基于靶向代謝組學分析糖尿病腎臟疾病血清中苯丙氨酸代謝途徑代謝物的變化*

楊 潔,米 焱,王彩麗

(內蒙古科技大學包頭醫學院第一附屬醫院,內蒙古 包頭 014010)

糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一組以高血糖、胰島素抵抗和胰島β細胞功能障礙為主要特征的慢性代謝性疾病[1]。糖尿病在其發生、發展的過程中會伴隨各種急慢性并發癥的出現,如視網膜、外周神經、微血管病變以及急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)和慢性腎臟疾病(chronic kidney disease,CKD)。其中,糖尿病腎臟疾病(diabetic kidney disease,DKD)是糖尿病最嚴重和最常見的慢性并發癥之一,也是糖尿病致死、致殘的重要原因。2019年糖尿病地圖指出,有15.0%～25.0%的Ⅰ型糖尿病和30.0%～40.0%的Ⅱ型糖尿病患者出現腎臟方面的損傷,而一旦形成DKD,多數患者又將最終發展成終末期腎臟病(end-stage renal disease,ESRD),患病率達33.6%[2]。因此,糖尿病及其并發癥,尤其是糖尿病腎臟疾病已成為一個不可忽視的世界性的健康問題。近年來,因DKD而導致的終末期腎病比例呈上升趨勢,DKD已成為導致終末期腎病需要腎臟替代治療的重要病因。因此,了解DKD發病機制及早期診治,是降低DKD致死、致殘率,提高患者生存質量的關鍵。

DKD是指由糖尿病導致的可累及全腎的慢性腎臟疾病,其病理改變包括早期腎小球肥大、腎小球基底膜增厚、足細胞損傷、腎小球系膜基質擴張和腎小管損傷,后期導致腎小球硬化和腎小管間質纖維化及腎血管病變,最終介導腎損傷。目前DKD的發病機制尚未明確,可能與多因素共同作用有關,但已有研究證實,糖/脂代謝紊亂、氧化應激、炎癥反應、血流動力學異常、遺傳等多種因素均可導致DKD的發病。我國糖尿病患者代謝綜合征并發率高達60.0%～80.0%,多項研究已證實除年齡、高血壓、高血糖等是DKD的獨立危險因素,代謝綜合征也與DKD的發病過程息息相關。

DKD患者體內存在糖、脂和氨基酸代謝等多種代謝通路異常,其中苯丙氨酸作為芳香族氨基酸中的重要一員,其代謝途徑及代謝產物在腎組織損傷中的重要作用及變化規律尚沒得到系統性的觀察及研究。因此,本研究采用超高效液相色譜串聯質譜(ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)法從DKD組及健康對照組的血清樣本中檢測并篩選出具有重要生物學意義和統計學差異的苯丙氨酸代謝通路及其差異性代謝產物,觀察代謝產物的變化規律,闡明DKD患者體內的代謝過程和變化機制,并用于發現DKD早期診斷的生物標志物。

1 對象與方法

1.1對象 選取2021年5月至2021年10月期間包頭醫學院第一附屬醫院腎內科住院部診斷為DKD的患者20例,同期20例健康體檢者作為正常對照(NC組)。疾病組納入標準:符合疾病診斷指南標準[3-5]。健康對照組身體健康、無胃腸道癥狀,無肥胖、高血壓、糖脂代謝紊亂等病史。排除標準:年齡<18歲;患有胃腸道疾病或者進行過腹部手術;處于懷孕期或哺乳期;患有心臟病、肝膽系統疾病、泌尿系統感染、惡性腫瘤、傳染病、風濕病、甲狀腺疾病、其他內分泌科疾病;近3個月體質量改變>10.0%;可伴或不伴高血壓、血脂代謝異常?；颊呒敖】刁w檢者均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1血液樣本收集與處理 所有研究對象禁食12 h,收集清晨空腹靜脈血進行離心,取上清液于無菌凍存管中,進行標記,放在-80 ℃冰箱備用。

1.2.2臨床資料收集 (1)一般資料:性別,年齡,糖尿病病史,高血壓病史,高脂血癥病史,降壓藥、降糖藥、降脂藥等藥物使用情況等;(2)實驗室檢查資料:24 h尿蛋白(urine protein,UP)定量、血肌酐(serum creatinine,Scr)、尿素(Urea)、尿酸(uric acid,UA)、白蛋白(albumin,ALB)、估算腎小球濾過率(glomerular filtration rate,eGFR)、甘油三酯(triglyceride,TG)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HD)、空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)、糖化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin,HbAlc)、甲狀旁腺激素、血紅蛋白(hemoglobin,HB)、白細胞計數、血小板計數、紅細胞計數、空腹及餐后2 h胰島素及C肽等。

