基于譜效關系的昆布自由基清除活性成分研究*

黃華花，鄭姍姍，許燕瑜，鄭淑文，陳泓旭

（廈門醫學院藥學系/廈門市中藥生物工程重點實驗室/福建省中藥精加工與健康產品開發重點研究室，福建 廈門 361023）

昆布為海帶科植物海帶Laminaria japonica Aresch.的干燥葉狀體[1]，藥食兩用，多分布于遼寧、山東、浙江、福建等地?，F代研究表明，昆布具有抗氧化[2-3]、抗腫瘤[4-5]、免疫調節[6]等藥理作用，其含有的多糖類[7]、類胡蘿卜素類[8]、多酚類[9]活性成分可能是其發揮上述藥理作用的重要物質基礎。關于昆布的抗氧化研究目前主要集中在昆布多糖[10]、昆布多酚[9]，而抗氧化活性成分研究僅證實了巖藻黃質的抗氧化作用[11]。因此，本研究在現有昆布指紋圖譜研究[12]的基礎上，對不同產地昆布化學成分和自由基清除活性進行譜效關系研究，篩選昆布自由基清除活性的有效成分群，為后期昆布抗氧化活性成分的篩選提供參考。

1 材 料

1.1 儀器 多功能粉碎機（德清拜杰電器有限公司）；KQ5200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；GO1510型全波長酶標儀（賽默飛世爾科技公司）；ME204型電子天平、XPE105型電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]。

1.2 藥材與試劑 11批昆布樣品產地信息見表1，經廈門醫學院鮑紅娟副教授鑒定為昆布Laminaria japonica Aresch.正品。2,2'-聯氨-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽（批號：H09N11B130256）、1,1-二苯基-2-苦基肼（批號：W27F10E81251）均購于上海源葉生物科技有限公司；維生素C（VC）（批號：1140552011）購于石藥集團維生藥業（石家莊）有限公司；6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸（Trolox）（批號：B2124221）購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇、過硫酸鉀均為分析純，購于西隴科學股份有限公司。

表1 樣品產地信息

2 方 法

2.1 溶液的制備

2.1.1 供試品溶液的制備 取昆布樣品適量，粉碎，過40目篩，取2.5 g，精密稱定，精密加入甲醇10 mL，超聲（功率：900 W，頻率：40 kHz）30 min，放冷，濾過，即得[12]。

2.1.2 陽性對照液的制備 取VC、Trolox對照品適量，精密稱定，分別加甲醇制成質量濃度分別為0.500 0、0.415 0 mg/mL的陽性對照液，即得。

2.1.3 DPPH溶液的制備 取DPPH適量，精密稱定，加甲醇制成質量濃度為0.05 mg/mL的DPPH儲備液，陰暗處放置。

2.1.4 ABTS溶液的制備 取ABTS、K2S2O4適量，精密稱定，加蒸餾水制成濃度分別為7、140 mmol/L的溶液。取K2S2O4溶液440 μL與ABTS溶液25 mL混合，搖勻，陰暗處反應12～16 h，用甲醇稀釋至734 nm處吸光值為0.6～0.8。

2.2 自由基清除活性測定

2.2.1 DPPH自由基清除活性測定及IC50的計算 分別精密吸取“2.1.1”項下供試品溶液及“2.1.2”項下VC陽性對照液，加甲醇按一定比例稀釋成5個系列濃度的溶液。按要求精密吸取各溶液，分別混勻，陰暗處反應30 min，于517 nm處測定吸光度，按下式計算清除率：

其中，Ai為各溶液100 μL+DPPH溶液100 μL的吸光度，Aj為各溶液100 μL+甲醇100 μL的吸光度，A0為甲醇100 μL+DPPH溶液100 μL的吸光度。

運用SPSS Statistics 17.0軟件進行probit回歸，預測樣品的半數抑制質量濃度（The half inhibiting concentration，IC50），其值越小，表明自由基清除活性越強。

