筋骨止痛凝膠化學成分分析

呂凱紅 ，胡玉梅 ，錢夢雨 ，李 璐，劉文君 ，曹 亮，李吉峰，王振中，章晨峰，肖 偉*

（1.中國藥科大學，江蘇 南京 211198； 2.江蘇康緣藥業股份有限公司，江蘇 連云港 222001； 3.中藥制藥過程控制與智能制造全國重點實驗室，江蘇 連云港 222001； 4.江蘇康緣陽光藥業有限公司，江蘇 南京 210046）

筋骨止痛凝膠全方由醋延胡索、川芎、威靈仙、伸筋草、東北透骨草、路路通、海桐皮、防風、花椒、牛膝、薄荷腦、冰片共12 味藥材組成，具有活血理氣、祛風除濕、通絡止痛的功效，臨床上用于改善膝骨關節炎、腎虛、筋脈淤滯等癥狀。由于該方所含藥材眾多、成分復雜，其藥效物質基礎、作用機制尚不明確。目前化學成分研究方面，秦建平等［1］建立了高效液相色譜-質譜指紋圖譜，指認了12 個共有峰； 王偉等［2］利用HPLC 測定了指標成分延胡索乙素和原阿片堿的含量； 劉莉莉等［3］利用GC 測定了揮發性成分冰片和薄荷腦的含量，但缺乏對復方非揮發性成分的全面分析。本研究采用超高效液相色譜串聯四極桿飛行時間質譜聯用（UPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS） 技術對筋骨止痛凝膠非揮發性成分進行快速分離和鑒定，并對其藥材來源進行歸屬，以期全面建立筋骨止痛凝膠化學成分譜，為明確藥效物質、闡明作用機制、提升質量控制水平提供依據。

1 材料

Agilent 1290 infinity 超高效液相色譜，聯用Agilent 6538 Q-TOF 質譜儀，配置電噴霧離子源（ESI）、Agilent MassHunter Qualitative Analysis B.07.00 軟件（美國Agilent公司）； MIKRO 200 高速離心機（德國Andreas Hettich 公司）； Pacific T Ⅱ7 超純水儀 （美國賽默飛公司）； KQ-500DE 數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Metller AL204 電子分析天平［梅特勒-托利多（上海） 有限公司］。

歐當歸內酯A （批號111826-201806）、鹽酸巴馬?。ㄅ?10732-201913）、苦參堿（批號110805-202010）、蘆?。ㄅ?100080-202012）、路路通酸 （批號 111735-201903）、延胡索乙素（批號110726-202020）、升麻素苷（批號111522-201913）、金絲桃苷（批號111521-201507）、綠原酸 （批號110753-201817）、咖啡酸 （批號110885-201703）、補骨脂素 （批號110739-201918）、原阿片堿（批號 110853-201805）、鹽酸黃連堿 （批號 112026-201802）、鹽酸川芎嗪（批號110817-201608）、蛇床子素（批號110822-202111）、黃芩素（批號111595-201808）、鹽酸小檗堿（批號110713-202015）、阿魏酸松柏酯（批號CHB201106）、β-蛻皮甾酮（批號111638-201706） 對照品均購自中國食品藥品研究院； 洋川芎內酯H （批號B21462）、羥基-α-山椒素（批號B26430）、羥基-β-山椒素（批號B26431）、紫花前胡素（批號B50638）、四氫小檗堿（批號B21206）、洋川芎內酯Ⅰ（批號B21463） 對照品均購自上海源葉生物科技有限公司； 丁烯基苯酞 （批號CHB201122）、正丁基苯酞（批號CHB201116） 對照品購自成都克洛瑪生物科技有限公司； 海罌粟堿（批號475-81-0）、東莨菪內酯（批號92-61-5） 對照品購自上海詩丹德標準技術服務有限公司； 去氫延胡索甲素（批號21081004）、延胡索甲素（批號21092302） 對照品購自成都格利普生物科技有限公司； 脫氫海罌粟堿（批號CFN90406） 對照品購自武漢Chem Face 公司；E-藁本內酯（批號20191229） 對照品購自南京森貝伽生物科技有限公司。筋骨止痛凝膠（批號210101，江蘇康緣陽光藥業有限公司）； 處方藥材購自主產區或道地產區，經江蘇康緣藥業股份有限公司王振中研究員鑒定，醋延胡索為罌粟科植物延胡索Corydalis yanhusuoW.T.Wang.的干燥塊莖； 川芎為傘形科植物川芎LigusticumchuanxiongHort.的干燥根莖； 花椒為蕓香科植物花椒ZanthoxylumbungeanumMaxim.的干燥成熟果皮；防風為傘形科植物防風Saposhnikoviadivaricata（Turcz.）Schischk.的干燥根； 牛膝為莧科植物牛膝Achyranthes bidentataBl.的干燥根； 威靈仙為毛茛科植物威靈仙ClematischinensisOsbeck.的干燥根和根莖； 路路通為金縷梅科植物楓香樹LiquidambarformosanaHance.的干燥成熟果序； 伸筋草為石松科植物石松LycopodiumjaponicumThunb.的干燥全草； 東北透骨草為豆科野豌豆屬植物山野豌豆ViciacraccaL.的干燥地上全草； 海桐皮為豆科喬木刺桐ErythrinavariegateL.var.orientalis（L.） Merr 的樹皮。乙腈、甲酸均為色譜純； 其余試劑均為分析純； 水為超純水。