1.2.3靶向代謝組學代謝物的提取 (1)從-80 ℃冰箱中取出血漿標本在冰上解凍,渦旋5～8 min;(2)量取20 μL樣品,向樣品加入120 μL 50%甲醇,震動充分混勻,提取樣品中的代謝物,常溫靜置10 min;(3)提取液置于-20 ℃過夜,沉淀樣品中的蛋白質;(4)4 000 r/min離心20 min,轉移上清液代謝物提取液到96孔板;(5)每個樣品等量取出10 μL稀釋液混合成QC樣品;(6)所有代謝樣品在上樣前置于-80 ℃冰箱保存;(7)對所提取的樣本進行隨機上機排序檢測,在樣品前、中、后分別插入QC樣品作為實驗技術重復評估。在正負離子模式下將樣品分別進行質譜掃描檢測。

1.2.4液相部分 (1)液相體系:SCIEX,UK公司的超高壓液相;(2)色譜分析柱:ACQUITY UPLC T3(100 mm×2.1 mm,1.8 μm,Waters,UK);(3)柱溫:35 ℃;流速:0.4 mL/min;(4)流動相:A相:水(1%甲酸);B相:乙腈(1%甲酸);(5)液相梯度設置見表1。

表1 液相梯度設置

1.2.5質譜部分 采集所用的高分辨率質譜儀為TripleTOF 5 600 plus(SCIEX,UK)飛行時間質譜。每個樣本進行一次正離子模式采集和一次負離子模式采集。離子源的遮蔽氣壓為30 PSI(磅每平方英寸),氣體1(輔氣)和氣體2(鞘氣)壓力均設置為60 PSI。源溫度650 ℃。正負離子模式下電壓分別為正5 000 V、-4 500 V。采集數據的模式為IDA(信息依賴性采集)模式。

在一個采集循環中,一級采集范圍為60～1 200 D,一級采集時間為150 ms,然后從一級圖譜中挑選帶一個正電荷(負離子模式下為帶一個負電荷)并且每秒信號積累強度超過100的前12個信號離子進行二級碎裂掃描。整個采集循環耗時0.56 s。

該質譜儀檢測器有4個通道,脈沖射頻電的頻率為11 kHz;檢測器的檢測頻率為40 GHz;四個通道分別記錄每次掃描的粒子信號,共4次后合并轉化成數據。掃描的動態排除時間設置為4 s。

在采集過程中,每間隔20個樣本進行一次儀器準確度校正。同時,每間隔10個樣本進行一次QC品的掃描。用QC間的質量差距來校正整批實驗的系統誤差。

1.2.6差異代謝物篩選 (1)對代謝物進行單變量分析,主要計算代謝物強度在兩表型間的比值,利用T檢驗進行統計學分析,對檢驗結果作多重檢驗分析,主要利用BH(Benjamini-Hochberg)矯正;(2)對代謝物進行多變量分析,主要利用偏最小二乘法判別分析(PLS-DA),得到每個代謝物的變量重要性(VIP);(3)取FC>2倍差異、q<0.05、VIP>1為篩選結果與分析的標準。

1.3統計學方法 多元統計分析:將所得結果導入Simca-P(11.5 version,Umetrics AB,Umea,Sweden)軟件,分別采用無監督分析方法(主成份分析,PCA)及偏最小二乘判別分析(partial least squares-discriminant analysis,PLS-DA),得到不同分組情況下,樣本間的聚類情況,找出與分組相關的體內小分子化合物,根據化合物在樣本聚類中的貢獻度大小,對采用模式識別分析得出的化合物中在各組間的差異進行了兩兩間檢驗分析,從不同臨床意義的角度出發,找出組間差異性較大的化合物。結合生物學意義,發現對機理闡釋、疾病診斷、用藥治療有意義的潛在生物標志物。代謝組學分析:將相關積分值進行中心化和比例換算,應用MarketView軟件同時進行判別分析,尋找出特征差異性代謝物。樣品分布得分圖用于展示不同組間差異。根據多元統計分析中變量的載荷大小,結合F檢驗、t檢驗,篩查出組間具有差異有統計學意義的化合物作為潛在生物標志物,再根據質譜同位素匹配結果和HMDB、METLIN、KEGG等數據庫的檢索結果及對照品及串質譜的鑒別結果,對潛在的生物標志物進行鑒定。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1代謝物檢測質控 總離子流圖(total ion chromatogram,TIC)能夠宏觀反映所有代謝物在液相色譜分離情況,把控樣品整體質譜信號強度。從圖上可以看出,各色譜峰的分離效果良好且峰的數量較多,相應強度較高,說明LC-MS分析條件能滿足代謝組學的分析要求,血清質量樣本可以滿足實驗要求,質譜信號穩定性較好。見圖1。

