MSC-exo 一種新型細胞遞送工具轉運靶向基因調控胰腺癌增殖效應分析

朱 磊，李瑞雪，鮑長磊，黃晨宸，梁書鑫，趙振林，朱 洪

（深圳瑞普遜干細胞與再生醫學研究院，廣州 深圳 518038）

胰腺惡性腫瘤90%是胰腺導管腺癌，惡性程度高，起病隱匿，進展迅速[1]?；颊咴缙诎Y狀不典型，大多數在臨床治療時已處于臨床診斷晚期[2]。近來，胰腺癌的發病率在全球范圍內呈上升趨勢，2021 年的統計數據顯示[3]，在美國所有惡性腫瘤中，胰腺癌發病率在男性中排名第10，在女性中排名第9，在癌癥相關死亡率中排名第4。據中國國家癌癥中心2021 年統計[4]，中國胰腺癌易發中年男性，惡性腫瘤相關死亡率排名第6。隨著影像學、內窺鏡檢查、病理學等學科的發展，癌癥的診斷水平有所提高。根治性胰十二指腸切除術、吉西他濱或替吉奧輔助化療的臨床運用，為胰腺癌的有效性治療帶來了機遇。

增殖和轉移是胰腺癌患者死亡的主要原因[5]。以前的研究發現miRNAs 是調節這2 種生物行為的關鍵因素[6-7]?；陲@微解剖和微陣列芯片分析技術的研究結果，與正常胰腺導管細胞相比，miR-10b 在胰腺癌細胞中顯著升高，且miR-10b的高表達與患者生存率差呈正相關[8]。此外，miR-34b 在胰腺癌中的表達降低，通過CpG 甲基化抑制腫瘤轉移[9]。有趣的是，miR-126 表達在浸潤性導管腺癌中顯著降低，而miR-126 表達增加抑制腫瘤侵襲和上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）能力[10]。這些miRNA 與胰腺癌的轉移、侵襲和預后相關，但調控這些過程的機制尚不清楚。因此，miRNA 的治療方法仍需進一步研究。

最近，miR-450a-5p 在各種癌癥中被廣泛研究[11-12]。Zhang 等[13]采用生物信息學方法，報道miR-450a-5p 可能通過參與MET 通路影響肺癌的發展。此外，miR-450a-5p 被證實通過靶向WISP2促進成脂分化；在胃癌中，它異常表達影響細胞增殖、遷移和侵襲[14]。然而，miR-450a-5p 在胰腺癌中的作用機制尚不清楚。

外泌體是多泡體與質膜融合時釋放到細胞外環境的膜泡[15]。以往的研究[16]已經報道，外泌體可以有效地傳遞生物藥物，然后通過分子途徑靶向和識別腫瘤細胞，實現精確的藥物傳遞。本研究旨在探索miR-450b-5p 在胰腺癌中的表達，將miR-450a-5p 轉染間充質干細胞來源的外泌體（MSC-exo-miR-450a-5p），并探討其下游靶基因，為胰腺癌的治療提供潛在靶點。

1 材料與方法

1.1 數據來源

“STARBASE”（http://starbase.sysu.edu.cn/pan-Cancer.php）是1 個在線非編碼RNA 研究數據庫?！癙AN-CANCER”軟件可用于分析32 種腫瘤組織與正常組織中miRNA 和基因表達的差異。納入患者資料主要來源于癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA ）。用PITA、miRanda 和miRmap 篩選miR-450a-5p 靶點。

