長爪沙鼠不同感音神經性耳聾模型的建立及比較

宋丹丹 桂飛 汪海燕 胡金池 黃瑾 楊磊

摘要：目的 利用不同的耳毒性藥物建立長爪沙鼠感音神經性耳聾模型，并對3種模型進行比較分析，為感音神經性耳聾的研究提供精準的動物模型。方法 選擇長爪沙鼠，建立硫酸卡那霉素和呋塞米聯用（KM+Fur）、新霉素（Neo）及哇巴因（Oua）3種耳毒性藥物的感音神經性耳聾模型，通過聽性腦干反應（ABR）和耳蝸組織形態學檢測，比較分析不同耳毒性藥物的損傷特點。結果 KM+Fur造模后，與對照組（14.00±1.80）相比，該組（71.00±5.26）長爪沙鼠的聽力閾值顯著上升，耳蝸HCs大量損傷，而SGNs無明顯損傷；Neo造模后，與對照組相比，40 mmol·L-1 Neo僅影響沙鼠高頻32 kHz時聽力閾值（60.00±8.66），無明顯的組織學改變；而100 mmol·L-1 Neo組的沙鼠各頻率聽力閾值均顯著上升，且耳蝸HCs及SGNs均嚴重受損；Oua造模后，1 mmol·L-1 Oua 和10 mmol·L-1 Oua均可引起沙鼠各頻率聽力閾值顯著上升，但損傷范圍不同，10 mmol·L-1 Oua使HCs和SGNs均嚴重受損，而1 mmol·L-1 Oua僅造成耳蝸SGNs損傷。結論 利用KM+Fur可建立長爪沙鼠HCs特異性受損的感音神經性耳聾模型；40 mmol·L-1 Neo可建立高頻區聽功能損傷的感音神經性耳聾模型；利用100 mmol·L-1 Neo和10 mmol·L-1 Oua可以建立長爪沙鼠HCs和SGNs均受損的感音神經性耳聾模型；利用1 mmol·L-1? Oua可以建立長爪沙鼠耳蝸SGNs特異性受損的耳聾模型。

關鍵詞：感音神經性耳聾；長爪沙鼠；動物模型；耳毒性藥物

中圖分類號：R764中圖分類號文獻標志碼：A文獻標識碼

Establishment and comparison of sensorineural deafness models in Mongolian gerbils

SONG? Dandan1， 2，GUI? Fei2，WANG? Haiyan1，HU? Jinchi2，HUANG? Jin2，YANG? Lei1， 2*

（1 School of Public Health， Hangzhou Normal University，Hangzhou，Zhejiang 311121， China;

2 School of Medicine， Shihezi University，Shihezi， Xinjiang 832000， China）

Abstract：? Objective Different ototoxic drugs were used to establish the model of sensorineural deafness in Mongolian gerbils， and the three models were compared to provide accurate animal models for the study of sensorineural deafness. Methods Mongolian gerbils model of sensorineural deafness was established by kanamycin sulfate and furosemide （KM+Fur）， neomycin （Neo） and Ouabain （Oua）， ABR auditory function and cochlear tissue morphological test were examined to compare and analyze the damage characteristics of different ototoxic drugs. Results After KM+Fur modeling， compared with the control group （14.00±1.80）， the hearing threshold of Mongolian gerbils in this group （71.00±5.26） was significantly increased， and the cochlear HCs， while SGNs were not significantly damaged. After Neo modeling， 40 mmol·L-1 Neo only affected the hearing threshold （60.00±8.66） at high frequency 32 kHz， and had no obvious histological changes. n the 100 mmol·L-1 Neo group， the hearing thresholds of all frequencies were significantly increased， and the cochlear HCs and SGNs were severely damaged. After the modeling of Oua， 1 mmol·L-1 Oua and 10 mmol·L-1 Oua could significantly increase the hearing thresholds of all frequencies in gerbils， but the damage ranges were different. 10 mmol·L-1 Oua severely damaged HCs and SGNs， while 1 mmol·L-1 Oua only damaged cochlear SGNs. Conclusion KM+Fur can be used to establish sensorineural deafness model with specific damage of HCs in gerbils. 40 mmol·L-1 Neo can establish sensorineural deafness model with high frequency hearing impairment. Using 100 mmol·L-1 Neo and 10 mmol·L-1 Oua， the sensorineural hearing loss model of gerbils with impaired hair cells and spiral ganglion neurons was established. Deafness model with cochlear spiral ganglion neurons specific impairment of gerbils cochlea with 1 mmol·L-1 Oua was established

