吲哚美辛通過恢復自噬流減輕雨蛙素誘導的小鼠急性胰腺炎

樓立君，李人龍，李 雁，李 靜，康曉宇，王向平，潘陽林

(國家消化系統疾病臨床醫學研究中心，消化系腫瘤整合防治全國重點實驗室，空軍軍醫大學西京消化病醫院，陜西 西安710032)

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是由多種病因引起胰腺內胰蛋白酶原提前激活所導致的一種消化系統常見急腹癥。AP的病因眾多，在中國最常見的病因為膽石癥，而歐美國家則為過量乙醇攝入，此外，經內鏡逆行性胰膽管造影術(endoscopic retrograde cholangio-pancreatography，ERCP)、高脂血癥、高鈣血癥等也是引起AP的常見病因[1-2]。AP病情復雜多變、預后不良，部分患者會出現不明原因的反復發作或進展為慢性胰腺炎，這些均給患者和醫療系統帶來了沉重負擔[3-4]。然而目前，AP的預防手段有限，缺乏早期針對性藥物，臨床治療仍以對癥治療為主。

吲哚美辛是臨床上常見的非甾體類抗炎藥(nonsteroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs)，近年來，有多項高質量臨床研究發現，吲哚美辛能夠預防ERCP術后胰腺炎(post-ERCP pancreatitis，PEP)，NSAIDs目前已成為預防PEP這一特殊類型AP的基石[5-7]。作為一類廣泛使用的抗炎藥物，吲哚美辛可能在除PEP外的各類AP的防治中有更廣泛的適應證，然而其在AP中的保護作用與機制尚不清楚，在特定AP環境下對胰腺自噬過程的影響與調控仍有待研究。本研究擬通過構建常見的AP小鼠模型，探究吲哚美辛對AP的保護作用及其機制，為臨床開發更特異、更有效的AP防治策略打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 C57BL/6小鼠(8周齡、雄性)購自空軍軍醫大學實驗動物中心，在SPF環境下飼養，環境溫度(25±1)℃、相對濕度(60±5)%，按晝夜節律提供光照12 h，自由進食飲水，購買后所有小鼠適應性飼養1周。

1.1.2 主要試劑 雨蛙素(FI-6934，MCE，美國)；吲哚美辛(I7378，Sigma，美國)；蘇木素染色液、EDTA抗原修復液(索萊寶，中國)；即用型正常山羊血清(博士德公司，中國)；DAB顯色試劑盒(中杉金橋，中國)；RNA提取試劑盒(Takara，日本)；反轉錄試劑及擴增試劑(Abm，美國)；脂肪酶檢測試劑盒(MAK046，Sigma，美國)；兔抗人髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)抗體(ab208670)、兔抗人LC3抗體(ab192890)、兔抗人P62抗體(ab109012)(Abcam，美國)；鼠抗人β-actin抗體(SAB3500350，Sigma，美國)。

1.2 方法

1.2.1 模型構建及分組 隨機挑取雄性C57BL/6小鼠28只，體質量20～22 g，小鼠適應性飼養1周，所有動物實驗設計遵循3R原則。造模前所有小鼠均禁食12 h，根據實驗目的將小鼠隨機分為對照組、吲哚美辛組、雨蛙素組、雨蛙素+吲哚美辛組，每組7只。AP模型的建立方法及吲哚美辛給藥方式見圖1。對照組小鼠每隔1 h進行一次9 g/L生理鹽水腹腔注射，共注射7次。雨蛙素胰腺炎造模小鼠每隔1 h進行一次50 μg/kg雨蛙素腹腔注射，共注射7次。雨蛙素+吲哚美辛組小鼠在第一次注射雨蛙素前6 h和0.5 h，按8 mg/kg劑量進行兩次吲哚美辛腹腔注射，之后繼續進行7次雨蛙素腹腔注射。吲哚美辛組小鼠按照8 mg/kg劑量進行兩次單獨吲哚美辛腹腔注射。所有小鼠均在第一次注射雨蛙素后12 h麻醉處死，解剖小鼠并于腹主動脈采血，取出胰腺組織，保存于-80 ℃冰箱。采集的血液在37 ℃條件下孵育30 min，4 ℃離心機中3 000 r/min離心15 min，分裝上清并保存于-80 ℃冰箱以備后續使用。