2 方法

2.1 分析條件

2.1.1 色譜 Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）； 流動相乙腈 （A） -0.1% 甲酸（B），梯度洗脫（0～8 min，3% ～15% A； 8～20 min，15%A，20～30 min，15% ～30% A； 30～38 min，30% ～45% A；38～45 min，45% ～60% A； 45 ～48 min，60% ～95% A；48～50 min，95% ～3% A）； 體積流量0.35 mL/min； 柱溫35 ℃； 進樣量2 μL。

2.1.2 質譜 一級全掃描： 電噴霧離子源（ESI）； 正、負離子模式； 裂解電壓135 V； 錐孔電壓65 V； 干燥氣氮氣，溫度350 ℃，體積流量8 L/min； 霧化氣氮氣，壓力40 psi（1 psi ＝6.895 kPa）。二級掃描： 質量掃描范圍m/z50 ～1 500； 碰撞氣氮氣，碰撞能量15 eV。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液制備 取對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解，使各成分質量濃度為20 μg/mL，14 000 r/min 離心10 min，取上清液，即得。

2.2.2 供試品溶液制備 稱取筋骨止痛凝膠約1 g，置于50 mL 具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇20 mL，超聲處理30 min，放冷至室溫，14 000 r/min 離心10 min，取上清液，即得。

2.2.3 單味飲片溶液制備

2.2.3.1 花椒、川芎和防風單味飲片溶液制備 按照筋骨止痛凝膠生產工藝，分別取飲片20 g，加入10 倍量水回流提取2 次，每次1 h，濾過，合并濾液，減壓濃縮，干燥，得干膏。取適量干膏，按 “2.2.1” 項下方法配制成20 mg/mL 的單味飲片溶液。

2.2.3.2 醋延胡索、伸筋草、東北透骨草、路路通、海桐皮、牛膝和威靈仙單味飲片溶液制備 按照筋骨止痛凝膠生產工藝，分別取飲片20 g，加入10 倍量70%乙醇提取2次，每次1 h，過濾，合并濾液，減壓濃縮至小體積，干燥，得干膏。取適量干膏，按“2.2.1” 項下方法配制成20 mg/mL 的單味飲片溶液。

3 結果

3.1 化學成分數據庫的建立 查閱中英文相關文獻，建立延胡索、川芎、威靈仙、伸筋草、東北透骨草、路路通、海桐皮、防風、花椒、牛膝10 味藥材化合物數據庫，包括化合物名稱、結構、分子式、精確相對分子質量、特征碎片離子、所屬化學類型等信息。

