0 圖像系統檢測單位面積內Sirt1 陽性染色（紅棕色） 的平均光密度值。

2.6 Western blot 法檢測心肌組織相關蛋白表達 取于-80 ℃冰箱保存的心肌組織，解凍、剪碎后勻漿，提取蛋白，BCA 法檢測蛋白濃度，取100 μg 蛋白進行電泳、轉膜，滴加一抗FoxO3a、p-FoxO3a、SOD、GPx、CAT、p27、caspase-3 （稀釋比例均為1 ∶1 000） 及β-actin 內參抗體（1 ∶2 000），4 ℃孵育過夜，次日滴加山羊抗兔IgG 二抗（1 ∶2 000），37 ℃孵育1.5 h，顯影曝光，通過Image J 軟件對條帶相對灰度值進行定量分析。

2.7 統計學分析 通過SPSS 21.0 軟件進行處理，計量資料以（±s） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較用SNK-q檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 扶正解毒方對VMC 大鼠一般行為的影響 正常組大鼠狀態正常，無死亡出現； 模型組及扶正解毒方＋EX527 組大鼠有4 只死亡，解剖死亡大鼠發現心臟呈白色點狀或條索狀病變； 扶正解毒方各劑量組大鼠無死亡，其飲食活動均趨于正常； EX527 組大鼠死亡8 只，死亡大鼠心臟條索狀病變加重，其飲食及活動量減少。

3.2 扶正解毒方對VMC 大鼠Tie 指數的影響 與正常組比較，模型組大鼠Tie 指數升高（P＜0.05）； 與模型組比較，扶正解毒方各劑量組大鼠Tie 指數均降低（P＜0.05），EX527 組大鼠Tie 指數進一步升高（P＜0.05）； 與扶正解毒方低劑量組比較，扶正解毒方＋EX527 組Tie 指數升高（P＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠Tie 指數比較（±s）

表1 各組大鼠Tie 指數比較（±s）

注： 與正常組比較，△P＜0.05； 與模型組比較，●P＜0.05； 與扶正解毒方低劑量組比較，▲P＜0.05。

組別動物數/只Tie 指數正常組150.28±0.01模型組111.82±0.14△扶正解毒方低劑量組150.87±0.10●扶正解毒方高劑量組150.52±0.05●▲EX527 組72.58±0.22●扶正解毒方＋EX527 組111.89±0.13▲

3.3 扶正解毒方對VMC 大鼠心肌損傷標志物的影響 與正常組比較，模型組大鼠血清肌酸激酶同工酶、肌紅蛋白、肌鈣蛋白水平均升高（P＜0.05）； 與模型組比較，扶正解毒方各劑量組大鼠血清肌酸激酶同工酶、肌紅蛋白、肌鈣蛋白水平均降低（P＜0.05），EX527 組大鼠血清肌酸激酶同工酶、肌紅蛋白、肌鈣蛋白水平進一步升高（P＜0.05）；與扶正解毒方低劑量組比較，扶正解毒方＋EX527 組大鼠血清肌酸激酶同工酶、肌紅蛋白、肌鈣蛋白水平均升高（P＜0.05），但低于EX527 組，見表2。

表2 各組大鼠心肌損傷標志物水平比較（±s）

表2 各組大鼠心肌損傷標志物水平比較（±s）

注： 與正常組比較，△P＜0.05； 與模型組比較，●P＜0.05； 與扶正解毒方低劑量組比較，▲P＜0.05。

組別動物數/只肌酸激酶同工酶/（U·mL-1）肌紅蛋白/（μg·L-1）肌鈣蛋白/（μg·L-1）正常組1531.24±1.5482.02±4.3114.23±1.34模型組11126.64±5.02△484.22±20.34△69.37±4.76△扶正解毒方低劑量組1593.39±3.33●303.66±15.31●40.27±3.12●扶正解毒方高劑量組1562.18±2.04●▲163.53±8.36●▲28.82±2.04●▲EX527 組7245.11±8.02●864.39±48.53●89.19±6.13●扶正解毒方＋EX527 組11129.23±5.11▲488.09±20.35▲68.15±4.16▲