Key words： sensorineural deafness;Mongolian gerbil;animal model;ototoxic drugs

0 引言

耳聾是臨床上最常見的致殘性疾病之一，其中感音神經性聽力損失占耳聾的絕大多數［1］。實驗動物疾病模型是開展其各項基礎和臨床應用研究必不可少的實驗工具，而選擇并建立精準的耳聾實驗模型對感音神經性耳聾的研究至關重要。

在各種感音神經性耳聾動物模型中，耳毒性藥物所致的動物模型較噪聲暴露、基因突變等造模更常用，且藥物劑量可控，建立的模型更穩定［2］。藥物誘導耳聾的方法有許多，例如新霉素（neomycin，Neo）或哇巴因（ouabain，Oua）的圓窗局部給藥［3-4］，以及硫酸卡那霉素（kanamycin sulfates， KM）、呋塞米（furosemide， Fur）的聯用全身給藥［5-6］等。不同藥物的造模原理、給藥方式及濃度等，所造成的損傷程度、損傷范圍有較大差異。

關于長爪沙鼠在耳聾模型中的應用鮮見報道，本研究選擇長爪沙鼠采用3種常用的耳毒性藥物造模，包括一種全身給藥方式（硫酸卡那霉素和呋塞米聯用）的和兩種局部給藥方式（新霉素和哇巴因分別經圓窗給藥），建立不同的急性感音神經性耳聾模型；通過觀察長爪沙鼠的聽功能，以及檢測耳蝸毛細胞（hair cells， HCs）和螺旋神經節細胞（spiral ganglion neurons， SGNs）的組織形態學變化，比較分析不同耳毒性藥物的損傷特點，為研究感音神經性耳聾提供精準的實驗動物模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物飼養

本實驗選取70只2～3月齡健康的長爪沙鼠，雌雄各半。所有動物實驗均符合實驗動物福利倫理，飼養在杭州師范大學實驗動物中心屏障系統隔離器中，環境溫度20～26℃，相對濕度40%～70%，光照條件12/12h明暗交替，動物自由采食、飲水。使用許可證：SYXK（浙）2020-0026。

1.2 模型的建立

實驗前ABR聽功能檢測顯示其聽力均正常，耳廓反應靈敏，外耳道通暢。剪腳趾標記，隨機分為對照組、硫酸卡那霉素和呋塞米聯用組（KM+Fur）、新霉素（Neo）40mmol·L-1和100mmol·L-1兩組、哇巴因（Oua）1mmol·L-1和10mmol·L-1兩組，每組10只。

本研究造模使用的3種耳毒性藥物（KM+Fur、Neo和Oua）購自Sigma公司，分別采用全身給藥和局部給藥的方式，具體操作如下。

對于KM+Fur的全身給藥，首先皮下注射KM（1000 mg·kg-1），30 min后腹腔注射Fur（500 mg·kg-1）。給藥后觀察動物狀態，并放回籠內正常飼養。