圖1 小鼠給藥示意圖

1.2.2 小鼠胰腺組織HE染色及組織病理學評分 使用40 g/L多聚甲醛固定小鼠胰腺組織，石蠟包埋后切片，切片厚度4 μm。經過烤片-脫蠟-蘇木素染色-分化-伊紅染色-脫水封片等步驟對切片進行HE染色。使用病理切片掃描儀(3DHISTECH)掃描切片并分析圖像，每張切片隨機選擇5個視野，分別從水腫、炎癥、壞死3個方面單獨對每只小鼠的胰腺組織損傷情況進行雙盲評分，3項評分總和即為該只小鼠組織病理學的總評分，計算每組小鼠各項評分及總分的平均值作為最終得分[8]。

1.2.3 小鼠血清淀粉酶與脂肪酶檢測 取10 μL收集的血清樣本用90 μL雙蒸水稀釋10倍，渦旋混勻，將樣本放置于冰上送至西京醫院檢驗科，利用全自動生化分析儀(日立，日本)檢測樣本血清淀粉酶與脂肪酶水平，得到的數值乘以10即為原始血清淀粉酶與脂肪酶水平。

1.2.4 小鼠胰腺組織MPO免疫組織染色 將包埋的胰腺組織切片，65 ℃烘烤2 h，依次進行脫蠟與脫水，使用EDTA抗原修復液進行抗原修復，之后進行過氧化氫封閉與山羊血清封閉，封閉后滴加一抗，將切片放于濕盒中4 ℃過夜。第2日洗滌切片并滴加二抗室溫孵育1 h，在顯微鏡下進行DAB顯色與蘇木素染色，使用流水沖洗切片停止染色，然后進行脫水與封片，最后使用切片掃描儀(3DHISTECH)掃描切片并使用ImageJ軟件對MPO表達陽性細胞進行計數。

1.2.5 小鼠胰腺組織RNA提取與qPCR測定炎癥因子表達 小鼠胰腺組織RNA提取及反轉錄使用商品化試劑盒進行，其步驟簡述如下：將組織放于RLT裂解液中充分裂解，使用試劑盒中離心柱去除DNA并吸附RNA，分別使用RWA與RWB溶液洗脫雜質，最后加入無核酸酶水收集RNA并使用NanoDrop微量分光光度計測定RNA的濃度與純度。使用反轉錄試劑盒將提取的RNA反轉錄為cDNA，使用SYBR Green Master Mix進行qPCR，實驗中所使用的引物序列如表1所示。

表1 引物序列

1.2.6 Western blotting檢測自噬相關蛋白表達 取50 mg胰腺組織加入RIPA裂解液，研磨組織至乳糜狀并超聲勻漿，12 000 r/min離心15 min，留上清液作為上樣蛋白。配制SDS-PAGE膠，根據實驗計劃按順序在每孔加入40 μg的蛋白，設定上層壓縮膠電壓為80 V，下層分離膠電壓條件為120 V，當溴酚藍快到達分離膠下邊界時停止電泳。電泳結束后使用轉膜儀(Bio-Rad，美國)將蛋白轉至硝酸纖維素膜上，設定轉膜電壓為100 V，根據目的分子大小設置轉膜時間。轉膜結束后使用50 g/L脫脂牛奶封閉條帶1 h，TBST緩沖液洗凈殘留牛奶，使用對應一抗在4 ℃冰箱過夜孵育條帶。第2日使用TBST緩沖液清洗條帶3次，每次5 min，對應二抗室溫孵育條帶1 h，結束后使用TBST緩沖液清洗條帶3次，每次5 min。使用凝膠成像設備(Bio-Rad，美國)進行顯影、拍照，使用ImageJ軟件分析條帶灰度值。