3.4 扶正解毒方對VMC 大鼠心肌組織病理變化及心肌細胞凋亡率的影響 HE 染色可見模型組大鼠心肌細胞水腫、胞漿疏松、壞死且淡染； TUNEL 染色可見模型組大鼠凋亡細胞核染顏色加深，心肌細胞凋亡率高于正常組 （P＜0.05）； 與模型組比較，扶正解毒方各劑量組大鼠心肌細胞水腫、壞死緩解，心肌細胞凋亡率降低 （P＜0.05），EX527 組大鼠心肌細胞水腫、壞死進一步加重，心肌細胞凋亡率進一步升高（P＜0.05）； 與扶正解毒方低劑量組比較，扶正解毒方＋EX527 組大鼠心肌細胞水腫、壞死緩解，心肌細胞凋亡率升高（P＜0.05），但低于EX527 組，見圖1、表3。

圖1 各組大鼠心肌組織HE 及TUNEL 染色圖（×200）

表3 各組大鼠心肌細胞凋亡率比較（±s）

表3 各組大鼠心肌細胞凋亡率比較（±s）

注： 與正常組比較，△P＜0.05； 與模型組比較，●P＜0.05； 與扶正解毒方低劑量組比較，▲P＜0.05。

組別動物數/只凋亡率/%正常組159.19±0.91模型組1135.63±2.24△扶正解毒方低劑量組1526.25±1.49●扶正解毒方高劑量組1518.18±1.04●▲EX527 組746.24±2.72●扶正解毒方＋EX527 組1136.29±1.43▲

3.5 扶正解毒方對VMC 大鼠氧化應激水平的影響 與正常組比較，模型組大鼠血清MDA、AOPP 水平升高（P＜0.05），SOD 水平降低（P＜0.05）； 與模型組比較，扶正解毒方各劑量組大鼠血清MDA、AOPP 水平降低（P＜0.05），SOD 水平升高（P＜0.05），EX527 組大鼠血清MDA、AOPP水平進一步升高（P＜0.05），SOD 水平進一步降低（P＜0.05）； 與扶正解毒方低劑量組比較，扶正解毒方＋EX527組血清MDA、AOPP 水平升高（P＜0.05），但低于EX527組，SOD 水平降低 （P＜0.05），但高于EX527 組 （P＜0.05），見表4。

表4 各組大鼠血清MDA、AOPP、SOD 水平比較（ng/mL，±s）

表4 各組大鼠血清MDA、AOPP、SOD 水平比較（ng/mL，±s）

注： 與正常組比較，△P＜0.05； 與模型組比較，●P＜0.05； 與扶正解毒方低劑量組比較，▲P＜0.05。

組別動物數/只MDAAOPPSOD正常組151.16±0.041.42±0.1230.42±1.12模型組11100.12±10.46△43.33±4.20△8.30±0.80△扶正解毒方低劑量組1563.36±6.35●26.91±2.14●18.93±1.18●扶正解毒方高劑量組1522.09±2.24●▲15.71±1.11●▲25.76±2.13●▲EX527 組7350.99±30.09●82.57±8.10●1.07±0.77●扶正解毒方＋EX527 組11102.11±10.26▲41.72±4.10▲8.72±0.80▲

3.6 扶正解毒方對VMC 大鼠心肌組織Sirt1 陽性表達的影響 正常組比較，模型組大鼠心肌細胞胞漿中Sirt1 陽性表達降低（P＜0.05）； 與模型組比較，扶正解毒方各劑量組大鼠心肌細胞Sirt1 陽性表達升高（P＜0.05），EX527 組大鼠心肌細胞Sirt1 陽性表達進一步降低（P＜0.05）； 與扶正解毒方低劑量組比較，大鼠心肌細胞Sirt1 陽性表達降低（P＜0.05），但高于EX527 組，見圖2、表5。

表5 各組大鼠心肌組織Sirt1 陽性表達比較（±s）

表5 各組大鼠心肌組織Sirt1 陽性表達比較（±s）

注： 與正常組比較，△P＜0.05； 與模型組比較，●P＜0.05； 與扶正解毒方低劑量組比較，▲P＜0.05。

組別動物數/只Sirt1 平均光密度值正常組151.19±0.11模型組110.33±0.04△扶正解毒方低劑量組150.65±0.04●扶正解毒方高劑量組150.92±0.08●▲EX527 組70.14±0.01●扶正解毒方＋EX527 組110.39±0.03▲