對于Neo或Oua的經圓窗局部給藥，先使用戊巴比妥鈉（上海上藥新亞藥業有限公司），按動物體重進行麻醉，然后在耳背部剔除毛發并擦拭酒精。皮膚打開一個開口，鈍性分離肌肉和脂肪組織，暴露聽泡。接著，在聽泡上打一個小孔并順著開孔方向找到圓窗的位置。將藥物緩慢滴注于圓窗膜上，每耳20μL，分4次給藥，15 min·次-1，給藥完成后，用明膠海綿填塞創口后縫合肌肉和皮膚，手術過程中置于37 ℃加熱臺上（蘇金壇醫療器械廠）孵育，待蘇醒后放回籠內飼養。

1.3 聽功能檢測

本實驗使用聽覺電生理工作站（美國TDT公司RZ6）來檢測動物的聽力功能。首先給動物注射戊巴比妥鈉進行麻醉，并將其放置在保持體溫的加熱墊上。隨后將記錄電極固定在動物顱頂處，接地電極固定在對側耳部乳突處下。外置耳聲發射器置于待測耳一側，距離外耳道約10 cm的位置。在檢測電阻抗后，使用TDT RZ6系統軟件進行聽力閾值檢測試驗。通過click/tone burst 刺激，采用20次·秒-1的頻率，掃描時間為10ms，濾波范圍為100～3 000 Hz，疊加次數為1 024次，測量的頻率依次為2 kHz、4 kHz、8 kHz、16 kHz和32 kHz。刺激聲強從90 dBSPL開始逐漸遞減，直到特征性的腦電波消失，記錄該波對應的聲音強度作為該動物的聽力閾值（長爪沙鼠為Ⅱ波）。KM+Fur組動物使用click刺激檢測聽力閾值，Neo和Oua組動物使用tone burst刺激檢測聽力閾值。聽力閾值檢測在標準隔音室內完成以保證結果的準確性。

1.4 耳蝸樣本的制備

實驗結束后，安樂死各組長爪沙鼠，然后快速取出耳蝸。在解剖顯微鏡（德國卡爾蔡司公司）下，去除殘留的肌肉和血液組織，并在蝸尖處鉆孔，注入1～2 mL的4% pH 7.4多聚甲醛。將耳蝸組織樣品放在4℃下固定過夜，隨后使用0.5 mol·L-1 PH 7.0的EDTA-Na2常溫脫鈣3～4 d后，沖洗潔凈的耳蝸組織，再經過15%、30%蔗糖中梯度脫水。將處理后的樣品用OTC膠進行包埋，使用冰凍切片機（美國 Thermo 公司）將組織切成片厚12 μm的樣本，再使用載玻片取片，置于-80℃冰箱進行保存，待檢測。此外，取部分耳蝸組織，脫鈣后，取出基底膜進行鋪片。此樣品用于免疫熒光檢測。

1.5 免疫熒光染色

取出耳蝸切片樣本，首先使用1×PBS清洗3次、15 min·次-1，然后使用10% 馬血清+0.03% 皂苷進行封閉1h。隨后加入購自Abcam公司的Myo7a和Tuj1/NF200一抗4℃ 冰箱放置過夜。次日，使用0.1% PBST清洗4次、 2 h·次-1。加入購自Invitrogen公司的山羊抗兔 Alex Fluro 488和山羊抗鼠 Alex Fluro 568二抗常溫孵育2h，隨后使用1×PBS清洗3次、15 min·次-1。最后用封片劑封片固定。

1.6 統計學分析

數據運用SPSS statistics 22及Graphpad prism軟件分析處理，采用配對樣本t檢測，分析各組數據之間的差異，P<0.05為具有顯著性差異，P<0.01為具有極顯著性差異。

2 結果

2.1 硫酸卡那霉素和呋塞米聯用（KM+Fur）對長爪沙鼠聽功能的影響

選用聽功能正常的長爪沙鼠，利用KM+Fur造模2周后，ABR聽功能檢測結果顯示，KM+Fur組聽力閾值為71.00±5.26 dB SPL，較對照組（14.00±1.80 dB SPL）顯著升高（P<0.01）（表1，圖1）。

