慢性腎衰竭大鼠OAT1 的表達對骨代謝的影響

沈文娟 ，梁紋鑫 ，李 清 ，徐宏芳 ，張偉琴 ，李海欣

（1）昆明醫科大學海源學院病理生理學教研室;2）人體解剖學教研室;3）醫學機能學實驗室;4）人體寄生蟲學教研室，昆明 云南 651700;5）昆明市第二人民醫院骨科，昆明 云南 650204）

腎功能衰竭的腎性骨營養不良、尿毒癥環境、藥物和全身性疾病可導致慢性腎臟疾病患者的骨損傷。慢性腎臟疾病患者的骨折發生率比常人高出4～5 倍，并且骨折的發生率隨著腎功能的惡化而增加[1]。骨折對慢性腎功能衰竭患者的生活質量和死亡率有不利影響，骨丟失和骨折的發病機制復雜多樣。

有機陰離子轉運蛋白（organic anion transporter，OAT）由 540～560 個氨基酸組成，含12 個跨膜結構域，負責有機陰離子的跨膜轉運[2]。OAT1、OAT2、OAT3 共同參與腎小管上皮細胞尿酸分泌的第1 階段，具有尿酸轉運功能，OAT1 與尿酸分泌和排泄密切相關，主要見于腎近端小管的基底膜一側，參與腎臟分泌[3-4]。腎小管上皮細胞表達OAT，尿酸的分泌和重吸收由不同的轉運蛋白表達[5]。OAT 轉運的底物的多樣性決定了OAT 的重要作用。當發生尿毒癥的有機毒素增加時，內源性毒素在OAT 運輸不平衡下引起組織損傷。有研究指出，在高尿酸環境下，OAT1 的表達會下調[6]。

筆者著重研究慢性腎衰竭中OAT 表達對骨代謝的影響，采用單腎切除+腺嘌呤灌胃法建立大鼠慢性腎衰竭模型，觀察慢性腎衰竭時OAT1 表達的變化，探討OAT1 表達對骨代謝的影響，為腎性骨營養不良的防治提供一定基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

蘇木素（賽維爾，批號：G1004-100ML）；二甲苯（西隴化工股份有限公司，批號：33535）；伊紅染色液（索萊寶，批號：G1108）；山羊抗兔二抗（賽維爾，批號：G1213-100UL）；DAB 試劑盒（賽維爾，批號：G1212-200T）；邁瑞獸用全自動血液細胞分析儀（型號：BC-2800vet）；臥式冷凍箱（美菱，型號：BCD-318AT）；全自動生化分析儀（深圳雷杜生命科技，型號：Chemray 800）；實維儀器石蠟切片機；尼康倒置顯微鏡（型號：TS2）。

1.2 實驗動物

20 只的SD 雄性大鼠（體重350～400 g，12 周）購自昆明醫科大學海源學院動物提供合作中心，將大鼠隨機分為對照組和模型組，每組10只大鼠。大鼠在24 ℃和（60±10）% 相對濕度下適應性飼養1 周，光照/黑暗周期為12 h。本次動物實驗方案經昆明醫科大學實驗動物權利與倫理管理委員會批準[SCXK（滇）K2020-0004]。

1.3 研究方法

1.3.1 大鼠慢性腎衰竭模型的復制采用“單腎切除+腺嘌呤灌胃法”建立大鼠慢性腎衰竭模型，模型組給10%的水合氯醛腹腔注射麻醉。取俯臥位將模型組大鼠固定在手術臺上，進行背部手術區常規備皮，酒精消毒，以肋脊角為標志進行左側背部斜切口，在脊柱旁0.5 cm 處，分離皮膚。分離腰大肌，進入后腹膜，找到腎臟，使用止血鉗分離腎周圍脂肪囊和腎蒂，注意避免損傷腎上腺。充分暴露左側腎臟，用止血鉗夾閉腎蒂，確認腎動脈、靜脈和輸尿管均包括在內后，用絲線結扎。用剪刀剪斷腎蒂，摘除腎臟，并將結扎的腎蒂放入腹腔，見圖1。關閉腹腔。1 號線分層縫合肌肉和皮膚。術后對照組蒸餾水灌胃，模型組腺嘌呤灌胃，模型組大鼠每天上午以加200 mg/（kg·d）劑量的腺嘌呤混懸液灌胃造模，連續28 d。每只動物均可自由獲得水和食物。采集大鼠血液、處死后獲得腎臟、骨組織保存在-80 ℃冰箱，進行后續實驗研究。