3.7 扶正解毒方對VMC 大鼠抗氧化應激蛋白表達的影響 與正常組比較，模型組大鼠心肌組織SOD、GPx、CAT蛋白表達降低（P＜0.05）； 與模型組比較，扶正解毒方各劑量組大鼠心肌組織SOD、GPx、CAT 蛋白表達升高（P＜0.05），EX527 組大鼠心肌組織SOD、GPx、CAT 蛋白表達進一步降低（P＜0.05）； 與扶正解毒方低劑量組比較，扶正解毒方＋EX527 組大鼠心肌組織SOD、GPx、CAT 蛋白表達降低（P＜0.05），但高于EX527 組，見圖3、表6。

圖3 各組大鼠心肌組織SOD、GPx、CAT 蛋白表達免疫印跡圖

表6 各組大鼠心肌組織SOD、GPx、CAT 蛋白表達比較（±s）

表6 各組大鼠心肌組織SOD、GPx、CAT 蛋白表達比較（±s）

注： 與正常組比較，△P＜0.05； 與模型組比較，●P＜0.05； 與扶正解毒方低劑量組比較，▲P＜0.05。

組別動物數/只SOD/β-actinGPx/β-actinCAT/β-actin正常組151.19±0.141.16±0.131.11±0.09模型組110.31±0.04△0.38±0.03△0.43±0.04△扶正解毒方低劑量組150.68±0.05●0.56±0.05●0.72±0.05●扶正解毒方高劑量組150.90±0.09●▲0.99±0.09●▲0.92±0.06●▲EX527 組70.17±0.01●0.11±0.02●0.10±0.01●扶正解毒方＋EX527 組110.39±0.04▲0.36±0.03▲0.40±0.05▲

3.8 扶正解毒方對VMC 大鼠FoxO3a、p-FoxO3a、p27、caspase3 蛋白表達的影響 與正常組比較，模型組大鼠心肌組織p-FoxO3a/FoxO3a、p27 蛋白表達降低 （P＜0.05），caspase3 蛋白表達升高（P＜0.05）； 與模型組比較，扶正解毒方各劑量組大鼠心肌組織p-FoxO3a/FoxO3a、p27 蛋白表達升高（P＜0.05），caspase3 蛋白表達降低 （P＜0.05），EX527 組大鼠心肌組織p-FoxO3a/FoxO3a、p27 蛋白表達進一步降低（P＜0.05），caspase3 蛋白表達進一步升高（P＜0.05）； 與扶正解毒方低劑量組比較，扶正解毒方＋EX527組鼠心肌組織p-FoxO3a/FoxO3a、p27 蛋白表達降低（P＜0.05），但高于EX527 組，caspase3 蛋白表達升高 （P＜0.05），但低于EX527 組，見圖4、表7。

圖4 各組大鼠心肌組織FoxO3a、p-FoxO3a、p27、caspase3 蛋白表達免疫印跡圖

表7 各組大鼠心肌組織p-FoxO3a/FoxO3a、p27、caspase3 蛋白表達比較（±s）

表7 各組大鼠心肌組織p-FoxO3a/FoxO3a、p27、caspase3 蛋白表達比較（±s）

注： 與正常組比較，△P＜0.05； 與模型組比較，●P＜0.05； 與扶正解毒方低劑量組比較，▲P＜0.05。

組別動物數/只p-FoxO3a/FoxO3ap27/β-actincaspase3/β-actin正常組151.15±0.091.13±0.100.92±0.10模型組110.34±0.03△0.43±0.04△1.99±0.20△扶正解毒方低劑量組150.51±0.06●0.72±0.07●1.62±0.16●扶正解毒方高劑量組150.89±0.09●▲0.96±0.08●▲1.36±0.12●▲EX527 組70.18±0.01●0.10±0.01●2.65±0.22●扶正解毒方＋EX527 組110.30±0.03▲0.44±0.04▲2.08±0.20▲

4 討論

傳統醫學中，病毒性心肌炎屬于“心悸” “怔仲” “心水” 等范疇。本病為本虛標實之證，本虛是氣陰兩虛，標實是溫熱毒邪侵襲［11-12］。扶正解毒方中黨參、黃芪補中益氣； 白術、茯苓、薏苡仁、干姜健脾燥濕； 黃芩、連翹、敗醬草、漏蘆四藥合用，清熱解毒； 北沙參、西洋參補氣養陰； 白芍、五味子、麥冬滋陰斂陰、養血柔肝； 炙甘草調和諸藥。上述藥物相互配伍，扶正與驅邪兼顧，治療病毒性心肌炎尤為合適。