2.2 硫酸卡那霉素和呋塞米聯用（KM+Fur）對長爪沙鼠組織形態學的影響

KM+Fur造模及其對照組的沙鼠聽功能檢測后，耳蝸組織免疫熒光結果顯示：對照組HCs形態完整，包括一層內毛細胞（inner hair cells， IHC）和三層外毛細胞（outer hair cells， OHC）；損傷組的長爪沙鼠耳蝸IHC和OHC均出現嚴重丟失，如圖2綠色方框內所示，然而SGNs則幾乎沒有受損，如圖2紅色方框內所示。說明，KM+Fur可造成長爪沙鼠耳蝸HCs嚴重受損，從而導致聽力閾值上升。

組織形態學檢測結果，各組紅色方框的局部放大圖內為SGNs（Tuj1），各組綠色方框的局部放大圖內為HCs（Myo7a）所在位置，包括一層IHC和三層OHC；白色箭頭為損傷后殘存的HCs，bar=50 μm；柱狀圖為對照組和KM+Fur組SGNs數量統計結果。圖2 硫酸卡那霉素和呋塞米聯用對長爪沙鼠組織形態學的影響

2.3 新霉素（Neo）對長爪沙鼠聽功能的影響

選取聽功能正常的長爪沙鼠，使用Neo造模2周，ABR聽功能檢測結果顯示，與對照組相比，40mmol·L-1 Neo組僅在32 kHz時聽力閾值顯著上升，為 60.00±8.66 dB SPL（P<0.05）；100mmol·L-1 Neo組聽力閾值在2 kHz、4 kHz、8 kHz、16 kHz、32 kHz時均顯著升高，依次為57.50±21.88、45.00±23.30、55.00±22.04、62.50±13.89、80.00±10.69（P<0.01）（圖3，表2）。

2.4 新霉素（Neo）對長爪沙鼠組織形態學的影響

Neo造模組及對照組的沙鼠聽功能檢測結束，耳蝸組織形態學結果顯示，與對照組相比，40mmol·L-1 Neo組耳蝸HCs、SGNs均未見明顯損傷，僅高頻區聽力閾值顯著升高。100mmol·L-1 Neo組耳蝸組織免疫熒光結果顯示，IHC和OHC均出現一定程度的損傷，圖4綠色方框所示；盡管SGNs數量沒有明顯變化，但出現明顯的固縮變性，圖4紅色方框所示。

2.5 哇巴因（Oua）對長爪沙鼠的聽功能的影響

選取聽功能正常的長爪沙鼠，利用Oua造模2周后，ABR聽功能檢測結果顯示，與對照組相比，1mmol·L-1 Oua 組在2、4、8、16、32 kHz各個頻率下聽力閾值均顯著上升，依次為37.78±8.33、27.78±9.72、44.44±8.82、58.89±18.33、84.44±7.26；10mmol·L-1 Oua 組同樣在2、4、8、16、32 kHz各個頻率下聽力閾值均顯著上升，依次為33.33±10.33、26.67±5.16、50.00±0.00、70.00±8.94、90.00±0.00，（P<0.01）；且高頻區聽力的損傷較1mmol·L-1 Oua組更為嚴重（表3，圖5）。

組織形態學檢測結果，各組紅色方框的局部放大圖內為SGNs（NF200），各組綠色方框的局部放大圖內為HCs（Myo7a）所在位置，包括一層IHC和三層OHC，bar=50 μm；柱狀圖為對照組和Neo組SGNs數量統計結果。圖4 不同濃度Neo造模對長爪沙鼠組織形態學的影響

2.6 哇巴因（Oua）對長爪沙鼠的組織形態學的影響

Oua造模組的聽功能檢測結束后，耳蝸組織免疫熒光結果顯示，1mmol·L-1 Oua組耳蝸SGNs嚴重受損，而HCs幾乎未見損傷，見圖6。

為進一步確證HCs是否無明顯損傷，取對照組和1mmol·L-1 Oua組基底膜進行免疫熒光檢測，結果顯示IHC和OHC均未見損傷，與耳蝸冰凍切片檢測結果一致（圖7）。

