KRAS 基因3′UTR 多態性與云南漢族人群宮頸癌及宮頸上皮內瘤變的相關性

郭 妮 ，張 承 ，洪 超 ，劉偉鵬 ，姚宇峰 ，嚴志凌

（1）中國醫學科學院 &北京協和醫學院醫學生物學研究所，云南 昆明 650118;2）鎮雄縣人民醫院婦科，云南 鎮雄 657200;3）昆明醫科大學第三附屬醫院婦科，云南 昆明 650118）

宮頸癌是全球范圍內尤其是發展中國家和地區女性最常見的癌癥之一[1]。2016 年，我國宮頸癌新發病例數超過11 萬，發病率在我國女性惡性腫瘤中居第2 位[2]。研究發現，高危型人乳頭瘤病毒（high risk human papilloma virus，HR-HPV）的持續感染是宮頸癌（cervical cancer，CC）發生的必要因素[3]。持續感染HR-HPV 可能會導致宮頸上皮內瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）的發生，并最終可能進展為CC[4]。但并非所有感染HR-HPV 的女性最終都會進展為宮頸癌，近年來的研究發現，遺傳因素可能會影響CIN 和CC的個體易感性差異，尤其是基因組中的單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphisms，SNPs），其與宮頸癌的遺傳易感性的相關性已成一個研究熱點[5-7]。

KRAS基因是最常見的突變致癌基因，超過80%的胰腺癌和超過30%的結直腸癌、膽管癌和肺腺癌攜帶KRAS基因的激活突變[8]。研究表明，位于KRAS基因3′ 非翻譯區（3′U TR）上的SNP 位點與某些癌癥風險和生存率相關，例如結直腸癌、胃癌、乳腺癌等[9-11]。而3′U TR 區域是微小RNA（microRNA，miRNA）參與KRAS基因表達調控的靶向序列，位于該區域的SNP 可能會通過影響miRNA 對KRAS基因表達的調控從而影響疾病的發生及進展[12-13]。

本研究選取KRAS基因中3′U TR 區域上的2個SNP 位點（rs712 和rs7973450），研究其與云南漢族人群CIN 和CC 的相關性。

1 材料與方法

1.1 樣本來源與分組

本研究經云南省腫瘤醫院倫理委員會審查批準（審查編號：KYCS2021193）。在遵循“知情同意”的原則下，隨機選取在云南省腫瘤醫院被診斷為宮頸上皮內瘤變的患者416 例作為CIN 組以及被診斷為宮頸癌的患者961 例作為CC 組，同時，隨機挑選同期參加體檢的健康女性983 例作為該組對照組。納入標準：（1）CIN 和CC 診斷符合國家衛生健康委《中國宮頸癌規范診療質量控制指標（2022 版）》[14]、國際婦產科聯盟宮頸癌臨床分期標準（FIGO 2018）[15]和WHO《宮頸癌前病變篩查和治療指南（2021）》[16]中對子宮頸癌及癌前病變的相關診斷、臨床分類與分期標準；（2）尚未進行放療、化療、免疫檢查點抑制劑和靶向藥物治療；排除標準：（1）未取得完整臨床資料；（2）合并其他惡性腫瘤患者；（3）合并心血管疾病等慢性疾病患者。

1.2 主要試劑和儀器

DNA 提取試劑盒QIAamp DNA Blood Kits（德國QIAGEN，貨號5 110 651 106）；SNP 位點rs712（Assay ID: C_189 219 680_10）和rs7973450（Assay ID: C_189 571 552_10）的基因分型探針Taq-Man?SNP Genotyping Assays（美 國Applied Biosystems）；基因分型試劑盒QuantiNovaTMProbe PCR Kit（德國QIAGEN，貨號208 252）；多功能酶標儀Varioskan LUX3020（美國 Thermo Fisher Scientific）；實時熒光定量PCR 儀LightCycler? 480 Ⅱ（瑞士Roche）。

