鐵死亡抑制因子KIF20A 對食管癌細胞生物學行為及鐵死亡的影響

熱則耶·麥麥提祖農 ，李秀娟 ，劉 玲 ，李 卉

（1）新疆醫科大學基礎醫學院生物化學與分子生物學教研室;2）病理生理學教研室;3）中心實驗室，新疆 烏魯木齊 830000）

食管癌（esophageal carcinoma，EC）是常見的消化道惡性腫瘤之一，據國際癌癥研究中心全球統計報告顯示2020 年我國食管癌新發病例以及新增死亡病例均超過了世界總數的50 %[1]。食管癌有2 種組織學亞型，其中近90 % 的食管癌患者為食管鱗狀細胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）患者[2]。雖然ESCC 中晚期患者的治療方案正在不斷優化，但患者5 a 生存率依然很低[3]。

鐵死亡是2012 年首次被提出的一種非凋亡形式的細胞死亡，其發生依賴于鐵離子，過多的鐵離子誘導更多的氧自由基產生，而不斷累積的氧自由基攻擊細胞膜中的多不飽和脂肪酸，使其過氧化，進一步導致細胞膜的破裂，最終誘發細胞的死亡[4]。其實細胞內氧自由基產生來源有很多，由于細胞內含有強大的抗氧化系統在不斷的阻斷和清除過多產生的氧化物，細胞才能在氧化和抗氧化物的動態平衡下維持著生命活動[5]。鐵死亡的發生受多基因的共同調控，通過前期生物信息學分析篩選出2 個ESCC 中高表達的鐵死亡相關基因，分別是RRM2 和KIF20A。其中KIF20A 被認為是鐵死亡抑制因子[6]。此外，KIF20A 作為驅動蛋白家族成員，參與細胞有絲分裂過程，調節細胞增殖，在多種腫瘤中發揮著促癌基因的作用[7]，而KIF20A 在ESCC 中的作用有待進一步研究。該研究旨在探究KIF20A 對ESCC 細胞生物學行為以及鐵死亡的影響。

1 材料與方法

1.1 數據來源

ULCAN（https://ualcan.path.uab.edu/index.html）是一個開放式癌癥數據分析網站[8]，其可提供公開可用的癌癥OMICS 數據，其中包括癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）。從ULCAN 數據庫中獲取EC 及正常組織RNA-seq 數據。GEO（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）數據庫是各種高通量數據的公共數據庫，從GEO 數據庫中獲取GSE75241 數據集（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/GSE75241）其包含15 對ESCC 及配對正常組織的基因表達譜信息。FerrDb（http://www.zhounan.org/ferrdb/current/）是鐵死亡調節基因和鐵死亡相關疾病檢索及可獲取網站，從中獲取鐵死亡相關基因集。

1.2 主要試劑與儀器

胎牛血清購于美國Sigma-Aldrich 公司；青鏈霉素，RPMI1640 購于美國BI 生物公司，Opti-MEM，Lipofectamin3000 購于美國Thermo Fisher公司；10 % SDS-PAGE 凝膠試劑盒購于北京博泰斯生物技術有限公司；PVDH 膜購于瑞士Roche公司；脫脂奶粉購于德國Biofroxx 公司；KIF20A抗體購于美國Santa cruz 公司，型號sc-374 508；GAPDH 及山羊抗兔IGg、山羊抗鼠IGg 均購于北京博奧森公生物技術有限公司；CCK-8 試劑購于北京博奧森生物技術有限公司，型號BA00208；基質膠Matrigel 購于美國BD 公司；Transwell 細胞培養小室購于美國康寧公司；嘌呤霉素、ECL化學發光底物、4 % 多聚甲醛均購中國Biosharp公司；0.1 % 結晶紫、DMSO、GSH 檢測試劑盒、MDA 檢測試劑盒均購于北京索萊寶生物科技有限公司；鐵死亡誘導劑RSL3 購于美國MCE 公司；全波長酶標儀購于美國BIO RAD 公司；倒置顯微鏡購于日本Nikon 公司。

1.3 細胞株及細胞轉染

本研究所用食管鱗癌Eca109 細胞購自中國科學院細胞庫。在10 % 胎牛血清+1 % 青鏈霉素+RPMI1640 完全培養基，37 ℃、5 % CO2培養箱中培養。KIF20A 敲低慢病毒由漢恒生物科技有限公司設計，分別是shKIF20A-1: CCGTTCCTGCA TGATTGTCAA，shKIF20A-2:CCGATGACGATGTCG TAGTTT，空載作為對照組。按照半體積病毒感染法進行病毒感染，病毒MOI 值分別是30 和10。感染48 h 后以1 mg/L 的嘌呤霉素連續進行3 次篩選。KIF20A 過表達質粒由上海吉凱基因公司設計，過表達質粒在Opti-MEM 中稀釋，質粒濃度分別是1.5 μg 和2 μg，用Lipofectamin3000 轉染至細胞中，KIF20A 敲低組用sh-KIF20A 來表示，KIF20A 過表達組用OE-KIF20A 來表示。