圖1 左側單腎切除過程Fig.1 Left side single kidney resection process diagram

1.3.2 生化指標檢測測定大鼠的一般指標，每隔7 d 測定并觀察大鼠的體重、攝食和飲水量，共持續4 周。測量大鼠生化指標，連續0、2、4、6、8、10 周采全血。麻醉用10% 水合氯醛腹腔注射，從股動脈抽血。全血標本于室溫放置2 h或4 ℃過夜。后于2～8℃采用3 000 r/min 離心15 min，取上清分裝。并將標本放于-20 ℃或-80 ℃保存。紅細胞（RBC）和血紅蛋白（Hb）通過血常規分析儀測定。尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）、尿酸（UA）、血鈣（Ca2+）、血磷（P3+）通過全自動生化分析儀測定。

采用尿素酶-谷氨酸脫氫酶法測定尿素，上樣3 μL 樣本。采用酶法測定肌酐，上樣8 μL。采用酶標檢測儀測定尿酸，上樣7.5 μL 血清樣本。采用終點法測定鈣濃度，加入試劑250 μL，試劑盒型號：C057，每份加入2.5 μL 血清樣本，反應120 s。采用兩點法測定磷濃度，加入試劑300 μL，試劑盒型號：C014，每份加入6 μL 血清樣本，反應300 s。測量大鼠腎臟一般指標，10 周處死大鼠，取出腎臟，用生理鹽水沖洗，除去淤血及血管、脂肪等非腎臟組織。裸腎用濾紙吸干，用精密電子天平稱單腎濕重，計算大鼠單側腎重/體重的值，肉眼觀察腎臟，大小、形態、顏色、質地、包膜、皮質、髓質等。

1.3.3 Hematoxylin-eosin Staining（HE 染色）將組織用4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片。（1）烤片：將組織片放入64℃恒溫箱中烘烤1 h；（2）脫蠟：將玻片放入到二甲苯中Ⅰ（10 min）-二甲苯Ⅱ（10 min）；（3）水化：100% 酒精Ⅰ（5 min）-100%酒精Ⅱ（5 min）-95%酒精（5 min）-80%酒精（3 min）-70%酒精（2 min）；PBS 沖洗3 次，每次5 min；（4）蘇木素復染：將玻片放到蘇木素中染色5 min，蒸餾水沖洗，放入到酒精-鹽酸溶液中進行分化，分化10～15 s，放入到自來水中返藍，返藍至少15 min；（5）伊紅染色：將玻片放入到伊紅中染色5～10 s，放入到蒸餾水中洗1 次；（6）脫水：95%酒精（5～10 s）-100%酒精Ⅰ（5 min）-100%酒精Ⅱ（5 min）；（7）透明：二甲苯Ⅰ（10 min）-二甲苯Ⅱ（10 min）；（8）封片：用中性樹膠進行封片；（9）拍片：選擇中間和四周不少于5 個視野進行拍照和分析。將對照組和模型組大鼠的腎組織用HE 染色，以觀查其基本結構，分析病變情況、分辨細胞種類以及炎癥細胞浸潤情況等。

1.3.4 X 線拍片檢測大鼠脛骨標本的生長情況使用X 線檢查對照組和腺嘌呤誘導模型組大鼠脛骨標本，觀察到對照組骨質內骨小梁排布的比較緊密、規律，骨質的密度正常；模型組骨小梁排布得比較稀疏，甚至出現紊亂或者缺失，骨密度不足。對比其骨小梁變化分析骨密度情況。