1.2.7 電鏡檢測自噬小體 切取約1 mm×1 mm×1 mm新鮮胰腺組織，25 g/L戊二醛固定，4 ℃冰箱過夜；磷酸漂洗液漂洗樣本并用10 mL/L鋨酸固定樣本2 h，乙醇梯度脫水，將樣本置于丙酮溶液，室溫置換3次，每次30 min；使用不同濃度丙酮與包埋劑浸漬樣本，結束后37 ℃過夜包埋樣本。將樣本切為50～90 nm 的超薄切片，20 mL/L乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛進行雙染色，使用透射電鏡觀察并拍照。

2 結果

2.1 吲哚美辛減輕AP小鼠胰腺組織病理損傷

小鼠胰腺組織HE染色結果顯示，對照組與吲哚美辛組胰腺組織致密，腺泡結構完整，組織無水腫或出血樣改變；雨蛙素組胰腺組織水腫明顯加重，間質內可見大量炎癥細胞浸潤，腺泡細胞呈空泡樣變，部分腺泡細胞出現局部壞死；但雨蛙素+吲哚美辛組胰腺組織水腫程度較雨蛙素組減輕，炎癥細胞浸潤數量明顯減少，腺泡細胞空泡樣變與壞死程度減輕(圖2A)。根據HE染色結果對小鼠胰腺組織損傷進行組織病理學評分，與對照組和吲哚美辛組相比，雨蛙素組的組織病理學評分明顯增加(P<0.05)，雨蛙素+吲哚美辛組的組織病理學評分較雨蛙素組則明顯降低(P<0.05，圖2B～E)。以上結果表明，吲哚美辛可以減輕AP時小鼠的胰腺組織損傷。

A：小鼠胰腺組織HE染色；B：胰腺組織水腫評分；C：胰腺組織炎癥評分；D：胰腺組織壞死評分；E：胰腺組織病理學評分。aP<0.05 vs 對照組；cP<0.05 vs 胰腺炎組(n=7)。

2.2 吲哚美辛降低AP小鼠血清淀粉酶與脂肪酶水平

檢測四組小鼠血清淀粉酶與脂肪酶的水平，結果發現，血清淀粉酶水平雨蛙素組較對照組和吲哚美辛組明顯升高(P<0.05)，而雨蛙素+吲哚美辛組則較雨蛙素組顯著降低(P<0.05，圖3A)。血清脂肪酶水平雨蛙素組較對照組和吲哚美辛組明顯升高(P<0.05)，而雨蛙素+吲哚美辛組則較雨蛙素組顯著降低(P<0.05，圖3B)。以上結果提示，吲哚美辛可以減輕胰腺組織的損傷程度，減少胰腺組織淀粉酶和脂肪酶的釋放。

A：小鼠血清淀粉酶活性；B：小鼠血清脂肪酶活性。aP<0.05 vs 對照組；cP<0.05 vs 雨蛙素組(n=7)。

2.3 吲哚美辛減少AP小鼠胰腺組織MPO+細胞數量

MPO是一種存在于中性粒細胞嗜苯胺藍顆粒中的溶酶體蛋白，胰腺、肺和其他組織中MPO的活性已被用作代表炎癥發展過程中中性粒細胞水平及活性變化的標志物[9-10]。對小鼠胰腺組織切片進行MPO免疫組化染色，結果顯示，與對照組比較，雨蛙素組組織間隙可見大量MPO表達陽性的細胞浸潤，而雨蛙素+吲哚美辛組胰腺組織MPO陽性細胞浸潤數量明顯減少(P<0.05，圖4)。以上結果提示，AP時大量中性粒細胞被招募至胰腺組織，吲哚美辛可以減少胰腺組織中中性粒細胞的活化與浸潤。