1.4 Western blot 檢測轉染效率

Western blot 實驗檢測KIF20A 敲低/過表達轉染效率。蛋白樣品在10 % SDS-PAGE 凝膠中進行電泳，PVDF 膜濕轉1.5 h，用5% 脫脂牛奶封閉，抗體孵育KIF20A（1∶200），GAPDH（1∶4 000），4 ℃過夜，孵育二抗山羊抗兔IGg、山羊抗鼠IGg（1∶10 000）常溫1 h，滴加ECL 化學發光底物顯影。結果在Fiji Image J v2.3.0（美國）軟件中進行灰度值掃描。

1.5 CCK-8 法檢測細胞活力

KIF20A 敲低/過表達細胞5×103個/孔的密度接種于96 孔板中，實驗分組為KIF20A 敲低組和對照組、KIF20A 過表達組和對照組，每組分別設計3 個平行副孔，分別在12 h，24 h，36 h 和48 h 時更換含10 % CCK-8 溶液的培養基，用全波長酶標儀在450 nm 測量吸光度。每次實驗至少設計3 個平行復孔，實驗均重復3 次。

1.6 Transwell 侵襲實驗

實驗前24 h 將所需基質膠Matrigel 轉移至4 ℃，其以1∶8 比例與無血清培養基稀釋，5×10-5L/孔滴加至小室。待基質膠成膜，上室為無血清培養基細胞懸液（細胞濃度為2.5×108個/L），下室為20%血清的完全培養基，實驗分組為KIF20A敲低組和對照組、KIF20A 過表達組和對照組，每組分別設計3 個平行副孔。培養48 h 后進行4%多聚甲醛固定，0.1 %結晶紫染色，在倒置顯微鏡下隨機拍取3 個視野，用Fiji Image J v2.3.0（美國）軟件計數。實驗重復3 次。

1.7 細胞劃痕實驗

實驗分組為KIF20A 敲低組和對照組、KIF-20A 過表達組和對照組，每組分別設計3 個平行副孔。KIF20A 過表達組實驗：將細胞接種于6 孔板，待細胞密度達90 % 時對細胞進行轉染，按照轉染說明，在轉染6 h 后進行換液，隨后用200 μL 滅菌槍頭筆直劃線并拍照記錄，此時為0 h的遷移率。待48 h 后給細胞換液后進行第2 次拍照，Fiji Image J v2.3.0 軟件掃描劃痕面積，通過以下公式計算遷移率（0 h 劃痕面積-48 h 劃痕面積）/0 h 劃痕面積。KIF20A 敲低組實驗：將原先構建的KIF20A 穩定敲低及對照組細胞接種于6 孔板，待細胞貼壁后進行劃線，隨后步驟如同上述。每次實驗至少設計3 個平行復孔，實驗均重復3 次。

1.8 最佳藥物濃度篩選

鐵死亡誘導劑RSL3 干粉劑在DMSO 中溶解，配制成10 mmol 的母液，隨后稀釋至以下濃度：0.1 μmol，0.5 μmol，1 μmol，5 μmol，10 μmol，30 μmol，50 μmol，同時DMSO 為對照組。細胞按5×103個/孔的密度接種于96 孔板中，每個濃度及對照組分別設計3 個平行副孔。加藥24 h 后在倒置顯微鏡下拍照，CCK-8 法測量吸光度。最后在Graphpad Prism9 軟件非線性擬合方式計算出半抑制濃度IC50值（half maximal inhibitory concentration）。

1.9 GSH 及MDA 含量測定

在Eca109 細胞中建立KIF20A 敲低/過表達模型后分別加入RSL3 誘導Eca109 細胞發生鐵死亡，通過檢測GSH 及MDA 含量以表示各組細胞間的鐵死亡水平。實驗分組為KIF20A 敲低組和對照組、KIF20A 過表達組和對照組，每組分別設計3個平行副孔。細胞處理24 h 后，研磨細胞取上清，分別用GSH 及MDA 試劑盒進行含量測定。按照說明書操作步驟，GSH 提取統一每組細胞數為2.5×106個，加入5×10-4L 提取液，MDA 提取統一每組細胞數為5×106個，加入1×10-3L 提取液開展后續操作。