2.2.2 ABTS自由基清除活性測定及IC50的計算 按“2.2.1”項下方法，以Trolox為陽性對照液，于734 nm處測定吸光值，計算ABTS自由基清除率并預測樣品的IC50。

2.3 譜效關系分析

2.3.1 灰色關聯度分析法 利用Excel 2019[13]，使用均值法對各批昆布樣品特征峰的峰面積和清除自由基作用的IC50進行無量綱化處理；將變換后的清除自由基作用的IC50作為母序列記為Y0（m），特征峰峰面積作為子序列記為Yi（m）；求母序列與子序列的絕對差值Δoi（m），Δoi（m）=|Yo（m）-Yi（m）|，其中1≤i≤m；計算相應的關聯系數Loi（k），Loi（k）=（Δmin+ρΔmax），其中ρ為分辨系數，本試驗中ρ取0.5；再計算關聯度其中N為子序列數據個數；最后將關聯度排列，形成關聯序。關聯度反映了母序列和子序列的相關性，其中關聯度＞0.6時，表明有關聯性；關聯度＞0.8時，表明有較大關聯性。因此可根據關聯度排序結果篩選出與自由基清除活性相關的特征峰。

2.3.2 偏最小二乘回歸分析法 將各批昆布樣品特征峰的峰面積作為自變量（X），清除自由基作用的IC50作為因變量（Y），利用SIMCA-P 14.1軟件，建立偏最小二乘回歸方程，分別篩選出與自由基清除活性相關的特征峰。

3 結 果

3.1 指紋圖譜研究 前期研究建立了11批昆布樣品的超高效液相（Ultra performance liquid chromatography, UPLC）指紋圖譜[12]，確定了33個共有峰。（見圖1～2、表2）

圖1 樣品UPLC 疊加指紋圖譜

圖2 樣品UPLC 對照指紋圖譜

表2 各共有峰的峰面積

3.2 自由基清除活性測定結果 11批昆布樣品對DPPH自由基、ABTS自由基均表現出良好清除活性。DPPH自由基清除活性的強弱依次為S1＞S8＞S3＞S6＞S5＞S11＞S2＞S4＞S9＞S7＞S10，ABTS自由基清除活性的強弱依次為S1＞S8＞S7＞S5＞S3＞S2＞S11＞S6＞S10＞S4＞S9。（見圖3～4）

圖3 樣品DPPH 自由基與ABTS 自由基清除活性比較

圖4 樣品清除自由基作用的IC50 比較

3.3 譜效關系分析

3.3.1 灰色關聯度分析法 按“2.3.1”項下方法計算關聯度，昆布樣品UPLC指紋圖譜與清除DPPH自由基活性關聯度見表3。排序結果為：X24＞X21＞X22＞X4＞X27＞X28＞X23＞X29＞X9＞X18＞X17＞X12＞X25＞X20＞X10＞X2＞X33＞X31＞X5＞X19＞X6＞X3＞X13＞X14＞X16＞X32＞X15＞X11＞X26＞X8＞X1＞X30＞X7，其中X24、X21、X22、X4、X27、X28、X23、X29、X9、X18、X17、X12、X25、X20、X10的關聯度＞0.8[14]，因此認為這些特征峰對清除DPPH自由基的貢獻程度較大。

表3 樣品UPLC指紋圖譜與清除DPPH自由基活性關聯度

昆布樣品UPLC指紋圖譜與清除ABTS自由基活性關聯度見表4。排序結果為：X18＞X22＞X9＞X4＞X24＞X12＞X17＞X27＞X20＞X33＞X21＞X10＞X28＞X2＞X29＞X6＞X19＞X3＞X16＞X30＞X23＞X13＞X5＞X25＞X14＞X31＞X3＞X11＞X15＞X1＞X26＞X8＞X7，其中X18、X22、X9、X4、X24、X12、X17、X27的關聯度＞0.8，因此這些特征峰對清除ABTS自由基的貢獻程度較大。

表4 樣品UPLC 指紋圖譜與清除ABTS 自由基活性關聯度

3.3.2 偏最小二乘回歸分析法 按“2.3.2”項下方法建立回歸方程，昆布樣品清除DPPH自由基的標準回歸系數結果見圖5A，得偏最小二乘回歸方程：

圖5 樣品清除DPPH 自由基的標準回歸系數圖和VIP 貢獻圖

Y=-0.180 2X1+0.403 8X2+0.030 3X3+0.239 8X4-0.324 2X5+0.221 8X6-0.289 7X7-0.538 0X8+0.575 3X9-0.151 8X10+0.028 7X11+0.3533X12+0.0719X13+0.3891X14+0.0071X15+0.0887X16-0.0569X17-0.1244X18-0.0032X19+0.6002X20-0.1663X21+0.0658X22+0.6027X23-0.561 3X24+0.016 4X25+0.017 0X26-0.123 4X27-0.456 0X28-0.132 8X29-0.098 6X30+0.126 5X31+0.561 5X32+0.131 6X33?；貧w系數的絕對值越大，表明對因變量（IC50）的影響越大[15]。因IC50值越小，DPPH自由基清除活性越強。其中X1、X5、X7、X8、X10、X17、X18、X19、X21、X24、X27、X28、X29、X30的回歸系數＜0，表明這些特征峰對昆布清除DPPH自由基作用有貢獻。

