WTAP通過上調糖酵解抑制結直腸癌細胞分化

董可為，沈 堯，王 帥，樊小艷，徐 棟，郝 俊，李紀鵬，張 健

(空軍軍醫大學：1基礎醫學院生物化學與分子生物學教研室，2西京醫院實驗外科，陜西 西安 710032)

結直腸癌是全球范圍內最常見的惡性腫瘤之一。近年來，隨著生活水平的提高和飲食習慣的改變，我國結直腸癌發病率呈現顯著上升趨勢，由結直腸癌帶來的健康問題日益嚴峻。雖得益于治療方法的改進，腫瘤相關致死率有所下降，但其依然位列惡性腫瘤第3位[1-2]。結直腸癌細胞具有潛在的分化能力，但其分化成熟卻伴隨著增殖減弱和細胞周期阻滯。盡管近年來結直腸癌分子遺傳學相關研究進展迅速，但其增殖分化的調控機制尚不清楚。

N-6-甲基腺苷(N6-methyladenosine，m6A)是一種常見的RNA修飾方式，參與RNA轉錄、翻譯、穩定性和核輸出等過程，在腫瘤的發生發展中扮演重要角色[3-5]。Wilms腫瘤抑制因子1相關蛋白(Wilms’ tumor 1-associating protein，WTAP)作為RNA m6A修飾的重要元件，可與甲基轉移酶樣3(methyltransferase-like 3，METTL3)和METTL14等形成功能復合體，共同參與m6A修飾過程[6]。然而，對WTAP的功能及機制研究卻遠不如METTL3和METTL14那樣詳盡清晰。據報道，WTAP敲除可導致胚胎致死，且參與了大量的細胞過程，如選擇性剪接、X染色體失活和細胞周期調節等[7-10]。WTAP在腫瘤中的功能研究仍少見，目前認為它可能通過m6A修飾或其他信號通路促進或抑制腫瘤進展[11-13]。

代謝重編程是腫瘤的標志性特征之一，本課題組及其他課題組相關研究表明結直腸癌的發生發展伴隨著代謝表型的改變[14-15]。然而，在結直腸癌細胞增殖分化過程中，腫瘤細胞的代謝表型如何改變及其分子機制仍是未解之謎。有研究證實，敲降WTAP可抑制葡萄糖消耗、乳酸生成和糖酵解[16]，而該過程是否在結直腸癌細胞分化進程中發揮作用尚未可知。因此，本研究明確了WTAP在結直腸癌細胞分化過程中的表達情況及生物學功能，并利用轉錄組學及分子生物學手段探索了WTAP影響結直腸癌細胞分化的分子機制，旨在初步明確WTAP在結直腸癌細胞分化過程中的表達和功能，以期為尋找結直腸癌治療新靶點提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

細胞：結腸癌細胞系Caco2和HCT116為本實驗室保藏。

試劑：DMEM細胞培養液、血清(Gibco公司，美國)；5A細胞培養液(Sigma公司，美國)；胰酶消化液(BioFroxx公司，德國)；青鏈霉素混合液、BCA蛋白定量試劑盒(米鼠生物公司，中國)；鼠抗β-actin(BM0627，1∶1 000，武漢博士德公司)；兔抗WTAP(56501，1∶1 000)、兔抗E-cadherin(3195，1∶1 000)、辣根過氧化物酶標記馬抗鼠IgG(7076，1∶3 000)、羊抗兔IgG(7074，1∶3 000，Cell Signaling Technology公司，美國)；RIPA裂解液(碧云天生物公司，中國)；ECL化學發光顯影劑(杭州弗德生物公司)；嘌呤霉素(Selleck公司，美國)；Illumina Truseq試劑盒(Illumina公司，美國)；Hifair?Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix反轉錄試劑盒、Hieff?qRCR SYBR Green Master Mix實時熒光定量試劑盒(上海翌盛生物公司)。

儀器：S1000TM Thermal Cycler、CFX96TM Real-time System、Western blotting電泳儀、Western blotting轉膜儀(Bio-Rad公司，美國)；Centrifuge 5804離心機(Eppendorf公司，德國)；Prism 7500 Real-time PCR儀、Heracell 150i細胞培養箱(Thermo公司，美國)。

1.2 方法

1.2.1 接觸抑制分化模型 選取對數生長期的結腸癌細胞，消化、離心并重懸，隨后在細胞培養箱中孵育，當細胞在培養皿中長滿時，記錄為“0 d”，繼續培養，分別于0、3、6、9 d收取細胞樣品，通過檢測分化指標E-cadherin的表達水平確定細胞的分化程度。