圖1 總離子流圖TIC

2.2兩組研究者差異代謝物分析 兩組研究者組間比較,綜合多種類聚類分析結果,最終發現差異性代謝產物苯丙氨酸(L-Phenylalanine)、L-色氨酸(L-Tryptophan)、馬尿酸(Hippuric-acid)、5-羥基吲哚-3-乙酸(5-HydroxyIndole-3-acetic-acid)、5-羥色胺(5-Hydroxytryptamine)、犬尿酸(Kynurenine)、吲哚丙酸(3-Indolepropionic-acid)明顯上調(P<0.05),氯胺酮(Kynurenic-acid)、DL-3-吲哚乳酸(DL-Indole-3-lactic-acid)、馬尿酸(Hippuric-acid)、5-羥基吲哚-3-乙酸(5-HydroxyIndole-3-acetic-acid)、D-苯乙?；?L-谷氨酰胺(Phenlacetyl-L-Glutamine)、吲哚丙酸(3-Indolepropionic-acid)Fold change>2,差異具有統計學意義(P<0.05)。其中苯丙氨酸(L-Phenylalanine)、馬尿酸(Hippuric-acid)、D-苯乙?；?L-谷氨酰胺(Phenlacetyl-L-Glutamine)是苯丙氨酸代謝途徑中的代謝產物,可作為苯丙氨酸代謝途徑中的差異代謝物,為后續研究提供生物標志物。見表2。

表2 兩組研究者代謝物差異分析

2.3主成份分析

2.3.1總體樣本主成份分析 對本實驗中所有血清樣本(包括質控樣品)進行PCA分析,PCA得分圖(圖2)結果顯示,組內和組間代謝物的聚類和離散,PC1值為95.57%,PC2值為3.2%,DKD組、NC組和QC相比,代謝情況分離趨勢明顯,代謝物存在明顯差異。而觀察QC組血清的代謝情況,發現聚集趨勢較明顯,提示其血清代謝情況差異較小。

圖2 各組樣品與質控樣品質譜數據的PCA得分圖

2.3.2聚類分析結果 為了表示差異代謝物以及樣本之間的聚類關系,以顏色及深淺代表樣本中代謝物的表達量大小。我們對代謝物的定量信息進行聚類熱圖分析。其中在縱軸方向,可以對樣本進行聚類分析,在橫軸方向可以對各組樣本進行聚類分析。

首先對數據進行歸一化處理,對所有樣品進行聚類熱圖分析,并使用R程序腳本繪制聚類熱圖(圖3)。圖中聚類熱圖顯示,在不同組間的樣本中同一代謝物的聚類情況。

圖3 樣品代謝物含量聚類熱圖

2.4差異代謝物統計

2.4.1DKD與NC組之間的PCA分析 分析DKD和NC兩組PCA結果(圖4),顯示NC組血清樣品聚類很好,DKD組血清樣品離散,提示NC組的代謝情況異質性小,而DKD組血清代謝情況發生變化,且疾病個體異質性較大。進一步分析兩組間的差異,觀察到兩組樣品存在交叉現象,表明DKD組與NC組相比,血清代謝情況存在相同之處。

2.4.2DKD與NC組的PLS-DA分析 DKD與NC組比較的PLS-DA模型參數R2為0.924,Q2為0.891,接近0.9,說明該模型顯示的實驗數據穩定可靠,該模型為出色模型,可用于后續差異代謝物的篩選。見圖5。

圖5 DKD與NC組血清樣品PLS-DA得分圖

2.4.3DKD、NC兩組間差異代謝物熱圖 為了清晰、直觀了解DKD、NC兩組間差異代謝物變化規律,我們對差異顯著的代謝物進行歸一化處理,并繪制聚類熱圖(圖6)。