1.10 統計學處理

采用SPSS 26.0 統計軟件進行統計學分析。計量資料兩獨立樣本組間比較，若服從正態分布且方差齊，采用兩獨立樣本t檢驗，以均數±標準差（）表示，不服從正態分布的計量資料采用非參數Mann-Whitney 檢驗。以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 KIF20A 的生物信息學分析

首先，從TCGA 數據庫中獲取了食管癌差異表達的前50 個上調基因，見圖1A。GEO 數據庫中獲取GSE75241 作為驗證數據集，見圖1B，PCA 圖顯示此數據集癌和癌旁分組具有顯著區別，見圖1C。隨后從 FerrDb 中獲取鐵死亡相關基因，取三者交集，結果顯示有2 個重疊基因，分別是RRM2 和KIF20A，其中選擇KIF20A 為研究的目的基因，見圖1D。

圖1 KIF20A 的表達譜分析Fig.1 Analysis of expression profile of KIF20A

2.2 KIF20A 敲低及過表達細胞的構建

以不同病毒滴度（MOI）構建穩定敲低細胞株（Eca109 細胞），采用Western blot 法檢測干擾效率。與對照組比較，shKIF20A-1 組MOI 值為30時目的分子表達量降低，差異具有統計學意義（P<0.01），因此選取此條件開展后續實驗，見圖2A，2B。在Eca109 細胞中分別轉染1.5 μg 和2 μg 質粒，結果顯示KIF20A 質粒濃度為2 μg 時目的分子表達量高于對照組，差異具有統計學意義（P<0.01），見圖2C、圖2D。

圖2 Western Blot 檢測KIF20A 敲低/過表達效率[（），n=3]Fig.2 Western Blot detection of KIF20A knockdown/overexpression efficiency [（），n=3]

2.3 敲低/過表達 KIF20A 對Eca109 細胞增殖能力的影響

通過CCK-8 法檢測各組細胞的增殖能力，結果顯示KIF20A 敲低組細胞增殖能力在36 h 和48 h表現出明顯的抑制作用，且吸光度值低于對照組，差異具有統計學意義（P<0.01），見圖3A～3B。KIF20A 過表達組細胞吸光度值在36 h 和48 h 高于對照組，差異具有統計學意義（P<0.05，P<0.01），見圖3C～3D。上述結果提示，KIF20A 影響Eca-109 細胞的增殖能力，并且起正向促進作用。

圖3 CCK-8 法檢測KIF20A 敲低/過表達組細胞增殖能力[（），n=3]Fig.3 The proliferation ability of KIF20A knockdown/overexpression group was detected by CCK-8 assay [（），n=3]

2.4 敲低/過表達 KIF20A 對Eca109 細胞侵襲能力的影響

實驗結果顯示，KIF20A 敲低組侵襲細胞數低于對照組，差異具有統計學意義（P<0.01），見圖4A～4B。KIF20A 過表達組侵襲細胞數高于對照組，差異具有統計學意義（P<0.001），見圖4C～4D。上述結果提示，KIF20A 促進Eca109 細胞的侵襲能力。

圖4 Transwell 侵襲實驗檢測KIF20A 敲低/過表達組細胞侵襲能力[（），n=3]Fig.4 The invasion ability of KIF20A knockdown/overexpression group was detected by Transwell invasion assay [（），n=3]

2.5 敲低/過表達 KIF20A 對Eca109 細胞遷移能力的影響

細胞劃痕實驗結果顯示，劃痕后48 h，KIF20A 敲低組細胞遷移能力明顯降低，愈合率低于對照組，差異具有統計學意義（P<0.05），見圖5A～5B。KIF20A 過表達組細胞遷移能力明顯升高，愈合率高于對照組，差異具有統計學意義（P<0.05），見圖5C～5D。以上結果提示，KIF20A對Eca109 細胞的遷移能力起正向促進作用。

圖5 細胞劃痕實驗檢測KIF20A 敲低/過表達組細胞遷移能力[（），n=3]Fig.5 Cell migration ability of KIF20A knockdown/overexpression group was detected by cell scratch assay[（），n=3]

2.6 Eca109 細胞鐵死亡模型的構建

給細胞分別加入濃度為0.1 μmol，0.5 μmol，1 μmol，5 μmol，10 μmol，30 μmol，50 μmol 的RSL3 稀釋溶液，24 h 后CCK-8 法檢測細胞活力，結果顯示，Eca109 細胞在RSL3 的作用下細胞形態發生明顯的改變，加藥組較DMSO組細胞，體積減小，形態顯皺縮，紅色箭頭所指，見圖6A～6B。此外，與對照組相比0.5 μmol，5 μmol，10 μmol，30 μmol，50 μmol 組細胞活力降低，差異具有統計學意義（P<0.001），見圖6C。進一步計算得出Eca109 細胞的IC50值為5.128 μmol。