3.2 化合物鑒定 利用UPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS 技術，將供試品和對照品溶液在“2.1” 項條件下進樣測定，得到正、負離子的總離子流圖（TIC），見圖1。正、負離子模式下一級質譜檢測得到的精確相對分子質量，利用Agilent MassHunter Qualitative Analysis B.07.00 軟件生成的化合物分子式，選擇誤差在10 ppm 以內的分子式與建立的數據庫進行匹配，推測出可能的化合物，進一步結合Auto MS/MS模式獲得的相應化合物碎片離子信息與對照品和相關文獻的比對進行化合物的鑒定。本研究共鑒定100 個化合物，其中28 個化合物經對照品比對確認，其中化合物2、4～8、10、14～22、28 ～29、32、38、41、44 ～48、50 ～51、53 ～54、56 ～58、60、63、75 ～76、78、91、95 均是含氮化合物； 3、42～43、77、79、80 ～81、83 ～85、97 ～100 均是苯酞類化合物； 23 ～24、26 ～27、30 ～31、33、35、39 ～40、49、52、55、59、61～62 均是黃酮類化合物； 64 和66 是香豆素類化合物； 65、67 ～74、82、86 ～90 是三萜皂苷類化合物； 1、9、11～13、25、34、36～37、92 ～94、96 是其他類化合物，結果見表1。

圖1 筋骨止痛凝膠供試品TIC 圖

表1 筋骨止痛凝膠中的化合物的UPLC-ESI-Q-TOF MS/MS 鑒定

3.3 筋骨止痛凝膠中化合物成分的質譜裂解規律解析

3.3.1 含氮類化合物 筋骨止痛凝膠中的含氮類化合物有生物堿類和酰胺類，生物堿類主要來源于醋延胡索、伸筋草。延胡索藥材的生物堿成分大致可以分為4 個類型［30］，結構見圖2。具體的二級裂解途徑為四氫原小檗堿型生物堿（Ⅰ），A 和D 環的取代基最常見的是羥基、甲氧基和亞甲二氧基，此結構的C 環易發生逆狄爾斯-阿爾得（RDA） 反應，常見的特征碎片離子是m/z165.09，192.10，177.08，化合物32、45～46、50 均為Ⅰ類生物堿，以延胡索乙素（45） 為例，在正離子模式下，化合物45 在一級質譜中的準分子離子峰是m/z356.18 ［M＋H］＋，在二級質譜中，［M＋H］＋經過RDA 反應產生特征碎片離子m/z165.09 和m/z192.10，分別進一步丟失甲基，產生碎片離子m/z150.17，可能的裂解途徑見圖3； 原小檗堿型生物堿（Ⅱ），不會發生RDA 反應，8 位的H 易丟失，丟失CH4形成共軛體系，常見的特征碎片離子包括m/z322.09，323.11，324.12，336.12，化合物47、51、53、56 ～58、60均為Ⅱ類生物堿； 原阿片堿型生物堿（Ⅲ），會發生RDA反應，但是RDA 反應的碎片離子的質荷比加和不等于準分子離子峰的質荷比，一般相差一分子H2O，其典型碎片離子是m/z206.08，化合物38 為Ⅲ類生物堿； 阿樸啡型生物堿（Ⅳ），一般會產生相較于準分子離子峰31.04 Da 的碎片離子，m/z31.04 （NH2CH3） 是很典型的辨識阿樸啡型生物堿的標志。4 個類型的結構見圖2。經與對照品比對，化合物38、41、45、48、50～51、53、57～58 分別確認為原阿片堿、脫氫海罌粟堿、延胡索乙素、海罌粟堿、四氫小檗堿、紫堇堿、巴馬汀、小檗堿、去氫紫堇堿。

圖2 4 種類型的延胡索生物堿

伸筋草中生物堿依據文獻可大致分為2 種類型，含有1個N 原子的生物堿和含有2 個N 原子的生物堿，在筋骨止痛凝膠中檢測到的化合物2、5～8、14、64 均為含有1 個N原子的生物堿； 化合物10、17～18 是含有2 個N 原子的生物堿，該類生物堿最常見的質譜裂解過程為與N 原子相連的甲基的裂解。以化合物10 為例，在正離子模式下，在一級質譜中的準分子離子峰是m/z261.19 ［M＋H］＋，在二級質譜中，［M＋H］＋丟失NH3后形成特征碎片m/z244.16 ［M＋H- NH3］＋，經對照品比對，確認為N-去甲基-α-玉柏堿（N-demethy-α-obscurine），可能的裂解途徑見圖4。

