基于網絡藥理學和分子對接探討艾迪注射液治療結直腸癌作用機制研究

曾 煉，楊 桃，陳 江，曹一波，胡文婷，羅字呈，肖天保

(1貴州中醫藥大學第一臨床醫學院，貴州 貴陽 550025；2貴州中醫藥大學第一附屬醫院肛腸科，貴州 貴陽 550001)

在全球范圍內，結直腸癌(colorectal cancer，CRC)的發病率在各類惡性腫瘤中居第三位，也是僅次于肺癌的第二大死因[1]。2022年中國統計報告顯示：我國CRC新發人數為592 232例，死亡人數為309 114例，CRC在全球的發病率和死亡率都在不斷增加[2-3]。手術治療是大多數CRC患者的主要治療方式，對于無法行手術治療或術后患者多采用化療[4]，但化療常常伴有骨髓抑制、肝功能異常、消化系統癥狀、外周神經功能病變等不良反應，且會延長患者總住院時長，從而降低患者的生存質量[5-7]。隨著中醫藥事業的創新發展，一些中藥的制劑被用于治療CRC，療效頗為顯著，且不良反應低于西藥。艾迪注射液中藥組成包括人參、斑蝥、黃芪、刺五加，全方具有解毒散結、扶正祛邪的功效[8]，臨床廣泛用于肺癌、肝癌、大腸癌及胃癌等，可以聯合化療使用以提升患者的免疫力，并降低化學療法所產生的負面影響，進而改善患者的生活品質[9-10]。然而，艾迪注射液抗CRC的具體機制有待進一步研究。因此，本研究擬采用網絡藥理學技術結合分子配對方式，探索艾迪注射液抗CRC的藥效物質基礎及靶標，闡明艾迪注射液抗CRC作用的分子機制。

1 資料與方法

1.1 艾迪注射液有效化學成分收集與篩選

在TCMSP(https：//cmspw.com/tcmsp.php)、TCM-ID數據庫[11](https：//www.bidd.group/TCMID/)、中國知網和PubMed上檢索艾迪注射液的活性成分。根據口服生物利用度≥30%和類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18篩選化合物。

1.2 化學成分相關靶點的預測與篩選

成分SMILES號在PubChem數據庫[12](https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中獲取，ADME參數利用SwissADME數據庫[13](http：//www.swissadme.ch/)進行預測，以藥代動力學參數胃腸道吸收度為“High”，DL滿足兩項以上“Yes”作為篩選標準[14]，進行活性成分篩選。將篩選后的活性成分信息導入SwissTargetPrediction數據庫[15](http：//www.swisstargetprediction.ch/)中，對“Probability*”(成分對應靶點的可能性)>0的靶標進行了篩選，確定了其為可能的藥物作用靶標。

1.3 CRC相關基因收集

以“colorectal cancer”為關鍵詞，從GeneCards數據庫[16](https：//www.genecards.org/)、OMIM數據庫[17](https：//www.omim.org/)、DisGeNET數據庫[18](https：//www.disgenet.org/)中檢索CRC相關靶點。最后，從3個數據庫中刪除重復項，以獲得最終的CRC疾病靶標。當獲取結果靶點過多時以篩選Score值大于中位數的靶點作為疾病的潛在靶點。

1.4 構建“艾迪注射液治活性成分作用靶點”網絡模型

通過使用Venny繪制網頁工具對篩選出的艾迪注射液活性成分目標和CRC目標進行了交集并制作韋恩圖，接著利用Cytoscape 3.9.1版本的軟件建立了一個“活性成分-作用靶點”的網絡模型以展示艾迪注射液對抗CRC的效果。

1.5 構建蛋白質蛋白質相互作用(protein-protein interaction，PPI)網絡

為了明確艾迪注射液中的成分與CRC疾病目標之間的相互影響，我們將以上獲取到的交集目標上傳至STRING平臺[19](https：//cn.string-db.org/)，以“人源”的種屬作為研究對象，建立PPI網絡模型圖。通過Cytoscape3.9.1軟件可視化PPI網絡圖并篩選出核心靶點。