1.2 方法

1.2.1 MSC-exo 提取及細胞轉染

人正常胰腺細胞系（HPC-Y5）、人胰腺癌細胞系（CFPAC-1、PANC-1）和人骨髓間充質干細胞系由中國科學院昆明動物研究所捐贈。常規培養于含10%FBS 的RPMI-1 640 培養基（Gibco）中。當hMSCs 在完全培養基中的增殖率達到80%～90%時，用MEM 培養基代替原培養基，在37 ℃、5%CO2培養箱中培養72 h。取培養上清，以3 000 r/min離心30 min，去除細胞碎片，用0.22 μm 濾膜過濾，去除可能的凋亡小體。利用Exosome 分離試劑盒沉淀MSC-exo。Exo-Fect Exosome 轉染試劑盒（EXFT10A-1，System biosciences）將核酸直接轉移到分離的外泌體中。將miR-450a-3p、Exo-Fect 試劑和分離的hMSC 外泌體混合均勻后與靶細胞共培養。用脂質體2000（Invitrogen）轉染Pc-BZW2 和Pc-NC。

1.2.2 外泌體形態鑒定用TEM 觀察了樣品中外泌體的形態結構和大小。將樣品滴加到銅網中，60 s 后，用濾紙吸干表面懸浮液。滴加醋酸鈾試劑反應15 s，再用濾紙再次除去表面浮液。在白熾燈下干燥后，在透射電鏡下觀察并拍照。外泌體多為碟形，直徑大于100 nm，具有明顯的雙層膜結構[17]。

1.2.3 NTA 粒度分析過濾新鮮提取的外泌體，用磷酸鹽緩沖液稀釋，然后緩慢注入NTA 儀器（Malvern Pan alytical，Malvern，UK），分析外泌體粒徑。

把農產品加工作為推進農業一、二、三產業融合的突破口，通過制定扶持發展規劃，制定優惠政策，整合相關資金，集中扶持發展農產品冷鏈物流建設，支持開展農產品初加工，鼓勵農業龍頭企業開展精深加工，延長產業鏈條，推動了農產品加工企業和加工基地蓬勃發展。目前已建成國家級農業產業化重點龍頭企業1家、省級4家，其中年銷售收入達1億元以上的龍頭企業2個，年銷售收入達2 000萬元以上的龍頭企業15個，建成省級現代農業示范園區1個，累計注冊農民專業合作社655家，認證家庭農場385家。通過多層次、多途徑的扶持引導，有效整合了資源，提升了市場競爭能力，形成了對外開放的整體合力。

1.2.4 CFPAC-1 細胞對MSC-exo 的攝取將CFPAC-1 細胞以2×105個細胞/孔接種于35 mm培養皿中，并在37 ℃培養箱中培養過夜。將染色液（PKH26，Sigma-Aldrich，USA）加入MSCexo 中，混合，然后在4 ℃下（2×105g）1 h。再懸浮后加入CFPAC-1 細胞培養6 h，用4%多聚甲醛固定30 min，加入2 mg/mL 甘氨酸中和過量醛基，搖瓶培養5 min，共加入滲透劑1 mL，孵育10 min，以1∶1 000 的體積比加入DAPI 染色液。樣品用PBS 清洗，在激光共聚焦顯微鏡下拍照（LSM5 Live Carl Zeiss，Germany）。

1.2.5 RT-qPCR 分析使用TRIzol 試劑（Invitrogen，CA）從外泌體和細胞中提取RNA，后立即進行反轉錄。提取的總RNA 嚴格按照miScript II RT 試劑盒（QIAGEN，GER）的指示反轉錄為cDNA，然后進行實時熒光定量PCR。在ABI7500 快速PCR 儀上實時熒光定量PCR 檢測cDNA 和對照樣品的相對表達水平，并用2-△△CT法進行統計分析，引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.2.6 蛋白質印跡分析分組處理細胞，裂解液裂解、離心，提取上清液，煮沸10 min，通過10%SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質并轉移到PVDF 膜上。將分離的蛋白質用5%脫脂乳封閉2 h，加一抗4 ℃孵育過夜體，β-actin（1∶5 000）、CD63（1∶1 000）、TSG101（1∶1 000）、PCNA（1∶1 000）、Ki-67（1∶5 000）、MMP-2（1∶1 000）、MMP-9（1∶1 000）和BZW2（1∶500）。用TBST 洗膜3 次，二抗孵育2 h。洗膜3 次后，ECL 溶液進行發光顯影，Image J（v1.8.0.345）軟件（ImageJ software Inc，USA）分析數據。本實驗所有抗體購自武漢三鷹生物技術公司。