圖4 N-去甲基-α-玉柏堿的二級質譜及可能的裂解途徑

酰胺類化合物主要來源于花椒藥材，在正離子模式下，化合物75～76、78 的酰氨基常裂解產生由于酰胺鍵斷開而產生丟失氨基部分的m/z175.11 碎片離子。以化合物78 為例，其在一級質譜中的準分子離子峰是m/z264.19 ［M＋H］＋，在二級質譜中，［M＋H］＋丟失氨基部分而形成特征碎片m/z175.11 ［M＋H-C4H10NO］＋，失去一分子CO 碎片離子產生m/z147.11 ［M ＋H-C4H10NO-CO］＋，繼續丟失碎片C3H4產生m/z107.08 ［M＋H-C4H10NO-CO-C3H4］＋?；衔?8 經與對照品比對，確認為羥基-β-山椒素，其可能的裂解途徑見圖5?；衔?5 ～76 經對照品比對，分別確認為羥基-ε-山椒素和羥基-α-山椒素?；衔?1 依據碎片離子信息與文獻比對，鑒定為α-山椒素［27］。

圖5 羥基-β-山椒素的二級質譜及可能的裂解途徑

3.3.2 苯酞類化合物 苯酞類化合物來源于川芎，苯酞類化合物裂解時最常見特征為內酯環開裂，含有不飽和側鏈的化合物一般會丟失C2H5和CO 中性分子，化合物42～43、77、79、83 屬于此類苯酞； 含有飽和側鏈的化合物一般會丟失C4H9和CO 中性分子，側鏈還常見丟失H2O 分子，化合物3、80～81 屬于此類苯酞?；衔?2 和43 是同分異構體，經對照品比對，分別為洋川芎內酯I 和洋川芎內酯H?；衔?3～84 的出峰位置很接近，經對照品比對，分別確認為丁烯基苯酞和正丁基苯酞。

以化合物85 為例，在正離子模式下，一級質譜中準分子離子峰為m/z191.10 ［M＋H］＋，在二級質譜中，內酯環開裂失去一分子H2O，產生碎片離子m/z173.09 ［M＋HH2O］＋，失去一分子CO 碎片離子產生m/z145.10 ［M＋HH2O-CO］＋，繼續丟失C2H4碎片離子m/z117.06 ［M ＋HH2O-CO- C2H4］＋，也會重排之后丟失C2H4而產生碎片離子m/z163.11 ［M＋H- C2H4］＋，化合物85 與對照品E-藁本內酯裂解途徑一致，故確定為E-藁本內酯，其可能的裂解途徑見圖6。

圖6 E-藁本內酯的二級質譜及可能的裂解途徑

3.3.3 香豆素類化合物 香豆素類化合物主要來源于防風和花椒，其裂解時一般會丟失CO 和CO2碎片離子，這是因為此途徑有形成更穩定的共軛結構的趨勢?；衔?4 為呋喃香豆素類，化合物66 為簡單香豆素類，兩者均會丟失CO 碎片離子。在正離子模式下，化合物64 在一級質譜中的準分子離子峰是m/z217.04 ［M＋H］＋，在二級質譜中，［M＋H］＋丟失一分子CH3形成特征碎片離子m/z202.02 ［M＋H- CH3］＋，丟失一分子CO 形成特征碎片離子m/z174.02［M＋H-CH3-CO］＋，繼續丟失兩分子CO 形成特征碎片m/z146.03 ［M＋H-CH3-2CO］＋，故確認為花椒毒素，其可能的裂解途徑見圖7； 化合物66 在正離子模式下的準分子離子峰為m/z193.12 ［M＋H］＋，二級碎片離子m/z178.02 ［M＋H-CH3］＋、137.06 ［M＋H-2CO］＋和m/z122.96 ［M＋H-2COCH3］＋，因此推斷為東莨菪素。