圖6 兩組間血清差異代謝物比較的熱圖

2.5DKD與NC組血清差異代謝物的代謝通路富集分析 本實驗利用KEGG數據庫對差異代謝物進行注釋、分類和富集分析。按照KEGG中通路類型進行進一步分類,隨后根據差異代謝物分類結果完成代謝通路富集。DKD與NC組對比,排名前25的代謝通路羅列,分別是谷胱甘肽代謝通路、苯丙氨酸和酪氨酸代謝通路、乙酸苯酯代謝通路、蘋果酸-天冬氨酸通路、咖啡因代謝通路、?；撬岽x通路、酮體代謝通路、葡萄糖-丙氨酸循環、尿素循環、丙氨酸代謝通路、天冬氨酸代謝通路、精胺和亞精胺合成通路、精氨酸和脯氨酸代謝通路、亞麻酸和α亞麻酸代謝通路、煙酸和煙酰胺代謝通路、輔酶Q合成通路、核黃素代謝通路、硫酸/亞硫酸鹽代謝通路、色氨酸代謝通路、組氨酸代謝通路。見圖7。

圖7 DKD與NC組間差異代謝物KEGG分類富集圖

2.6DKD組的差異性血清代謝物與臨床指標的相關性分析 DKD患者血清代謝物與臨床指標相關,其中5-羥色胺、L-色氨酸與eGFR、HB、ALB呈正相關,與Urea、UA、SCr呈負相關,苯丙氨酸、犬尿酸、馬尿酸、吲哚丙酸、5-羥基吲哚-3-乙酸、D-苯乙?；?L-谷氨酰胺與血肌酐、空腹血糖、糖基化血紅蛋白呈正相關。見圖8。

圖8 DKD與NC組的差異性血清代謝物與臨床指標的相關性分析

3 討論

糖尿病腎病是糖尿病主要的慢性微血管并發癥之一,發病率為30%～40%,是目前糖尿病患者的主要致死因素,也是近年來逐漸增多的終末期腎病(ESRD)的病因之一[6-8]。預計到2030年全世界糖尿病患者將增加到3.66億[9](占全球人口4.4%)。

DKD的典型病理表現是:早期出現腎小球肥大、腎小球基底膜均質性增厚,中后期出現Kimmelstiel-wilson結節(K-W結節),微血管瘤形成,明顯透明樣變以及纖維帽樣或腎小囊滴狀病變等。DKD的病理生理機制比較復雜,其疾病基礎是糖、脂肪、氨基酸代謝紊亂,在特定遺傳背景和環境因素作用下,通過血流動力學異常、胰島素抵抗(IR)和炎性介質活化等機制引起腎臟損傷。

腎臟是一個復雜的器官,具有分泌和代謝功能,腎臟損傷直接影響血液和尿液中代謝物的水平,反過來,生物體內代謝物水平和種類的變化,間接反映腎臟損傷的原因、機制、進展、預后。但大多數DKD患者早期無任何臨床表現,或被糖尿病癥狀掩蓋,往往不能及時發現。早期DKD,一旦腎臟受累出現持續性蛋白尿,腎臟病變往往是不可逆轉的,最終在短時間內進入ESRD。目前臨床上對于DKD的診斷主要依靠檢測尿微量白蛋白排泄率、腎小球濾過率和腎活檢等。近年來對微量白蛋白尿的出現是否能代表腎臟損害,同時出現后是否必然進展到明顯蛋白尿,最終導致腎衰竭有較多爭議,并且腎活檢存在一定的風險性和操作難度[10]。因此尋找更靈敏、確切的生物標志物進行DKD早期診斷,監測疾病進展和分層治療很有必要。

代謝組學是將生物體作為一個動態的整體來研究內在或外在因素造成的代謝改變情況、代謝物質種類、數量及規律,主要特點包括了整體性及動態性,反映出了生物體狀況的分子集合與自身功能之間的關系[11]。幾乎所有可對生物體健康造成影響的因素,如基因、環境、營養、飲食、藥物干預等,都可在代謝組學信息中得到反映?；诖x組學樣品制備快速,其關鍵技術質譜和核磁共振光譜也應用成熟,數據經生物統計學和生物信息學處理,為新診斷標志物的發現提供了有效的手段和方法。