1.2.7 CCK-8 測定將每組細胞的濃度調整為1×105/mL，每孔100 μL 濃度接種96 孔板。將細胞置于培養箱中培養72 h，加入10 μL/孔CCK-8試劑檢測吸光度。

1.2.8 EdU 增殖測定將每組細胞接種在96 孔板中，并在實驗結束前6 h 加入EdU 試劑進行孵育。固定、滲透和洗滌后，加入工作液，避光孵育30 min。用PBS 洗滌后，將1X Hoechst 33342反應溶液加入每個孔中反應30 min。在倒置熒光顯微鏡下觀察并收集圖像。使用ImageJ 軟件對EdU-陽性細胞的數量和DAPI 標記的細胞的數量進行計數，統計增殖率。

1.2.9 劃痕實驗測定將每組細胞接種在6 孔板上。當細胞融合率達到80%～90%時，用200 μL移液管尖端在中心畫1 條直線，在單層細胞之間形成劃痕，培養24 h。在顯微鏡下觀察并拍照，用ImageJ 軟件測量遷移距離。

1.2.10 Trans-well 測定將20 μL 基質膠（Gibco）涂布在Transwell 上室。將含有6×104個細胞的200 μL 懸浮液加入上室，將含有20%FBS 的600 μL培養基加入下室。在繼續培養24 h 后，移除上室。用多聚甲醛固定細胞，用結晶紫染色，在光學顯微鏡下拍照并計數。侵襲實驗，不使用基質膠，其他步驟與上述相同。

1.2.11 雙熒光素酶報告基因測定通過雙熒光素酶報告基因實驗驗證了miR-450a-5p 和BZW2 之間的靶向關系。構建了野生型BZW2 3’-UTR 的熒光素酶基因質粒和攜帶突變體BZW2 3’-UTR的基因質粒。用野生型或突變基因質粒、miR-450a-5p 模擬物和NC 共轉染細胞。轉染24 h 后，使用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒測定各組細胞的熒光素素酶活性。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 在胰腺癌組織和細胞中miR-450a-5p 低表達

在“ STARBASE”數據庫中分析了共178 個癌癥患者組織樣本和4 個正常胰腺組織樣本。miR-450a-5p 在胰腺癌組織中的表達水平低于正常胰腺組織（P<0.05），見圖1A。采用RT-qPCR測人胰腺癌癥細胞系（CFPAC-1，PANC-1）和HPCY5 細胞系中的miR-450a-5p 的表達。CFPAC-1和PANC-1 細胞系的miR-450a-5p 表達低于HPCY5 細胞，見圖1B。因此，miR-450a-5p 在胰腺癌組織和細胞中的表達水平較低。

圖1 胰腺癌組織和細胞中miR-450a-5p 呈低表達（，n=6）Fig.1 The expression of miR-450a-5p was low in pancreatic cancer tissues and cells.（，n=6）

2.2 CFPAC-1 細胞攝取MSC-exo-miR-450a-5p

在固定的透射電子顯微鏡下，典型的MSCexo 和MSC-exo-miR-450a-5p 是圓形或橢圓形的，見圖2A。MSC-exo 和MSC-eco-miR-450a-5p 組的外泌體的主要尺寸約為120 nm，見圖2B。免疫印跡結果顯示，外泌體標記蛋白（CD63 和TSG101）在MSC-exo 和MSC-exo-miR-450a-5p 中表達，見圖2C。此外，miR-450a-5p 在MSC-exo-miR-45-0a-5p 組中的表達高于MSC-exo 組，見圖2D。檢測了CFPAC-1 細胞對外泌體的攝取能力，CFPAC-1 細胞吸收了MSC-exo 和MSC-exo-miR-450a-5p，見圖2E?；诖俗C據，MSC-exo 和miR-450a-5p成功結合并被CFPAC-1 細胞攝取。