1.2.2 建立WTAP敲降和過表達的穩轉細胞株 將Flag-WTAP和短發卡WTAP構建入pCDH慢病毒表達載體感染結直腸癌細胞系，感染細胞48 h后加入嘌呤霉素(Selleck公司，貨號：S7417)進行篩選，得到表達空載體(對照組)、Flag-WTAP(WTAP過表達組)和WTAP穩定敲低(WTAP敲降組)的細胞株。利用qRT-PCR和Western blotting方法對WTAPmRNA和蛋白的表達水平進行驗證。

1.2.3 qRT-PCR 提取總RNA后對其進行反轉錄獲得cDNA，作為后續定量PCR的反應模板。利用Primer Express(ABI，Foster City，美國)程序設計引物，在Prism 7500 Real-time PCR儀上進行反應。引物用熒光染料SYBR Green Ⅰ標記，PCR反應獲得的數據用ABI Prism 7500 SDS軟件進行分析。

1.2.4 Western blotting 將收集的細胞或組織用預冷的PBS洗滌2次，然后加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液充分裂解細胞(若為組織需勻漿)。用BCA法測定蛋白含量，取40 μg蛋白樣品進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，恒壓轉膜1.5 h后用50 g/L脫脂奶粉在室溫封閉1 h，將NC膜與一抗置于4 ℃冰箱過夜；第2日取出膜復溫后用TBST洗膜3次，每次5 min，加入二抗室溫孵育1 h，再用TBST洗膜3次。利用化學發光法顯影檢測目的蛋白。

1.2.5 轉錄組學測序及數據分析 以細胞接觸抑制分化模型中0 d和6 d的HCT116細胞為實驗模型，采用RNA測序技術分析細胞分化對RNA表達水平的影響：采用Illumina Truseq 試劑盒建庫，Illumina Hiseq 2500平臺測序。每個樣本獲得平均10 G以上的有效數據，包括mRNA表達譜、RNA可變剪接及非編碼RNA表達譜等；通過統計分析，選取矯正后的P<0.05、差異倍數≥2的基因作為差異表達的基因；并對顯著差異基因進行GO功能富集和KEGG通路分析。

2 結果

2.1 結腸癌細胞誘導分化后WTAP表達水平下調

本研究首先構建了結直腸癌細胞Caco2接觸抑制分化模型，利用qRT-PCR實驗檢測E-cadherin和WTAPmRNA水平，結果顯示，E-cadherinmRNA表達水平在Caco2細胞接觸抑制3 d時即顯著上調(圖1A)，而與之相反，WTAPmRNA表達水平隨著Caco2結直腸癌細胞分化呈顯著下調趨勢(圖1B)；利用Western blotting實驗對E-cadherin和WTAP的蛋白水平進行檢測，發現伴隨著Caco2結直腸癌細胞分化，E-cadherin的蛋白水平顯著上調，而WTAP則顯著減少(圖1C)。以上結果提示，WTAP在結腸癌細胞分化后表達下調。

2.2 敲降WTAP可誘導結腸癌細胞分化

為了探究WTAP對結直腸癌細胞分化的影響，本文成功構建了WTAP穩定過表達和敲降的HCT116結直腸癌細胞系(圖2A)，利用qRT-PCR實驗對分化指標E-cadherinmRNA表達水平進行檢測分析，發現WTAP過表達細胞中E-cadherinmRNA水平下調(P<0.01)，而敲降WTAP后E-cadherinmRNA水平顯著增加(圖2B～D)。由此得出結論，WTAP可負調控結直腸癌細胞分化。

A～B：qRT-PCR檢測WTAP過表達和敲降后WTAP mRNA的表達水平；C～D：qRT-PCR檢測WTAP過表達和敲降后E-cadherin mRNA表達水平。aP<0.05，bP<0.01 vs 對照組。

2.3 結腸癌分化細胞的基因表達模式不同于對照組細胞

為了探索結直腸癌細胞分化的調控機制，利用HCT116細胞分化模型進行了轉錄組學測序分析。培養0 d和培養6 d分化的樣本分別聚集在一起，說明兩組樣本轉錄組表型確有顯著差異(圖3A)；通過統計分析，選取矯正后的P<0.05、差異倍數≥2的基因作為差異表達的基因，共篩選出2 432個與分化相關的顯著差異基因，其中1 290個基因在分化后上調，而1 142個基因在分化后下調(圖3B～C)。

