異位表達LncRNA PVT1/EIF4A1促進胃癌細胞增殖遷移的作用研究

黃景鴻 張蕾 張偉 梁偉華 蔣金芳 鄭志紅 潘澤民 李冬妹

摘要：目的 探索長鏈非編碼RNA 人漿細胞瘤轉化遷移基因1（plasmacytoma variant translocation 1，PVT1）協同真核翻譯起始因子4A1（human eukaryotic translation initiation factor4A1，EIF4A1）促進人胃癌細胞SGC-7901增殖與遷移能力的作用。方法 使用Western Blot檢測EIF4A1、real time-PCR檢測PVT1在胃癌細胞（SGC-7901、NCI-N87、MGC-803、BGC-823）和正常胃黏膜細胞（GES-1）中的表達量。單獨或共同過表達胃癌細胞SGC-7901中的PVT1和EIF4A1，EIF4A1的蛋白表達量使用免疫印跡法檢測，PVT1的表達水平使用real time-PCR檢測，采用劃痕實驗和Transwell實驗檢驗細胞的遷移能力，采用MTT實驗和平板克隆形成法檢驗細胞的增殖情況，采用免疫印跡法檢測E-cadherin，N-cadherin，smad3和TGF-β蛋白表達量。結果 以正常胃黏膜細胞作為對照，篩選有統計學差異的PVT1和EIF4A1的本底表達量低的胃癌細胞（P＜0.05）。單獨或共同過表達胃癌細胞中PVT1和EIF4A1后，共同過表達組平板克隆形成數為492±8.72，單獨過表達PVT1組平板克隆形成數為251±1.53，單獨過表達EIF4A1組平板克隆形成數為228±1.52，對照組平板克隆形成數為205±2.08。在MTT實驗中，共同過表達組OD值高于單獨過表達組和對照組。Transwell結果顯示共同過表達組遷移細胞數為308±29.10，單獨過表達PVT1組遷移細胞數為222±14.42，單獨過表達EIF4A1組遷移細胞數為206±10.58，對照組遷移細胞數為169±18.04。劃痕實驗結果提示共同過表達組傷痕愈合速率高于單獨過表達組和對照組。免疫印跡結果說明共同過表達組E-cadherin低于單獨過表達組和對照組，共同過表達組N-cadherin、smad3和TGF-β高于單獨過表達組和對照組。以上結果均具有統計學差異（P<0.05）。結論 過表達PVT1和EIF4A1可以協同促進SGC-7901細胞的增殖能力，并通過改變EMT相關蛋白的表達促進胃癌細胞SGC-7901的遷移能力。

關鍵詞：胃癌；PVT1；EIF4A1；細胞增殖；細胞遷移

中圖分類號：R34中圖分類號文獻標志碼：A文獻標識碼

Study on the effect of ectopic expression of LncRNA PVT1/EIF4A1 on the

proliferation and migration of gastric cancer cells

HUANG? Jinghong1，ZHANG? Lei2，ZHANG? Wei3，LIANG? Weihua1，JIANG? Jinfang1，

ZHENG? Zhihong1，PAN? Zemin1，LI? Dongmei1*

（1 School of Medicine/Key Laboratory of Xinjiang Ministry of Education， Shihezi University， Shihezi，Xinjiang 832002， China;

2 The First

Affiliated Hospital， School of Medicine， Shihezi University， Shihezi，Xinjiang 832002， China;