A：吲哚美辛減少胰腺組織MPO+細胞浸潤；B：MPO+細胞定量。aP<0.05 vs 對照組；cP<0.05 vs 雨蛙素組(n=7)。

2.4 吲哚美辛減輕AP小鼠胰腺組織炎癥因子表達

進一步提取四組小鼠胰腺組織的RNA，通過qRT-PCR檢測幾個常見炎癥因子在雨蛙素及吲哚美辛處理后mRNA表達水平的變化。結果顯示，與對照組比較，雨蛙素組IL-6、IL-1β及TNF-α mRNA的表達水平均明顯增加(P<0.05，圖5)；與雨蛙素組相比，雨蛙素+吲哚美辛組IL-6、IL-1β及TNF-α mRNA的表達水平均顯著降低(P<0.05，圖5)。

aP<0.05 vs 對照組；cP<0.05 vs 雨蛙素組(n=7)。

2.5 吲哚美辛對AP小鼠體內自噬通路的影響

電鏡是檢測自噬活動的金標準，為了探究吲哚美辛對AP小鼠自噬過程的影響，取小鼠胰腺組織進行透射電鏡檢測。結果顯示，雨蛙素組小鼠胰腺組織自噬空泡較對照組增多，而雨蛙素+吲哚美辛組中包含未降解酶原顆粒的自噬溶酶體的數量減少(圖6A)，以上結果初步提示吲哚美辛可以減少AP過程中異常堆積的自噬空泡。進一步使用Western blotting檢測自噬相關蛋白的變化，結果提示，與對照組及吲哚美辛組相比，雨蛙素組LC3-Ⅱ與P62蛋白的表達均顯著增加(P<0.05)，而雨蛙素+吲哚美辛組LC3-Ⅱ和P62蛋白的表達則較雨蛙素組均降低(P<0.05，圖6B～C)。以上結果提示，雨蛙素誘導AP后自噬過程被激活，但是自噬流受損，吲哚美辛可以恢復受損的自噬流。

A：小鼠的代表性胰腺內自噬空泡電鏡圖(紅色箭頭指示包含未被降解的酶原顆粒的自噬溶酶體，黃色五角星代表細胞核)；B：吲哚美辛降低胰腺組織內升高的LC3-Ⅱ、P62蛋白水平；C：LC3-Ⅱ、P62蛋白水平定量。aP<0.05 vs 對照組；cP<0.05 vs 雨蛙素組(n=7)。

3 討論

吲哚美辛是臨床常見的NSAIDs，具有廣泛的抗炎鎮痛作用，多項臨床研究發現吲哚美辛可以降低PEP的發生率，術前預防性使用吲哚美辛已成為防治PEP的基石[6，11-12]，然而其作用機制尚不明確。近些年來，隨著AP動物模型的成熟，有幾項基礎研究探討了吲哚美辛對AP動物模型發生發展過程的影響，LYU等[13]發現吲哚美辛對雨蛙素聯合脂多糖誘導的大鼠重癥AP起到了保護作用；GENG等[14]發現NSAIDs類藥物吲哚美辛與帕瑞昔布注射可以減輕逆行胰膽管注射法誘導的大鼠AP損傷程度。除了吲哚美辛外，OZER CAKIR等[15-16]發現雙氯芬酸鈉和阿司匹林等臨床常見的NSAIDs類藥物也可以改善小鼠AP及相關肺損傷。然而，也有部分研究顯示長期使用NSAIDs類藥物可能對胰腺的再生產生負面影響，如BOMBARDO等[17]研究發現，給予AP小鼠布洛芬治療雖然會降低胰腺炎癥因子的mRNA水平并減少巨噬細胞的浸潤，但這一過程伴隨著胰腺腺泡細胞增殖和細胞分裂的受損。綜上，先前的研究結果顯示出吲哚美辛等NSAIDs類藥物具有減輕AP的潛力，然而部分研究結果也提示這類藥物在使用過程中可能會出現一定的副作用，吲哚美辛在AP中的具體保護機制也尚未闡明，因此尚需深入探究NSAIDs類藥物在AP發生發展過程中的作用及其AP的具體保護機制。