2.4 結腸癌細胞分化過程中糖酵解途徑顯著異常

為了闡明分化過程中基因功能的變化，本文對篩選出的顯著差異基因進行了GO富集分析(圖4A)。接著，為了確定差異表達基因參與的最主要生化代謝途徑和信號轉導途徑，進行了KEGG通路分析，發現細胞糖酵解/糖原生物合成途徑是受細胞分化影響最顯著的通路(圖4B)。

2.5 WTAP促進糖酵解相關酶的表達

鑒于結直腸癌細胞分化進程中糖酵解途徑顯著異常，因此，本文推測WTAP對結直腸癌細胞分化的負調控作用可能是通過影響糖酵解途徑實現的。為了初步證實這個猜想，通過構建的WTAP敲降及過表達的HCT116結腸癌穩轉細胞系對糖酵解通路相關酶的表達水平進行檢測分析發現，敲降WTAP可顯著下調糖酵解通路中甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、葡萄糖轉運蛋白1、葡萄糖轉運蛋白4、烯醇化酶2、磷酸甘油酸激酶1(phosphoglycerate kinase 1，PGK1)和磷酸果糖激酶2 mRNA表達水平(P<0.05，P<0.01)，而過表達WTAP則可使GAPDH、醛縮酶A、PGK1和己糖激酶2 mRNA表達上調(P<0.05，P<0.01，圖5)。綜上所述，WTAP可能通過促進結腸癌細胞糖酵解抑制其分化。

A：WTAP敲降對糖酵解相關酶mRNA表達水平的影響；B：WTAP過表達對糖酵解相關酶mRNA表達水平的影響。GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶；GLUT1：葡萄糖轉運蛋白1；GLUT4：葡萄糖轉運蛋白4；ALDOA：醛縮酶A；ENO2：烯醇化酶2；LDHA：乳酸脫氫酶A；PGK1：磷酸甘油酸激酶1；HK2：己糖激酶2；PFK：磷酸果糖激酶2。aP<0.05，bP<0.01。

3 討論

結直腸癌的發病率和腫瘤相關致死率均位于惡性腫瘤前列[17-18]。因此，尋找有效的治療靶點仍是結直腸癌研究領域不可忽視的科學問題，對結直腸癌的預防和提高其治療有重大意義。作為m6A修飾復合體的重要組分，WTAP在結直腸癌惡性進展中的作用尚不明確。本課題旨在明確WTAP在結腸癌細胞分化中的作用，以期為結直腸癌臨床治療提供新的藥物靶點。

WTAP在結直腸癌中的作用尚不明確。有研究表明，WTAP在結直腸癌中表達上調，且常常提示預后不良。在機制方面，WTAP可通過RNA m6A修飾方式作用于其他分子，參與細胞增殖[16，19]、分化[13，20]和轉移[21]等多種生物學進程。已有文獻報道WTAP與結直腸癌細胞分化呈負相關[20]。本研究進一步證實了WTAP的表達水平隨著結直腸癌細胞分化進程逐漸下降，并利用WTAP穩定敲降和過表達的細胞系證實了WTAP對結腸癌細胞分化的負調控作用。

代謝重編程為腫瘤細胞提供能量、大分子前體物質和氧化還原平衡微環境的支持，在結直腸癌的發生發展、轉移播散和耐藥復發等方面發揮了巨大作用[22]。20世紀20年代，“Warburg效應”的發現為腫瘤細胞的能量及物質來源提供了理論依據。本研究結果顯示，結直腸癌分化細胞糖酵解途徑顯著異常，與其他人的研究結果一致，該研究認為分化程度較低的結腸癌干細胞有氧糖酵解顯著上調。同時，本實驗結果證實WTAP可促進糖酵解相關酶的表達，而之前已有研究證實，敲低WTAP抑制了葡萄糖消耗、乳酸生成和糖酵解[14]，從而影響結直腸癌惡性進展。

綜上所述，本研究通過綜合轉錄組學和分子生物學分析手段證實了WTAP通過促進糖酵解途徑負調控結腸癌細胞分化。研究初步明確了WTAP在結腸癌細胞分化中的表達模式和功能，然而，本研究存在一定局限性，WTAP調控糖酵解的具體分子機制尚不清楚。后續課題組將進一步完善WTAP調控結直腸癌細胞分化的理論基礎，為靶向WTAP治療結直腸癌提供更為充分的科學依據。