圖6 CCK-8 法檢測RSL3 誘導的Eca109 細胞活力[（），n=3]Fig.6 Eca109 cell viability induced by RSL3 was detected by CCK-8 [（），n=3]

2.7 敲低/過表達 KIF20A 對Eca109 鐵死亡的影響

檢測各組細胞鐵死亡水平結果顯示，KIF20A敲低組細胞經RSL3 誘導后GSH 含量低于對照組（P<0.05），見圖7A，而MDA 含量高于對照組（P<0.01），見圖7B。RSL3 誘導后，KIF20A 過表達組細胞GSH 含量高于對照組（P<0.05），見圖7C，MDA 含量低于對照組（P<0.001），見圖7D。以上結果提示，KIF20A 的下調可以增強細胞鐵死亡，而KIF20A 的高表達保護Eca109 細胞不發生鐵死亡。綜上所述，在Eca109 細胞中，敲低KIF20A的表達促進鐵死亡的發生，而過表達KIF20A 可以抑制細胞的鐵死亡。

圖7 GSH 和MDA 含量檢測[（），n=3]Fig.7 GSH and MDA content were detected [（），n=3]

3 討論

鐵死亡是一種新型的細胞死亡方式，其是鐵離子介導的氧自由基累積所誘發的氧化損傷過程[9]。ESCC 中關于鐵死亡的研究，早些年有報道顯示ESCC 患者血清中含有濃度較高的MDA，而抗氧化類酶的活性較低，研究結果提示ESCC 患者處于高氧化應激狀態[10]。隨后的研究也明確指出ESCC 組織中DNAJB6 的低表達減少對下游鐵死亡抑制因子 GPX4 的抑制作用，從而減少ESCC 中的鐵死亡[11]。類似的研究結果提示著ESCC 細胞通過抑制其本身的鐵死亡從而制造利于自身生長的環境。

鐵死亡與腫瘤細胞的上皮間質轉化，免疫細胞浸潤，化療耐藥性等生物特性有關。有大量研究指出，多種抗癌藥物除了具有傳統的抑癌作用外，還可以通過加速細胞的鐵死亡從而達到更高的抑制作用。比如，雄黃激活鐵死亡通路抑制食管癌的進一步發展[12]，同樣的還有冬凌草甲素[13]，五氨基酮戊酸[14]等，由于鐵死亡通路復雜，故涉及眾多基因的調控，因此，針對鐵死亡通路上的靶點設計及研發靶點藥物的選擇也更多。

本研究從鐵死亡的角度出發，通過生物信息學分析確定了ESCC 中差異表達的鐵死亡相關基因，即RRM2 和KIF20A。結合分子功能以及在鐵死亡通路中的作用，確定KIF20A 為研究的目的基因。以往的腫瘤研究中KIF20A 的功能研究以促進癌細胞有絲分裂和增殖能力為主，如卵巢癌[15]和肝癌[16]等研究中，KIF20A 被提及為促進癌癥驅動的分子。隨著鐵死亡機制研究的深入，KIF20A 以間接的形式抑制細胞鐵死亡的功能揭示[5]，因此本研究結合KIF20A 的以上2 個功能，在食管癌Eca109 細胞中進行了腫瘤細胞惡性表型以及鐵死亡方面的研究。

為了驗證KIF20A 對Eca109 細胞增殖，侵襲遷移能力的影響，在細胞水平對KIF20A 進行了敲低及過表達處理，結果顯示，KIF20A 對Eca109細胞的增殖，侵襲遷移能力起正向促進作用。為了探究KIF20A 在ESCC 細胞鐵死亡中的作用，通過敲低/過表達KIF20A 后建立鐵死亡應激模型，結果顯示KIF20A 的表達下調使Eca109 細胞對RSL3 誘導的鐵死亡更加敏感，MDA 含量增加，GSH 含量降低，說明KIF20A 敲低引發較高水平的鐵死亡，而KIF20A 過表達組結果與之相反。以上結果與KIF20A 的鐵死亡抑制功能相符，因此筆者認為ESCC 組織中高表達的KIF20A 可能通過抑制鐵死亡的方式給予ESCC 細胞更多的生長空間，并且協助增強ESCC 細胞的增殖，侵襲遷移能力，有望成為ESCC 患者潛在的干擾及藥物研發靶點。本研究結果屬于初步探究KIF20A對ESCC 細胞生物學行為及鐵死亡表型的影響，具體分子機制還需進一步探索及驗證。