1.3 全血中基因組DNA 提取

采集研究對象空腹靜脈血，使用試劑盒法從研究對象抗凝全血中分離基因組DNA，并用分光光度計對核酸樣品進行濃度和純度測定，樣品保存于-80 ℃冰箱。

1.4 SNP 基因分型

SNP 位點基因分型檢測的PCR 反應于384 孔板中進行，PCR 反應體系為5 μL：2×Probe PCR Master Mix 2.5 μL，40×TaqMan?SNP Genotyping Assays 0.2 μL，模板DNA（15 ng/μL）1 μL，無菌無酶水1.3 μL。羅氏LightCycler?480 PCR 儀反應程序設置如下：95 ℃預變性2 min，95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸30 s，擴增40 個循環。使用Light-Cycler?480 軟件對基因分型原始數據進行管理與分析。分型實驗設陰性對照，采用無菌無酶水代替模板DNA 進行PCR 反應。

1.5 統計學處理

使用IBM SPSS Statistics 26.0 軟件對數據進行統計學分析。單因素方差分析（One-way ANOVA）用于分析CC、CIN 病例組與對照組間年齡分布差異，P<0.05 為差異有統計學意義。采用哈迪-溫伯格平衡檢驗（hardy-weinberg equilibrium，HWE）分析納入樣本的人群代表性，P<0.05 為差異有統計學意義。使用SHEsis 軟件分析SNP 間的連鎖不平衡關系，并構建單倍型。等位基因、基因型及構建的單倍型與CIN 和CC 發病風險的相關性采用卡方檢驗進行分析，對于多個樣本間的兩兩比較，采用Bonferroni 法對顯著性水平閾值進行校正，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 研究對象分組及樣本均衡性

本研究共納入研究對象2 360 例，包括CIN患者（CIN 組）416 例，CC 患者（CC 組）961 例及健康對照（對照組）983 例。各組間（CIN、CC 和對照組）的年齡差異無統計學意義（P=0.074，F=2.605），見表1。

表1 研究對象分組及均衡性檢驗[（）/n（%）]Tab.1 Grouping of study subjects [（）/n（%）]

表1 研究對象分組及均衡性檢驗[（）/n（%）]Tab.1 Grouping of study subjects [（）/n（%）]

2.2 KRAS 基因3′U TR 區域的2 個SNP 位點與CIN 和CC 的相關性

KRAS基因3′U TR 區域的2 個SNP 位點（rs712、rs7973450）的各基因型頻率在對照組中的分布符合HWE（P>0.05），表明本研究納入樣本具有群體代表性。多組比較分析結果顯示，rs7973450位點在CIN、CC 和對照3 組間的等位基因（P=0.001）和基因型頻率（P=0.005）分布差異均有統計學意義（P<0.05）；rs712 等位基因及其基因型在CIN、CC 和對照3 組間的分布頻率差異無統計學意義（Bonferroni 校正，P>0.017），說明rs712 可能與CIN 和CC 的發生風險無相關性，統計分析結果見表2。進一步對rs7973450 位點在CIN 組與對照組、CC 組和對照組的等位基因和基因型頻率分布差異進行兩兩比較，結果顯示，rs7973450 的A 等位基因可能是CIN（P=0.004，OR=0.651，95%CI0.487～ 0.871）和CC（P=7.00×10-4，OR=0.667，95%CI0.529～ 0.844）發生的保護性因素，見表3。

表2 KRAS 基因2 個SNP 位點在CIN 組、CC 組和對照組間等位基因和基因型頻率分布[n（%）]Tab.2 The allelic and genotypic frequency distribution of the SNPs in KRAS gene among the CIN，CC and control groups[n（%）]

表3 rs7973450 在CIN 組、CC 組和對照組間等位基因和基因型頻率的兩兩比較[n（%）]Tab.3 Pairwise comparison of allele and genotype frequencies of rs7973450 among CIN group，CC group，and control group [n（%）]

2.3 KRAS 基因3′U TR 區域的2 個SNP 位點與CC 不同病理類型和不同臨床分期的相關性

進一步研究了KRAS基因3′UTR 區域的2個SNP 位點在CC 不同病理類型（SCC 和AC）中的分布特征。在多組比較分析中，rs7973450 在各組間的等位基因及基因型分布頻率差異具有統計學意義（P=7.51×10-5），但未觀察到rs712 位點的等位基因及基因型分布頻率差異（Bonferroni 校正，P>0.017），見表4。兩兩比較結果顯示，rs7973450 位點在SCC 和對照組間（P=0.004 和0.013）、AC 和對照組間（P=0.002 和2.00×10-4）的等位基因和基因型分布頻率差異均具有統計學意義。該位點A 等位基因可能是SCC（OR=0.698，95%CI0.546～ 0.894）和AC（OR=0.545，95%CI0.370～ 0.801）的保護性因素，見表5。