1.6 靶點功能與通路富集分析

使用Metascape平臺[20](https：//metascape.org/)對艾迪注射液與CRC的共同目標基因進行了GO富集分析及KEGG通路分析。根據P值選取GO分析排名前10的條目和KEGG富集分析排名前10的條目進行可視化。

1.7 分子對接

將PPI網絡中Degree值前5的靶點作為關鍵靶點，和“艾迪注射液-活性成分-作用靶點”中前5個活性成分進行分子對接。從PDB數據庫(https：//www.rcsb.org/)中下載前5個核心靶基因編碼的蛋白質的三維結構作為蛋白質受體。從TCMSP數據庫下載艾迪注射液活性化合物的二維結構。將它們引入PyMOL完成脫水和去配體預處理，然后利用AutoDockTools實施加氫操作，配體加氫完成后進行受體與配體的分子對接，對接完成的配體和受體使用PyMOL軟件，對其進行可視化并導出可視化圖。

2 結果

2.1 艾迪注射液的活性成分和潛在靶點

按照篩選條件，通過數據庫檢索的成分共51個(斑蝥1個，黃芪20個，人參22個，刺五加8個)，通過文獻檢索得到16個艾迪注射液活性成分[21-24]。按照篩選標準及SwissADME數據庫篩選后共得到成分39個(斑蝥1個，黃芪15個，人參16個，刺五加7個)。其中黃芪和人參均有山柰酚活性成分，槲皮素為黃芪和刺五加共有活性成分(表1)。利用SwissTargetPrediction數據庫對39個活性成分進行搜索，篩選與去除重復項后得到684個成分對應的靶點。

表1 艾迪注射液有效活性成分

2.2 疾病和藥物共同靶點

檢索3個疾病基因數據庫，共得到1 792個疾病靶點。將艾迪注射液的潛在作用靶點與CRC疾病靶點導入Venny在線作圖軟件，繪制成韋恩圖，并得到169個交集靶點(圖1)。

CRC：結直腸癌。

2.3 艾迪注射液治療CRC的“活性成分作用靶點”網絡圖繪制

將艾迪注射液治療CRC的潛在有效成分和潛在靶點數據導入Cytoscape 3.9.1軟件進行網絡可視化。該網絡圖由208個節點、342條邊組成(圖2)。其中關聯度得分較大者為華良姜素、山柰酚、槲皮素、黃芪紫檀烷、異黃烷酮，提示上述成分可能是艾迪注射液治療CRC的核心成分。

黃色代表艾迪注射液，紅色代表藥物，綠色代表藥物有效活性成分，藍色代表靶點。

2.4 PPI網絡構建

將交集靶點導入STRING平臺，創建PPI網絡。通過Cytoscape 3.9.1的可視化功能，我們得到了一個網絡圖，包含168個節點和3 503條邊。通過Centiscape 2.2插件對網絡進行拓撲分析，計算得到Closeness值0.003 3，Betweenness值139.10，Degree值41.70，按照上述值進行篩選后得到75個節點，1 843條邊。圖中節點顏色深淺與Degree值有關，顏色越深，節點越大，其Degree值越大，代表該節點在網絡中越重要(圖3)。通過Cytoscape插件Cytohubba計算排名前5的靶點，分別有TP53、BCL2、AKT1、CCND1、CASP3(表2)。

圖3 艾迪注射液對CRC作用靶點PPI網絡圖

表2 Degree值排名前5的共表達基因拓撲學分析

2.5 GO和KEGG富集分析

在Metascape平臺上對交集靶點進行GO功能富集分析，共獲得2 141個GO項目，包括1 845個生物過程(biological process，BP)，主要與蛋白質磷酸化、細胞因子的反應、細胞死亡的正調控相關；108個細胞組成(cellular component，CC)，主要與受體復合物、膜筏、磷脂酰肌醇3-激酶復合物和基底質膜相關；188個分子功能(molecular function，MF)，主要與蛋白激酶活性、激酶激活、轉錄因子結合相關(圖4)。根據P值選擇前10個項目進行可視化分析。交集靶點經KEGG富集分析后共得到200條調控通路，其中與CRC相關的主要包括癌癥通路、PI3K/AKT信號通路、細胞周期、膀胱癌、結核、鈣信號通路等通路(圖5)。