1.3.5 免疫組化檢測OAT1 表達（1）取材和切片及脫蠟：二甲苯、二甲苯Ⅱ各7 min，4 個梯度乙醇各4 min，沖洗3 min，PBS 沖洗2 次（3 min/次）；（2）抗原修復：2 次（8 min/次），自然冷卻至室溫；（3）滅活：使內源性過氧化物酶失去活性；（4）加一抗∶1∶150 的一抗（陰性對照加PBS），37℃孵育150 min 后，PBS 沖洗；（5）加OAT1 抗體:加二抗并置于37℃烘箱20 min，PBS 沖洗3 次；（6）DAB 顯色及封片：避光環境下，滴加現配的DAB 試劑，顯色、沖洗、脫水，中性樹膠封片。將骨切片染色確認骨質吸收情況，使用圖像分析系統計算吸收面積。

1.4 統計學處理

應用SPSS 24.0 進行統計學分析，以均數±標準差（）表示計量資料，組間比較采用t檢驗，采用 Graphpad Prism 5.0 作圖，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠的一般情況

造模后，體重維持不變，而后呈下降趨勢。單側腎重占比模型組與對照組并無明顯差別（P=0.077）。對照組則先上升、后下降，后又上升，模型組飲水量呈上升趨勢，隨后持平，在3～4 周區間范圍內呈波動趨勢。對照組則隨時間上升，模型組飲食量隨時間呈下降趨勢，見圖2。

圖2 大鼠的一般情況Fig.2 General situation of rats

2.2 單腎切除+腺嘌呤誘導對大鼠腎組織的影響

2.2.1 大鼠腎組織取材對照組大鼠腎臟紅潤光滑，其形態、大小正常，模型組大鼠腎臟明顯肥大，表面蒼白粗糙，見圖3。

圖3 大鼠腎組織取材Fig.3 Rat kidney tissue sampling diagram

2.2.2 大鼠右腎HE 染色結果顯微鏡下可見對照腎小球、腎小管結構正常，系膜細胞和基質無增生，腎間質無炎性細胞浸潤及纖維化；模型組腎間質炎性細胞浸潤，使腎小管萎縮、腎小管上皮細胞空泡樣變，基底膜增厚、腎間質大量炎性細胞浸潤及纖維化，見圖4。

圖4 大鼠右腎HE 染色Fig.4 HE staining of right kidney in rats

2.3 單腎切除加腺嘌呤誘導對大鼠腎功能的影響

模型組的尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）及血鈣（Ca2+）、血磷（P3+）較對照組升高（P<0.05），見表1。

表1 不同組間大鼠的腎功能指標比較（，n=6）Tab.1 Comparison of renal function indicators among different groups of rats（，n=6）

表1 不同組間大鼠的腎功能指標比較（，n=6）Tab.1 Comparison of renal function indicators among different groups of rats（，n=6）

與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.4 OAT1 表達對尿酸、鈣磷代謝及骨組織的影響

2.4.1 OAT1 表達對尿酸、鈣磷代謝的影響與對照組相比，模型組大鼠血清中的尿酸、血磷和血鈣升高，差異具有統計學意義（P<0.05），見表2。

表2 不同組間大鼠的尿酸、鈣和磷水平（，n=6）Tab.2 Uric acid，calcium，and phosphorus levels in rats of different groups（，n=6）

表2 不同組間大鼠的尿酸、鈣和磷水平（，n=6）Tab.2 Uric acid，calcium，and phosphorus levels in rats of different groups（，n=6）

與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.4.2 OAT1 表達對骨組織的影響大鼠脛骨X線拍片檢查觀察骨生長情況。觀察到對照組骨質內骨小梁，排布緊密、規律，骨質的密度正常，而模型組骨小梁排布得比較稀疏，甚至出現紊亂或者缺失，骨密度低于對照組，見圖5。

圖5 大鼠脛骨X 線拍片Fig.5 X-rays of rat tibia

2.5 OAT1 對骨營養不良的影響

對照組和腺嘌呤誘導模型組大鼠OAT1 的面積。將骨組織中的OAT1 染色，并使用GraphPad Prism 5 計算面積后發現：模型組大鼠骨組織結合OAT1 值低于對照組（P<0.05），見圖6。