表4 KRAS 基因中2 個SNP 在不同病理類型CC 病例組和對照組間等位基因和基因型分布情況[n（%）]Tab.4 The allelic and genotypic distribution of two SNPs inKRASgene among different pathological types of CC case and control groups [n（%）]

表5 rs7973450 在SCC 組、AC 組和對照組間等位基因和基因型頻率的兩兩比較[n（%）]Tab.5 Pairwise comparison of allele and genotype frequencies of rs7973450 among SCC group，AC group，and control group [n（%）]

對KRAS 基因3' UTR 區域的2 個SNP 位點與宮頸癌不同臨床分期的相關性分析結果顯示，rs7973450 位點在各組間的等位基因頻率分布差異具有統計學意義（P=0.007），見表6。進一步進行組間兩兩比較，結果可見，該位點等位基因在I 期組與對照組間的分布頻率差異具有統計學意義（P=0.004），但在Ⅱ期組與對照組、Ⅲ～Ⅳ期組與對照組各組間的分布頻率的差異無統計學意義（Bonferroni 校正，P>0.008），見表7（其余組間的分布差異分析未顯示）。以上結果表明，rs7973450 位點可能與CC 的臨床分期具有相關性，該位點等位基因A 可能是宮頸癌I 期的保護性因素（P=0.004，OR=0.698，95%CI0.528～0.890）。

表6 KRAS 基因中2 個SNP 在不同臨床分期CC 病例組和對照組間等位基因和基因型分布情況[n（%）]Tab.6 The allelic and genotypic distribution of two SNPs in KRAS gene among different clinical stages of CC case and control groups [n（%）]

連鎖不平衡分析結果顯示，KRAS基因3′U TR 區域的2 個SNP 位點rs712 和rs7973450存在強連鎖（D'>0.8）。進一步構建rs712-rs7973450 單倍型，對于分布頻率大于3%的單倍型進行組間分布差異研究。結果顯示，rs712Ars7973450G 這一單倍型在CIN 組（P=4.00×10-4）和對照組、CC 組和對照組間（P=3.84×10-5）的頻率分布差異均具有統計學意義，該單倍型可能與更高的CIN（OR=1.714，95%CI1.269～ 2.314）和CC（OR=1.667，95%CI1.305～ 2.131）發生風險相關；而單倍型rs712A-rs7973450A 可能是CC 發生的保護性因素（P=0.012，OR=0.790，95%CI0.658～ 0.950），但該單倍型與CIN 發生風險無相關性（P=0.064）。另外，單倍型rs712Crs7973450A 在各組間的分布頻率的差異無統計學意義（P=0.539 和0.582），見表8。

表8 KRAS 基因2 個SNP 位點在CIN 組、CC 組和對照組間的單倍型分析[n（%）]Tab.8 Haplotype analysis of two SNP in KRAS gene among CIN，CC and control groups [n（%）]

2.4 KRAS 基因2 個SNP 位點的連鎖不平衡與單倍型構建

連鎖不平衡分析結果顯示，KRAS基因3′U TR 區域的兩個SNP 位點rs712 和rs7973450存在強連鎖（D'>0.8）。進一步構建rs712-rs7973450 單倍型，對于分布頻率大于3%的單倍型進行組間分布差異研究。結果顯示，rs712A-rs7973450G 這一單倍型在CIN 組（P=4.00×10-4）和對照組、CC 組和對照組間（P=3.84×10-5）的頻率分布差異均具有統計學意義，該單倍型可能與更高的CIN（OR=1.714，95%CI1.269～ 2.314）和CC（OR=1.667，95%CI1.305～ 2.131）發生風險相關；而單倍型rs712A-rs7973450A 可能是CC 發生的保護性因素（P=0.012，OR=0.790，95%CI0.658～ 0.950），但該單倍型與CIN 發生風險無相關性（P=0.064）。另外，單倍型rs712Crs7973450A 在各組間的分布頻率的差異無統計學意義（P=0.539 和0.582），見表8。