然而，10mmol·L-1 Oua組除SGNs出現嚴重損傷，圖6白色箭頭所指，IHC和OHC均出現一定程度的缺失，其中OHC損傷更為嚴重，如圖6中綠色方框所示。

組織形態學檢測結果，各組紅色方框的局部放大圖內為SGNs（NF200），各組綠色方框的局部放大圖內為HCs（Myo7a）所在位置，包括一層IHC和三層OHC；白色箭頭為殘存的SGNs，bar=50 μm；柱狀圖為對照組和Oua組SGNs數量統計結果。

2.7 3種耳毒性藥物建模的結果比較

從聽功能的角度觀察，3種耳毒性藥物均可以造成各頻率聽力閾值顯著升高，僅40mmol·L-1 Neo影響高頻區的聽功能。從組織形態學的角度觀察，KM+Fur 特異性損傷HCs，而SGNs無明顯損傷；1mmol·L-1 Oua特異性損傷SGNs，而HCs無明顯損傷（表4）。

3 討論

本研究選擇長爪沙鼠，建立了KM+Fur、Neo和Oua 3種作用機制各異，給藥方式不同的藥物感音神經性耳聾模型，通過聽功能檢測、耳蝸毛細胞和螺旋神經節的觀察，比較分析了各種模型各自的損傷特點，為感音神經性耳聾的研究提供了比較精準的感音神經性耳聾模型。

動物的選擇在動物模型的建立中至關重要，針對感音神經性耳聾的研究，國內外實驗動物模型主要集中大鼠、小鼠、豚鼠等嚙齒類動物［2，5-6］，而關于長爪沙鼠在耳聾模型中的研究鮮見報道。小鼠作為最常用的實驗動物，由于個體較小，在耳蝸局部給藥時，操作難度較大；豚鼠藥物造模死亡率高；長爪沙鼠對于聲音敏感度高，且聽泡較大，便于局部給藥，是耳聾研究的理想模式動物［7］。因此本研究選擇長爪沙鼠建立感音神經性耳聾模型。

用于建立耳聾模型的耳毒性藥物有很多，包括氨基糖苷類抗生素［8］、強心苷類藥物［9］、卡鉑［10］、順鉑［11］等。本研究根據作用機制和給藥方式，選擇3種常用的耳毒性藥物（KM+Fur、Neo以及Oua）造模。

硫酸卡那霉素和新霉素是氨基糖苷類抗生素，由于其永久性聽力損失的不良反應是，被廣泛應用于建立感音神經性耳聾模型。研究表明硫酸卡那霉素的耳毒性主要針對耳蝸HCs，與呋塞米聯用可以增強耳毒性［12-13］，因此本研究選擇KM+Fur，通過全身給藥的方式建立感音神經性耳聾模型。

而全身給藥的新霉素會產生很強的毒性作用［10］。故本研究是選擇新霉素通過耳蝸圓窗給藥進行造模。為更系統的比較分析不同濃度的Neo對聽功能和組織形態學的影響，本研究分別選取40mmol·L-1 Neo和100mmol·L-1 Neo 2個濃度組。

哇巴因作為一種強心苷，被廣泛用于建立耳蝸SGNs特異性損傷的動物模型［14］。為全面比較Oua對耳蝸受損程度的影響，實驗中設置2個濃度組，分別為1mmol·L-1 Oua組和10mmol·L-1 Oua組，通過耳蝸圓窗給藥進行造模。