圖2 CFPAC-1 細胞攝取MSC-exo-miR-450a-5pFig.2 CFPAC-1 cells uptake MSC-exo-miR-450a-5p

2.3 MSC-exo-miR-450a-5p 抑制CFPAC-1的增殖

經過處理后，發現MSC-exo-miR-450a-5p顯著抑制細胞增殖，而MSC-exo 無作用，見圖3A；EdU 分析顯示相似的結果，見圖3B。免疫印跡檢測PCNA 和Ki-67 增殖蛋白，MSC-exo 蛋白表達較對照組差異無統計學意義，而MSC-exo-miR-450a-5p 組的增殖蛋白表達量顯著低于對照組（P<0.05），結果證實MSC-exo-miR-450a-5p 對細胞增殖具有抑制作用，見圖3C。MSC-exo-miR-450a-5p 抑制了細胞的侵襲和遷移過程，見圖3D～3E。此外，MSC-eco-miR-450a-5b也抑制了MMP2和MMP9 的蛋白表達，見圖3F。上述結果表明，MSC-eto-miR-450a-5b 抑制了CFPAC-1 細胞的生物學行為。

圖3 MSC-exo-miR-450a-5p 抑制CFPAC-1 細胞生物學行為Fig.3 MSC-exo-miR-450a-5p inhibits the biological behavior of CFPAC-1 cells

2.4 miR-450a-5p 靶向BZW2

PITA、miRanda 和miRmap 用于篩選miR-450a-5p 的靶標。取3 個數據庫的交叉點，共篩選出3 個基因，見圖4A。根據“TargetScan”數據庫，miR-450a-5p 和BZW2 的結合，見圖4B。與對照組相比，用miR-450a-5p 模擬物轉染的BZW2-Mut 細胞的雙熒光素酶活性顯著增加（P<0.01），而BZW2-WT 組的雙熒光素酶活性沒有顯著變化，見圖4C。因此，miR-450a-5p 靶向BZW2。

圖4 miR-450a-5p 靶向BZW2Fig.4 MiR-450a-5p targets BZW2

2.5 BZW2 在CFPAC-1 細胞中高表達

BZW2 在胰腺癌組織中的表達水平高于對照組，見圖5A。同樣，它在胰腺癌細胞中的表達也較高，見圖5B。RT-qPCR 和免疫印跡分析檢測了用miR-450a-5p 模擬物轉染的胰腺癌細胞的BZW2 表達，結果表明miR-450a-5p 模擬物明顯降低了BZW2 的水平，見圖5C～5D。最后，相關性分析證實miR-450a-5p 負調控BZW2 表達，見圖5E。這些結果證實miR-450 a-5p 在胰腺癌細胞中負調控BZW2 的表達。

圖5 BZW2 在CFPAC-1 細胞中呈高表達Fig.5 BZW2 is highly expressed in CFPAC-1 cells

2.6 Pc-BZW2 挽救MSC-exo-miR-450a-5p的功能

為了進一步證實，miR-450a-5p 與BZW2 的相互關系，通過回復實驗進行驗證。分組檢查，根據CCK-8 和EdU 測定的結果，MSC-exo-miR-450a-5p 抑制了增殖，而pc-BZW2 逆轉增殖抑制效應（P<0.05），見圖6A～6B。增殖相關基因的表達也證實了這些結果。miR-450a-5p 抑制PCNA和Ki-67 的表達，而pc-BZW2 部分逆轉了這種作用（P<0.05），見圖6C。此外，MSC-exo-miR-450a-5p 抑制細胞的侵襲和遷移過程，而Pc-BZW2 發揮了積極作用，見圖6D～6E。同樣MMP2 和MMP9 的蛋白質水平也被MSC-exo-miR-450a-5p 抑制，Pc-BZW2 可逆轉（P<0.05），見圖6F。