3 討論

KRAS屬于RAS基因家族，該基因編碼一種小GTP 酶（small GTPase），可作為一種“分子開關”調節下游MAPK 和PI3K 等信號通路的激活，調控細胞的生存、增殖與遷移[17]。近年來研究顯示，KRAS基因突變與多種腫瘤發生相關，而80%以上的KRAS突變發生在其第12、13 和61號密碼子中，大多為編碼區的錯義突變，這些突變造成KRAS功能的改變，使下游信號通路被持續激活，引起細胞的增殖、凋亡異常，從而導致腫瘤的發生[18-21]。而位于KRAS基因調控區域（例如3′U TR 區域）的基因變異可能會通過影響KRAS基因的表達調控，導致KRAS基因相關的信號通路調控異常，從而與腫瘤發生風險相關[22-23]。本研究選取了位于KRAS基因3′U TR 區域的2 個SNPs 位點（rs712 和rs7973450），分析其與云南漢族人群CIN 和CC 發生風險的相關性，發現rs797-3450（A>G）與CIN 和CC 發生風險相關。

近年來，miRNA 作為一種轉錄后調節因子，已成為腫瘤相關研究的一個熱點。miRNA 可通過與靶基因的3′U TR 區域序列互補結合來調節基因表達，發揮癌基因或抑癌基因作用[24-25]。let-7是被廣泛研究的miRNA 家族，在多種腫瘤中發揮作用[26]。研究發現，KRAS基因mRNA 的3′U TR 區域有10 個let-7互補結合位點（let-7 complementary binding sites，LCS），因此，KRAS基因3′U TR 區域的SNPs 位點可能會對let-7對KRAS基因的表達調控產生影響[27]。本研究選取的rs712 就位于let-7基因的LSC1 內，在中國和墨西哥人群中的研究都顯示rs712（T>G）與結直腸癌的發生發展相關，且等位基因T 被認為是腫瘤進展相關的風險因素[28-29]。在胃癌和乳腺癌的研究中同樣發現該位點的T 等位基因與更高的患病風險相關[30]。Lena J Chin 等[31]在針對KRAS基因3′U TR 區域的SNPs 與NSCLC 的相關性研究中發現rs712 與NSCLC 的風險無相關性，這與本研究中該位點在宮頸癌中的結果是一致的。以上研究結果顯示，在不同研究中對rs712 的分析結果不一致，可能是由于rs712 在不同疾病中發揮的作用不一致，或各研究納入的人群遺傳背景以及樣本量的差異造成的。

本研究發現KRAS基因3′U TR 區域的另一個SNP 位點rs7973450 與云南漢族人群CIN、CC 發生風險相關，該位點的A 等位基因可能與更高的CIN 和CC 發生風險相關。Fu 等[32]研究發現rs79-73450（A>G）與腎母細胞瘤的發生風險無相關性，Qian 等[33]的研究也報道了該位點與中國南方漢族人群神經膠質瘤的發生風險無相關性，而Lin等[34]的研究發現該位點的GG 基因型可以增加神經母細胞瘤的發病風險。目前針對該位點的研究仍較少，且不同研究結果并不一致，這可能是由于不同的疾病類型、納入人群的遺傳背景以及樣本量大小的差異造成的。鑒于本研究發現的該位點與云南漢族人群CIN 和CC 發生風險相關性，未來應該在更大的樣本量和不同人群中研究該位點與CIN 和CC 之間的關聯，并且可以通過功能研究進一步闡明該位點與CIN 和CC 發生風險相關的機制。

本研究結果顯示，位于KRAS基因3′U TR 區域的rs712 和rs7973450 之間存在強連鎖關系，且2 個SNP 構建的單倍型rs712A-rs7973450G 與更高的CIN和CC發生風險相關。Ruta Insodaite 等[35]也觀察到該單倍型與喉鱗狀細胞癌LSCC 患者的陽性淋巴結狀態相關，這提示單倍型rs712A-rs79-73450G 可作為一種候選的腫瘤易感性的分子標記進行進一步的研究。

綜上所述，本研究發現位于KRAS基因3′U TR 的SNP 位點rs7973450 及其相關的單倍型可能與云南漢族人群CIN 和CC 的發病風險相關。該位點位于KRAS基因3′U TR 區域，因此，該位點及其相關的單倍型可能是通過影響KRAS基因相關miRNA 與KRAS基因mRNA 的相互作用來影響KRAS基因的表達及功能，從而在CIN 與CC 的疾病進展中發揮作用，但具體機制仍需進一步的功能研究來闡明。