圖7 花椒毒素的二級質譜及可能的裂解途徑

3.3.4 黃酮類化合物 黃酮類化合物主要來源于防風、花椒和東北透骨草。黃酮類化合物以2-苯基色圓酮為母核，其二級質譜常發生糖苷鍵斷裂，形成苷元離子。黃酮及其苷類化合物C 環易發生RDA 裂解反應，以及不飽和C 環丟失一分子CO 成五元環，一些苷元會脫H2O、CH3以及C4H4O2碎片。以金絲桃苷（31） 為例，在負離子模式下，峰31 在一級質譜中的準分子離子峰是m/z463.09 ［M-H］-，在二級質譜中，［M-H］-丟失葡萄糖基，產生了特征碎片m/z300.02 ［M-H-Glc］-，繼續丟失一分子CO 形成特征碎片m/z271.02 ［M-H-Glc-CO］-； ［M-H］-也可能經過RDA反應產生特征碎片m/z151.00 和m/z313.08，化合物31 與對照品金絲桃苷的裂解途徑一致，因此將峰31 確認為金絲桃苷，其可能的裂解過程見圖8?；衔?3、24、31 經與對照品和文獻［13，29-30］ 比對，分別確認為蘆丁、升麻素苷、金絲桃苷。

圖8 金絲桃苷的二級質譜及可能的裂解途徑

3.3.5 三萜皂苷類化合物 三萜皂苷類化合物主要來源于牛膝和威靈仙，三萜皂苷類化合物一般是皂苷的糖苷鍵發生斷裂。皂苷所連糖基有葡萄糖、阿拉伯糖、木糖等，依據丟失的質荷比可以判斷糖基的類型。牛膝皂苷和威靈仙皂苷的苷元均為齊墩果酸母核。以chikusetsusaponin Ⅳ（70） 為例，化合物70 在一級質譜中的準分子離子峰m/z925.48 ［M-H］-，在二級質譜中，先丟失1 分子阿拉伯糖基產生碎片離子m/z793.43 ［M-H-Ara］-，丟失葡萄糖基產生碎片離子m/z631.39 ［M-H-Ara-Glu］-，推斷化合物70 是chikusetsusaponin Ⅳ［16］，其可能的裂解途徑見圖9。根據以上裂解規律，峰65、67～69、71 ～74、82、86 ～90，分別確認為clematichinenoside C、huzhangoside B、pen-rha-pen-oleglc-glc、ginsenosideRo、chikusetsusaponinⅣa、achyranthoside C、achyranthoside E、achyranthoside B or bidentatoside I、zingibroside R1、achyranthoside Ⅳ、28-deglucosyl-achyrantho-side C、28-deglucosylchikusetsusa-poninⅣ、28-deglucosychikusetsusa-ponin Ⅳ a、28-deglucosylachyrantho-side E。

圖9 chikusetsusaponin Ⅳ的二級質譜及可能的裂解途徑

4 討論

為獲得較好的分離，本實驗前期考察了流動相，包括0.8%甲酸（含有0.1% 甲酸銨） -乙腈、0.1% 甲酸-甲醇、0.1%三乙胺-乙腈、0.1%甲酸-乙腈等，采用不同梯度進行洗脫，最終確定0.1% 甲酸-乙腈梯度洗脫條件下各成分分離度良好，出峰數目較多。

本實驗通過保留時間、準分子離子峰、二級碎片離子信息對各個色譜峰進行了歸屬，共鑒別100 個化合物，28個化合物經對照品比對得到確認，并推測了含氮類、苯酞類、香豆素類、黃酮類和三萜皂苷類化合物的質譜裂解規律，化合物主要來源于延胡索、川芎、威靈仙，東北透骨草、路路通、海桐皮、防風、花椒，未鑒定出薄荷腦和來源于冰片的化合物，因為薄荷腦和冰片中的化合物為揮發性成分，后期需進一步采用GC-MS 對揮發性成分進行鑒別，完善了筋骨止痛凝膠的物質基礎信息。

本研究結果表明筋骨止痛凝膠主要化學成分為生物堿類、苯酞類、黃酮類和三萜皂苷類，主要來自于延胡索、川芎、海桐皮、花椒等，明確了這些藥味在方中的貢獻，為后續質量標準提升和闡明藥效物質基礎提供了參考。