圖4 GO功能富集分析

圖5 KEGG通路富集分析

2.6 分子對接驗證

使用AutoDock軟件在分子水平上將具有最高度值的5種活性成分(華良姜素、山柰酚、槲皮素、黃芪紫檀烷、異黃烷酮)與PPI網絡中的5種核心蛋白(TP53、BCL2、AKT1、CCND1、CASP3)對接。分子對接的結合能力越低，表明配體與受體的結合越穩定[25]。其中對接結合能<-17.79 kJ/mol認為配體與靶點之間具有結合活性，結合能<-20.93 kJ/mol表明結合活性較佳[26]。對接結果顯示，平均結合能為-22.07 kJ/mol，表明艾迪注射液的核心成分與核心靶點連接性能佳(表3)。其中，華良姜素與TP53(結合能-28.70 kJ/mol)、BCL2(結合能-23.92 kJ/mol)、AKT1(結合能-24.60 kJ/mol)，山柰酚與TP53(結合能-21.45 kJ/mol)、BCL2(結合能-23.92 kJ/mol)、AKT1(結合能-22.37 kJ/mol)，槲皮素與TP53(結合能-23.80 kJ/mol)、BCL2(結合能-19.53 kJ/mol)、AKT1(結合能-19.90 kJ/mol)均有較好的結合活性(圖6)。

A：槲皮素與AKT1；B：槲皮素與BCL2；C：槲皮素與TP53；D：華良姜素與AKT1；E：華良姜素與BCL2；F：華良姜素與TP53；G：山柰酚與AKT1；H：山柰酚與BCL2；I：山柰酚與TP53。

表3 關鍵靶點與有效活性成分對接參數及結合能分數

3 討論

CRC是消化系統常見腫瘤之一，是我國發病率第五位的腫瘤。CRC根據其癥狀，中醫屬于“鎖肛痔”“腸蕈”“臟毒”，瘀毒互結是該病的重要病機[27-28]。艾迪注射液全方以斑蝥為君藥，輔佐黃芪、人參、刺五加三味藥，四味藥協同可以清熱解毒抗癌，同時也能益氣消瘀散結[29]。彭小丹等[30]采用艾迪注射液聯合XELOX方案(卡培他濱+奧沙利鉑)治療晚期CRC患者，其研究組(艾迪注射液聯合XELOX化療)的腫瘤標志物(CEA、CA125、CA242)下降程度高于對照組(XELOX方案)，且研究組治療后Th17比例、Th17/Treg比值高于對照組同期，研究組血管生成指標(VEGF、MVD)下降均高于治療組，化療聯合艾迪注射液的治療，可抑制血管生成，有效阻止疾病的進展。

本研究通過網絡藥理學發現艾迪注射液有效成分39個，所對應靶點684個，其中關聯度得分較大者是華良姜素、山柰酚、槲皮素等成分，可能是艾迪注射液發揮抗CRC的重要藥效成分。華良姜素是一種黃酮類化合物，廣泛存在于黃芪、丁香等中藥材中[31]。研究表明，華良姜素能夠通過誘導癌細胞的死亡和阻止M2表型腫瘤相關巨噬細胞的活化來展現其抗癌效應[32]，腫瘤相關巨噬細胞是腫瘤微環境中最豐富的先天免疫群體，是促進腫瘤生長和轉移的重要細胞[33]。槲皮素為黃芪和刺五加共有活性成分，實驗表明，其能減少IL-6和p-STAT3在結直腸組織中的表達，從而抑制結直腸黏膜炎癥細胞浸潤，減少結直腸道炎癥反應，抑制腫瘤的發展[34]。山柰酚為黃芪和人參共有活性成分，是一種天然衍生的黃酮醇，可減少活性氧的產生，其抗氧化和抗炎作用調節癌癥的發展和進展[35]。CHO等[36]研究發現山柰酚以劑量依賴(0～60 μmol/L)的方式減少HT-29人結腸癌細胞中的活細胞數量，山柰酚通過下調CDC2C抑制CDC1/cyclin B25復合物的激活，導致G2/M細胞周期停滯。