3種模型的檢測結果，綜合比較發現：1000 mg·kg-1 KM和500 mg·kg-1 Fur聯用特異性損傷HCs，且全身給藥方式簡單無創，為開展HCs損傷型感音神經性耳聾研究的首選；40mmol·L-1 Neo僅造成高頻區的聽功能異常，卻無明顯組織形態改變，故可用于高頻區的聽功能異常的感音神經性耳聾的研究；100mmol·L-1 Neo和10mmol·L-1 Oua可以造成HCs和SGNs均受損，可用于HCs和SGNs廣泛損傷的感音神經性耳聾的研究；1mmol·L-1 Oua可以造成耳蝸SGNs特異性受損，為開展SGNs損傷型感音神經性耳聾研究的最佳選擇。

針對不同的研究可選擇合適的動物模型，為感音神經性耳聾的基礎研究和臨床應用提供精準的實驗動物模型。

參考文獻（References）

［1］ SAGI V， STANKOVIC K M. Toward personalized diagnosis and therapy for hearing loss： insights from cochlear implants［J］. Otol Neurotol， 2022， 43（8）：E903-E909.

［2］ MA L， YI H J， YUAN F Q， et al. An efficient strategy for establishing a model of sensorineural deafness in rats［J］. Neural Regen Res， 2015， 10（10）：1683-1689.

［3］ SCHMIEDT R A， OKAMURA H O， LANG H， et al. Ouabain application to the round window of the gerbil cochlea： a model of auditory neuropathy and apoptosis［J］. J Assoc Res Otolaryngol， 2002， 3（3）：223-233.

［4］ ZHANG Q， WU Y， YU Y， et al. Tetrandrine prevents neomycin-induced ototoxicity by promoting steroid biosynthesis［J］. Front Bioeng Biotechnol， 2022， 10：876237.

［5］ HUANG J， SUN X， WANG H， et al. Conditional overexpression of neuritin in supporting cells （SCs） mitigates hair cell （HC） damage and induces HC regeneration in the adult mouse cochlea after drug-induced ototoxicity［J］. Hear Res， 2022， 420：108515.

［6］ CAMPBELL K C， MARTIN S M， MEECH R P， et al. D-methionine （D-met） significantly reduces kanamycin-induced ototoxicity in pigmented guinea pigs［J］. Int J Audiol 2016， 55（5）：273-278.

［7］ GLEICH O， SEMMLER P， STRUTZ J. Behavioral auditory thresholds and loss of ribbon synapses at inner hair cells in aged gerbils［J］. Exp Gerontol， 2016， 84：61-70.

［8］ MURILLO C S， CONTRERAS J， CEDIEL R， et al. Comparison of different aminoglycoside antibiotic treatments to refine ototoxicity studies in adult mice［J］. Lab Anim 2010， 44（2）：124-131.

［9］ KURIHARA S， FUJIOKA M， HIRABAYASHI M，et al. Otic organoids containing spiral ganglion neuron-like cells derived from human-induced pluripotent stem cells as a model of drug-induced neuropathy［J］. Stem Cells Transl Med， 2022， 11（3）：282-296.

［10］ RYBAK L P. Neurochemistry of the peripheral and central auditory system after ototoxic drug exposure： implications for tinnitus［J］. Int Tinnitus J， 2005， 11（1）：23-30.

［11］ HE J， YIN S， WANG J， et al. Effectiveness of different approaches for establishing cisplatin-induced cochlear lesions in mice［J］. Acta Otolaryngol， 2009， 129（12）：1359-1367.

［12］ YAMANE H， NAKAI Y， KONISHI K. Furosemide-induced alteration of drug pathway to cochlea［J］. Acta Otolaryngol Suppl， 1988， 447：28-35.

［13］ BRUMMETT R E， BROWN R T， HIMES D L. Quantitative relationships of the ototoxic interaction of kanamycin and ethacrynic acid［J］. Arch Otolaryngol， 1979， 105（5）：240-246.

［14］ FU Y， DING D， WEI L， et al. Ouabain-induced apoptosis in cochlear hair cells and spiral ganglion neurons in vitro［J］. Biomed Res Int， 2013，73：628064.（責任編輯：編輯唐慧）