3 討論

有機陰離子轉運蛋白家族屬于溶質載體家族（solute carrier family，SLC22），在腎臟上皮細胞中表達以調節內源性和外源性有機陰離子的排泄和重吸收，包括各種藥物及其代謝物[7-9]。OATs 也在血腦屏障、肌肉細胞和成骨細胞中表達，這暗示了OAT 介導的尿毒癥毒素轉運的各種致病作用[10]。慢性腎衰竭大鼠腎 OAT1 表達減少，并且其分泌負荷減少[11]。有研究指出，一些有機陰離子轉運多肽（OATPs）和有機陰離子轉運蛋白參與了尿毒癥毒素的腎臟清除[12]。且已有研究證明OAT家族中的OAT1 在腎臟中參與尿酸鹽的轉運過程[13-14]。并發現，在OAT 下降的條件下，慢性腎衰竭的尿酸清除率降低，導致慢性腎衰竭大鼠血清中尿酸含量增高。臨床上慢性腎功能衰竭患者體內的尿酸水平可反映患者體內腎功能損傷情況，兩者具有明顯的相關性，可作為其臨床診斷或術后評估的參考依據之一[15-16]。

本研究結果觀察到造模后模型組體重、飲水量、飲食量的變化，單腎占比未變。并且，對照組和模型組大鼠的紅細胞、血紅蛋白水平，尿素氮及肌酐水平顯符合腺嘌呤誘導慢性腎功能衰竭預期[17]。大鼠處死后，取腎組織發現模型組大鼠腎臟明顯肥大，表面蒼白粗糙，而對照組大鼠腎臟紅潤光滑，其形態、大小也無異常。將腎組織切片染色，顯微鏡下可見對照腎組織正常，系膜細胞和基質無增生，腎間質無炎性細胞浸潤及纖維化；模型組腎間質炎性細胞浸潤，使腎小管萎縮、腎小管上皮細胞空泡樣變，基底膜增厚、腎間質大量炎性細胞浸潤及纖維化。上述結果均表明單腎切除+腺嘌呤灌胃法已成功建立大鼠腎衰竭模型，且與張圓圓等[18]的研究成果相符合。

腎性骨營養不良是指在慢性腎功能衰竭患者中經常觀察到的骨形態和代謝的改變，并且由于骨量和質量的惡化導致骨強度受損，致使患者易發生骨折[6，19-21]。本研究通過X 線拍片觀察大鼠脛骨生長情況、骨形態分析顯示，觀察X 線拍片，模型組大鼠骨小梁結構的變化和皮質骨密度降低。確定了慢性腎功能衰竭大鼠有腎性骨營養不良的狀況。有研究顯示，骨營養不良主要表現在骨重塑（骨保護素、骨鈣素、骨橋蛋白）和維生素D 代謝（7-脫氫膽固醇還原酶、Gc-球蛋白、Cyp2r1、Cyp27a1）的基因失調，以及鈣和維生素D 穩態的改變[6]。實驗數據表明模型組大鼠的鈣磷流失高于對照組。維持機體鈣磷代謝穩態是腎臟的主要功能之一，慢性腎功能衰竭患者體內的腎功能受損后，機體內的礦物質和骨代謝發生異?？蓪е履I性骨病[22-23]。因此筆者推測慢性腎功能衰竭大鼠內的鈣磷代謝紊亂導致骨營養不良[24]。然而，慢性腎衰竭又通過什么因素導致了骨營養不良？

據報道，在慢性腎功能衰竭中，OAT1、OAT2、Oct1、Oct2、Oatp4C1 的mRNA 表達均下調[25]。并且OATP1B 活性可能在腎衰竭患者中降低，影響其藥物代謝清除率及藥物轉運能力[26]。筆者觀察到模型組大鼠骨組織結合OAT1 值低于對照組（P=0.001 8）。這意味著，腎衰竭影響了OAT1 在骨組織中的表達。OAT1 在骨組織中的結合能力下降，會影響骨組織的鈣磷結合能力，導致慢性腎衰竭大鼠骨小梁結構的變化和皮質骨密度降低。

綜上所述，本實驗證明了模型組大鼠骨組織OAT1 表達值遠低于對照組，影響鈣磷代謝，致慢性腎衰竭大鼠骨小梁結構的變化和皮質骨密度降低。從而加重腎性骨營養不良，該研究進一步探明慢性腎衰竭大鼠OAT1 表達與腎性骨營養不良兩者的關系，為臨床提供一定的理論依據。