圖6 Pc-BZW2 逆轉MSC-exo-miR-450a-5p 的增殖抑制功能Fig.6 Pc-BZW2 reverses the proliferation inhibition function of MSC exo miR-450a-5p

3 討論

細胞外囊泡是指來源于細胞的囊泡體，其中外泌體來源于多泡小體[18]。外泌體存在于身體的各種組織、器官和體液中，具有滲透能力[19]。外泌體在體內循環，它們必須避開免疫細胞和排泄器官，如肝、肺和腎[20]。它們的靶組織效率取決于功能化程度以及外泌體與靶細胞相互作用的強度?；谕饷隗w的分子轉運能力和靶向特性，基于外泌物的分子轉運容量和靶向特征，研究人員開發了具有精確靶向性的外泌體細胞遞送載體[21]。通過在供體細胞中共表達蛋白質/RNA 轉運蛋白，可以將特定的蛋白質/RNA 分子裝載到外泌體中[22]。Kamerkar 等[23]指出，與脂質體相比，外泌體表現出更高的遞送siRNA 分子的能力，抑制胰腺腫瘤生長。因此，本研究構建了MSCexo-miR-450a-5p，以研究miR-450a-5b 在胰腺癌細胞中的功能。有趣的是，miR-450a-5p 在胰腺癌組織和細胞中低表達，MSC-exo-miR-450a-5p 可顯著抑制CFPAC-1 的增殖。

到目前為止，還沒有研究miR-450a-5p 在胰腺癌中的作用。然而，據報道，它在各種疾病中異常表達[11，14]。有趣的是，EGFR 抑制劑（Tarceva）已被批準用于治療晚期癌癥，尤其是EGFR 靶點突變腫瘤[24]。在食管鱗狀細胞癌中，靶向DUSP10參與自噬[12]。miR-450a-5p/SOX2 通路在調節結直腸癌腫瘤干性、血管生成，而血管生成模擬中的獨特機制可能是CRC 的潛在治療靶點[25]。在之前的一項研究中，SOX2 的表達在癌癥的侵襲和轉移中起著關鍵的調節作用。Sharma 等[26]指出，SOX2 的表達隨著胰腺上皮內瘤變的程度而增加。因此，miR-450a-5p 可能通過調節各種基因或途徑影響胰腺癌的發展。

在本研究中，miR-450a-5p 負調控胰腺癌細胞中BZW2 的表達。BZW2 基因編碼的蛋白質含有亮氨酸拉鏈和W2 結構域[27]。例如，BZW2抑制NF-kB 和NFAT 的轉錄活性，表明BZW2 可能是心臟發育的潛在候選基因[28]。NF-kB 是一種具有多效性轉錄調控的多肽，它通過激活和調節各種腫瘤相關基因的轉錄，促進細胞生長，抵抗細胞凋亡，引起細胞惡性轉化，促進腫瘤細胞轉移[29-30]。此外，敲低BZW2 可抑制乳腺上皮細胞的增殖，并顯著下調轉錄激活劑、β-酪蛋白和催乳素受體的表達水平[31]。值得注意的是，到目前為止，miR-450a-5p 在胰腺癌中的功能和分子機制尚未得到研究。然而，根據上述證據，BZW2 的一些線索可能會被揭示出來。重要的是，筆者的結果證實Pc-BZW2 逆轉了MSC-exo-miR-450a-5p的功能，BZW2 的具體作用機制還有待進一步探索。

綜上所述，間充質干細胞來源的外泌體是1種新的遞送系統，用于胰腺癌癥治療中miRNA 的靶向遞送。它們通過靶向BZW2 轉運miR-450a-5p 來抑制胰腺癌細胞的增殖，這為未來胰腺癌的治療和預防研究提供了重要線索。