代謝組學以分子量<1 000 KD的小分子化合物為研究對象,以研究對象及研究目的區分為4個層次:代謝物靶標分析、代謝物指紋分析、代謝物輪廓分析及代謝組分析。代謝物靶標分析是指對一個或多個特定的組進行定性及定量的分析;代謝物指紋分析可同時進行多個代謝物分析,但不具備單一組分分離鑒定的能力;代謝輪廓分析可在限定條件下快速定性及半定量分析特定組織內的代謝產物;代謝組分析則是指定量分析特定組織內的所有代謝產物,并對該產物在干預下或病理生理條件下的動態變化規律進行研究。

代謝組學的研究流程包括采集樣品、樣品預處理、數據采集分析及解釋,主要以分析技術及數據分析為研究平臺。氣相色譜-質譜(GC/MS)和核磁共振(NMR)為主要分析技術。代謝組學的數據分析通常以多/單維數據統計,例如:主成份分析(PCA)、偏最小二乘法-判別分析(PLS-DA)、正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA)等。

糖尿病是由多因素綜合導致的糖、蛋白質、電解質、脂肪等一系列代謝紊亂綜合征,代謝組學利用現代分析技術獲得內源性代謝產物譜圖對機體功能狀態進行分析,因而對于糖尿病的研究非常契合?？v觀前人研究結果可知,代謝組學可對糖尿病發病機制、診斷相關并發癥等幫助甚大,還可對糖尿病患者藥物干預作用進行評價。

已有研究表明在明顯器質性病變之前,糖尿病患者體內的某些相關代謝物已經發生了變化。氨基酸水平的變化也可反映DN患者的腎臟損傷。但關于DKD患者體內代謝產物變化規律的研究較少,并且由于疾病分期不明確,很多代謝產物的變化規律在不同研究中并不一致[12]。大量研究表明脂肪酸、磷脂、氨基酸代謝與DKD病變存在密切關系,其水平變化可提示早期DKD病變,隨后在對患者的生物學標本進行分析時驗證了在細胞試驗中得出的結論[13]。

在本次研究中,通過代謝組學研究,對比差異代謝產物分析發現,相關代謝產物如5-羥色胺、L-色氨酸與估算腎小球濾過率、HB、ALB呈正相關,與Urea、UA、SCr呈負相關,苯丙氨酸、犬尿酸、馬尿酸、吲哚丙酸、5-羥基吲哚-3-乙酸、D-苯乙?；?L-谷氨酰胺與血肌酐、空腹血糖、糖基化血紅蛋白呈正相關。由此可見,以上代謝產物參與到DKD發生、發展的過程中。而在血清差異代謝物篩選中,L-色氨酸、苯丙氨酸、馬尿酸、5-羥基吲哚-3-乙酸、5-羥色胺、犬尿酸、吲哚丙酸、氯胺酮、DL-3-吲哚乳酸、D-苯乙?；?L-谷氨酰胺,這些代謝物的差異具有顯著的統計學意義,可作為差異代謝物,其中苯丙氨酸、馬尿酸、D-苯乙?；?L-谷氨酰胺是苯丙氨酸代謝途徑中的代謝產物,可作為苯丙氨酸代謝途徑中的差異代謝物,為后續研究提供生物標志物。

在對DKD與NC組對比的差異代謝物的代謝通路進行分析發現,共有的代謝通路包括苯丙氨酸和酪氨酸代謝、亞精胺和精胺的生物合成、苯乙酸代謝、谷胱甘肽代謝、酮體代謝、精氨酸和脯氨酸代謝等25條代謝通路。這些代謝通路可能參與了T2DM到DKD疾病的發生、發展過程中,后續可以靶向研究這些通路,為DKD的診治提供依據。

苯丙氨酸代謝異常已在糖尿病患者中被證實[14],然而其在DKD進展中的作用尚未見相關報道。本研究首次探討苯丙氨酸代謝途徑是與DKD進展相關的途徑,并且提示3種相關的血清代謝產物苯丙氨酸、馬尿酸、D-苯乙?；?L-谷氨酰胺與腎功能的惡化呈正相關。

總之,本研究應用靶向代謝組學的手段,探討苯丙氨酸代謝途徑及其差異性代謝產物的變化規律,并分析其與臨床指標的相關性,闡明DKD患者體內的代謝過程和變化機制,并用于發現DKD早期診斷的生物標志物,為DKD診斷物的發現和機制研究提供了有效途徑。