與此同時，變量重要性投影（Variable importance in the projection，VIP）越大，說明其對因變量的解釋能力越強[16]。VIP分析結果見圖5B。其中X23、X28、X32、X33、X2、X14、X20、X24、X27、X31、X26、X25、X29、X30、X8、X18的VIP值＞1，且X28、X24、X27、X29、X30、X8、X18的相關系數＜0，表明這些特征峰所代表的化學物質可能是昆布清除DPPH自由基作用的物質基礎。

按“2.3.2”項下方法建立回歸方程，昆布樣品清除ABTS自由基的標準回歸系數結果見圖6A，得偏最小二乘回歸方程：Y=0.017 5X1+0.180 1X2-0.023 3X3+0.167 2X4-0.044 1X5-0.024 6 X6-0.110 2X7-0.106 7X8+0.189 4X9+0.132 8X10+0.043 4X11+0.103 2 X12-0.0349X13+0.1054X14-0.0840X15+0.0672X16-0.0051X17-0.2144 X18+0.0830X19+0.2776X20+0.0698X21+0.0872X22+0.3375X23-0.6773 X24-0.0644X25+0.0795X26+0.0797X27+0.0290X28-0.0576X29-0.465 1 X30+0.320 2X31+0.778 8X32-0.400 1X33。其中X3、X5、X6、X7、X8、X13、X15、X17、X18、X24、X25、X29、X30、X33的回歸系數＜0，表明這些峰對昆布清除ABTS自由基作用有貢獻。

圖6 樣品清除ABTS 自由基的標準回歸系數圖和VIP 貢獻圖

VIP分析結果見圖6B，其中X23、X31、X32、X30、X25、X1、X2、X18、X14、X24、X33、X17、X28的VIP值＞1，且X30、X25、X18、X24、X33、X17的相關系數＜0，表明這些特征峰所代表的化學物質可能是昆布清除ABTS自由基作用的物質基礎。

4 討 論

4.1 抗氧化方法的選擇 目前常用的抗氧化評價方法有DPPH法、ABTS法、FRAP法、超氧陰離子自由基清除法、羥自由基清除法等[17-18]。DPPH法用于體外測定物質總抗氧化能力，是目前使用最為廣泛的檢測自由基清除能力的方法之一；ABTS法簡單快捷，不僅可測定水溶性及脂溶性天然產物抗氧化活性，還可測定酸性、中性及弱堿性化合物的自由基清除能力。本研究采用這兩種方法來綜合評價昆布樣品的自由基清除活性，能夠獲得比較客觀真實的自由基清除活性評價。

4.2 分析方法的選擇 目前常用的數據分析方法有偏最小二乘回歸分析法、灰色關聯度分析法、多元線性回歸分析法、主成分分析法、聚類分析法等[19]。偏最小二乘回歸分析法融合了主成分分析、典型相關分析和多元線性回歸分析3種分析手段，能夠在模型自變量存在嚴重多重相關性且樣本量較少的情況下進行回歸分析[20]；灰色關聯度分析法來源于灰色系統理論，因其具有模糊性的特點而廣泛應用于中藥譜效關系、質量評價研究中[21-22]。本研究采用灰色關聯度結合偏最小二乘回歸分析法，可以較為科學、合理地篩選出與昆布自由基清除活性相關的成分。

本研究在前期已建立的昆布UPLC指紋圖譜基礎上，通過DPPH與ABTS法測定11批昆布樣品自由基清除活性的IC50，并采用灰色關聯度結合偏最小二乘回歸分析法構建昆布自由基清除活性譜效關系?；疑P聯度法和偏最小二乘回歸法結果均表明特征峰X18、X24對昆布清除自由基作用有貢獻，其代表的成分可能為昆布清除自由基作用的主要活性成分。