通過PPI拓撲分析及Degree值篩選結果可知，TP53、BCL2、AKT1是Degree值排名前三的靶點蛋白，推測可能是艾迪注射液發揮抗CRC的核心靶點。轉錄因子p53是一種關鍵的抑癌因子，可調節多種細胞反應以防止癌癥發展。約43%的CRC發生TP53突變，發生突變的TP53其蛋白結構改變，失去抑癌作用，促進癌細胞增殖、侵襲和轉移，從而促進癌癥進展，可作為腫瘤惡性程度的重要參考指標[37-38]。BCL2是一種抗凋亡蛋白，促生存BCL2蛋白的異常高表達與各種癌癥的發展和預后不良相關，此外，BCL2的過表達使惡性和未轉化細胞對以TP53依賴性方式殺死細胞的各種抗癌藥物具有顯著抗性[39-40]。AKT1也稱為AKT激酶，作為PI3K/AKT/mTOR信號通路的介質，在一系列細胞過程中起重要作用，可觸發許多生物過程，包括細胞存活生長、糖代謝、血管生成，并刺激細胞的惡性轉化和腫瘤進展[41-42]。

根據KEGG通路富集分析結果顯示，癌癥、PI3K/AKT、膀胱癌等信號通路是艾迪注射液抗CRC的主要通路。PI3K/AKT信號通路與癌癥的發生發展密切相關，是各種類型癌癥的主要信號通路，通過調節其下游效應子，促進腫瘤細胞發生和增殖[43]。姚紅等[44]通過RNA測序和分析發現，華良姜素對細胞凋亡相關基因的mRNA表達有影響，可能通過PI3K/AKT信號通路等代謝途徑對HepG2細胞有抑制作用，主要是下調了TEK、PIK3CG、JAK3等與癌細胞凋亡相關的差異基因。有研究表明山柰酚可以通過抑制PI3K/AKT/mTOR通路，從而減輕與炎癥依賴性途徑相關的氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)誘導的細胞凋亡[45]。同時，也有證據表明，當山柰酚與5-氟尿嘧啶結合使用時，它們可能會通過壓制PI3K/AKT信號傳導路徑而觸發腫瘤細胞的死亡，導致細胞周期的暫停，最后實現對抗腫瘤的效果[46-47]。YANG等[48]通過實驗發現，槲皮素處理后的HT-29人結腸癌細胞中AKT和CSN6蛋白表達水平顯著下調，進一步驗證了槲皮素誘導促凋亡信號轉導通路，從而抑制HT-29人結腸癌細胞的細胞活力，誘導細胞凋亡并導致細胞周期停滯。

分子對接結果表明，艾迪注射液治療CRC的5種重要成分與5個核心蛋白之間具有良好的結合能力。其中華良姜素與5個核心蛋白結合能均較高?？赡鼙砻魅A良姜素是艾迪注射液治療CRC的核心成分。目前活性成分華良姜素治療CRC的相關研究較少，有待進一步挖掘其證據。

綜上所述，艾迪注射液中的華良姜素、山柰酚、槲皮素等成分，通過TP53、BCL2、AKT1、CCND1、CASP3等靶蛋白影響癌癥的通路、PI3K/AKT信號通路，從而發揮治療CRC的作用。為臨床上應用艾迪注射液治療CRC實驗進一步提供理論依據。