CVB3 病毒直接侵犯心肌細胞，引起細胞水腫、破裂、壞死，是引起VMC 發生的重要病因體［13-14］。Tei 指數可綜合評價心肌收縮和舒張功能，在評估VMC 患兒心肌損傷程度中具有較高的應用價值［15-16］。VMC 造模后，大鼠出現死亡、心肌細胞壞死及凋亡嚴重現象，Tei 指數異常升高，且心肌損傷標志物水平異常升高，提示造模成功。扶正解毒方中黃芩、連翹、敗醬草等具有清熱解毒作用，石哲瑋等［17］已證實黃芩中的活性成分漢黃芩苷可抑制CVB3 病毒引起的VMC 小鼠心肌炎癥反應； 曹燦等［18］證實連翹、敗醬草為治療新冠病毒方劑中使用頻率較高的中藥，提示扶正解毒方在治療VMC 領域有潛在的價值。本研究建立VMC模型后采用扶正解毒方進行干預，發現扶正解毒方可抑制VMC 大鼠死亡，緩解心肌細胞水腫、死亡及凋亡現象，扶正解毒方劑量越高，心肌損傷標志物水平釋放及Tei 指數降低越顯著，提示扶正解毒方可緩解VMC 大鼠心肌損傷程度。

CVB3 除直接引起心肌細胞損傷外，還促進心肌細胞內氧自由基釋放，通過激活氧化應激反應來加重心肌細胞損傷［19］?？镄沅h等［3］發現VMC 患者血清中氧化應激產物MDA、AOPP 水平與Tei 指數升高成正比，并認為氧化應激指標與VMC 病情程度關系密切。本研究發現，模型組大鼠心肌細胞組織中氧化應激產物MDA、AOPP 水平升高，而抗氧化物SOD、GPx、CAT 等水平降低，提示VMC 大鼠心肌組織中存在氧化應激反應。扶正解毒方各劑量組大鼠心肌組織抗氧化應激水平升高、氧化應激產物分泌減少，且高劑量效果更佳，提示扶正解毒方可能通過提高抗氧化應激反應來緩解VMC 大鼠心肌損傷作用。

Sirt1/FoxO3a 通路與細胞氧化應激損傷及凋亡關系密切［20］。Sirt1 能夠去乙?；蛄姿峄鞍撞⒄{控多種轉錄因子，參與細胞氧化應激、凋亡、DNA 損傷修復等過程的調控［21］； FoxO3a 蛋白可被Sirt1 磷酸化、乙?；头核鼗揎椊到?，調控抗氧化應激指標SOD 及細胞周期抑制蛋白如p27 等表達，參與細胞氧化應激過程［22］。Sirt1 上調能夠促進FoxO3a 磷酸化，進而增強抗氧化應激、抗凋亡反應，緩解組織及細胞損傷［23］。但Sirt1/FoxO3a 是否參與VMC 心肌損傷過程，還未見報道。本研究發現，Sirt1 在VMC 大鼠心肌細胞胞漿中呈弱陽性表達，FoxO3a 磷酸化水平也降低，其介導的抗氧化應激相關蛋白表達降低，心肌細胞凋亡率及凋亡相關蛋白表達異常升高； 進一步抑制Sirt1 表達后，大鼠死亡增加，心肌損傷程度、氧化應激反應及凋亡反應進一步加重，提示Sirt1/FoxO3a 通路介導的抗氧化、抗凋亡途徑抑制，可能是加重VMC 大鼠心肌損傷的關鍵機制。扶正解毒方劑量越高，大鼠Sirt1/FoxO3a 通路激活越顯著，抗氧化應激、抗凋亡效果越明顯，提示扶正解毒方可通過激活Sirt1/FoxO3a 介導的抗氧化、抗凋亡途徑，緩解VMC大鼠心肌氧化應激損傷。

綜上所述，扶正解毒方可通過促進Sirt1/FoxO3a 介導的抗氧化、抗凋亡途徑激活，緩解VMC 大鼠心肌氧化應激損傷，本研究為闡明扶正解毒方治療VMC 的可能機制提供一定的參考。但VMC 心肌損傷機制復雜，Sirt1/FoxO3a 通路還可能與心肌細胞自噬有關，扶正解毒方緩解VMC 的其他可能機制還有待進一步探究。