目前在臨床上常規推薦體質量為60 kg的患者在ERCP術前預防性使用100 mg吲哚美辛栓劑以預防PEP，根據人與動物之間藥物劑量換算方法[18]，我們將吲哚美辛用于小鼠的注射劑量設定為8 mg/kg，為了保證吲哚美辛在小鼠體內的血藥濃度，在第一次雨蛙素注射前6 h和0.5 h給予小鼠兩次吲哚美辛腹腔注射。我們的實驗結果表明，雨蛙素造模組小鼠胰腺組織表現為明顯炎癥樣改變，血清淀粉酶與脂肪酶水平明顯升高，胰腺局部中性粒細胞浸潤及炎癥因子mRNA水平增加；雨蛙素+吲哚美辛組小鼠的胰腺組織病理學評分、血清淀粉酶與脂肪酶水平及炎癥細胞浸潤水平均下降，以上結果提示吲哚美辛可以減輕雨蛙素誘導的小鼠胰腺組織損傷。

吲哚美辛通過抑制環氧合酶(cyclooxygenase，COX)而發揮其抗炎鎮痛的效果，這是NSAIDs類藥物經典的作用機制[19]，然而抑制COX1常會引起胃腸道、腎臟和心臟損害等諸多不良反應，這些均會導致胰腺損傷加重[20]；部分研究也發現，特異性阻斷COX2途徑似乎對胰腺炎的炎癥情況無明顯保護作用[21-22]，因此，經典的COX途徑可能并未參與吲哚美辛在AP中的保護過程。

自噬是一種清除細胞內異常聚集的蛋白質、受損的細胞器和入侵的病原體的過程，它可以維持正常的細胞功能和細胞內穩態的動態平衡[23]。胰腺具有最高的蛋白質合成和運輸速率，基礎自噬可以負責清除合成有缺陷的蛋白質和細胞器，以維持腺泡細胞穩態[24-25]。胰腺腺泡細胞的自噬障礙是導致AP發生和進展的關鍵事件，具體表現為自噬小體的增多和溶酶體降解障礙，伴隨著胰腺LC3-Ⅱ蛋白水平的增加、長壽命蛋白降解率降低及P62蛋白水平升高，提示胰腺炎過程中自噬流受損[26-28]。電鏡是檢測自噬活動的金標準，在本實驗中，電鏡結果顯示，相較于對照組，胰腺炎自噬空泡及未被降解的酶原顆粒明顯增多，而在雨蛙素+吲哚美辛組這種自噬溶酶體的異常堆積則減輕。Western blotting進一步檢測自噬相關蛋白，結果顯示，雨蛙素組LC3-Ⅱ與P62蛋白的表達明顯升高，而雨蛙素+吲哚美辛組這兩種蛋白的表達均下降。以上結果表明AP時自噬過程激活以及自噬降解的受損，而吲哚美辛處理可減少AP時自噬空泡的聚集以及自噬相關蛋白的表達，提示吲哚美辛可以激活自噬流，改善胰腺炎引起的自噬流受損。然而目前吲哚美辛調控自噬過程的具體方式還不清楚，其他非經典途徑是否也參與吲哚美辛對于AP的保護作用仍需探索。

綜上所述，本研究通過構建雨蛙素誘導的小鼠AP模型，驗證了吲哚美辛可以減輕雨蛙素誘導的小鼠胰腺損傷，降低胰腺組織炎癥細胞浸潤程度與炎癥因子mRNA表達，同時首次探究了吲哚美辛在特定的AP環境下對胰腺自噬過程的調控，我們的實驗結果也提示吲哚美辛很可能通過恢復AP時受損的自噬流發揮其對小鼠胰腺損傷的保護作用，為開發更好的AP防治策略打下基礎，但是闡明吲哚美辛防治AP的具體分子機制、自噬調控在AP發生發展過程中發揮的作用仍需進一步的探索。