3 Emergency General Surgery Department， Shihezi People′s Hospital， Shihezi，Xinjiang 832002， China）

Abstract： Objective Explore the effect of long non-coding RNA human plasmacytoma variant translocation 1 （PVT1） and human eukaryotic translation initiation factor4A1 （EIF4A1） on the proliferation and migration of gastric cancer （GC） cell SGC-7901. Methods Used Western Blot to detect EIF4A1 and real time-PCR to detect PVT1 in GC cells （SGC-7901， NCI-N87， MGC-803， BGC-823） and normal gastric mucosal cells （GES-1）. Ectopic expressed PVT1 and EIF4A1 in GC cell SGC-7901 individually or together. Used Western Blot to detect the protein expression of EIF4A1. And used real time-PCR to detect the expression level of PVT1. Detected the migration ability of cells by the scratch test and the transwell assay. The proliferative ability of the cells was detected by the MTT and the clone formation assay. And the protein level of E-cadherin， N-cadherin， smad3 and TGF-β was detected by Western Blot. Results GC cells with low background expression of PVT1 and EIF4A1 were screened， and there was a statistical difference （P<0.05）. After ectopic expression of PVT1 and EIF4A1 individually or jointly， the number of plate clone formation in the co-ectopic expression group was 492±8.72. The number of plate colonies formed in the PVT1 ectopic expression group alone was 251±1.53. And that in the EIF4A1 ectopic expression group and control group was 228±1.52 and 205±2.08 respectively. In MTT assay， the OD value of co-ectopic expression group was higher than that of individual ectopic expression group and control group. In the transwell assay， the number of migrated cells of the co-ectopic expression group was 308±29.10， and in the PVT1 ectopic expression group， EIF4A1 ectopic expression group and control group was 222±14.42， 206±10.58， and169±18.04 respectively. Cell scratch tests showed the wound healing rate in the co-ectopic expression group was higher than that in the individual ectopic expression group and the control group. The results of Western Blot showed that E-cadherin in the ectopic expression group was lower than that in the ectopic expression group and control group. N-cadherin， smad3 and TGF-β in the ectopic expression group were higher than those in the individual ectopic expression group and control group. All of these results were statistically significant （P<0.05）. Conclusion Ectopic expression of PVT1 and EIF4A1 can promote the proliferation ability and migration ability of SGC-7901 cells by altering the expression of EMT related proteins.

Key words： gastric cancer;PVT1;EIF4A1;cell proliferation;cell migration

胃癌死亡率在世界腫瘤死亡率中排名第三［1］，我國胃癌死亡率占世界40%［2］，很多患者就診時已經發展到中晚期，造成患者死亡的重要原因是癌細胞轉移［3］。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一種調節性RNA，在組織中PVT1表達具有特異性。lncRNA 影響細胞分化、運動等生命過程，其機制涉及與蛋白質的相互作用［4］，可以是指引核糖核蛋白體定位；結合并激活目標蛋白質；也可以和蛋白質互為分子支架協同發揮作用［5］，由于lncRNA影響多基因表達，腫瘤發生發展又是多基因變異的復雜過程，因此對lncRNA和其關鍵分子的干預將起到網絡式調節作用，在腫瘤靶向治療中可能具有更加明顯的效果，是比較理想的候選靶點，近年來已被廣泛關注。

LncRNA 人漿細胞瘤轉化遷移基因 1（plasmacytoma variant translocation 1，PVT1）在人類染色體8q24上［6］，位于癌基因MYC上游的癌相關區域。PVT1在多種腫瘤中異常過表達，是近年來LncRNA相關研究的熱點。PVT1可以直接調節RNA、DNA和蛋白質的表達［7］。PVT1在一些腫瘤中高表達能抑制腫瘤細胞的凋亡過程［8］。同時，PVT1可被EIF4A3穩定，從而促進肺癌的增殖與遷移侵襲能力［9］。此外，PVT1還起到了調控下游基因和途徑的作用。例如在肺癌中，PVT1可將EZH2募集到LAST2啟動子區域并抑制非小細胞肺癌患者LAST2的表達［10］，PVT1也可通過與miR-128內源性競爭來調節血管內皮生長因子C的表達，從而促進肺癌細胞的增殖和轉移行為［11］。與之類似的是：在胃癌細胞中，PVT1通過招募EZH2和STAT3來調節P15/P16和VEGFA的表達［12］。課題組在前期研究中發現，PVT1與胃癌的轉移侵襲相關。真核翻譯起始因子4A1（human eukaryotic translation initiation factor4A1，EIF4A1）可能被PVT1 招募結合并可能造成其下游的蛋白質的翻譯失控［13-14］。

EIF4A1是RNA 解旋酶［15］，可通過調控mRNA 5′端非翻譯區參與翻譯的起始階段［16］。研究證明，翻譯失調是腫瘤發生和發展中直接控制癌癥基因選擇性翻譯和蛋白質合成的重要步驟［17］，EIF4F翻譯起始復合體在PI3K/Akt/mTOR信號通路、絲裂原活化蛋白激酶信號轉導通路和依賴半胱天冬酶的細胞凋亡通路的調控下，作為翻譯起始的關鍵節點，控制著許多癌基因的mRNA的翻譯起始階段［18］。EIF4A1作為EIF4F的重要組成部分，在胃癌的發生和發展過程和胃癌上皮間充質轉化過程中發揮著重要作用，已證實在增殖活躍的細胞中，EIF4A1 的表達水平高［19］，并且也觀察到EIF4A1 與腫瘤的遷移侵襲有關［20］，最近的研究表明EIF4A1在胃癌、結直腸癌、宮頸癌、乳腺癌和黑色素瘤等癌癥中的表達呈現異常情況［21］。依賴于ATP的RNA解旋酶EIF4A1活性較低，其解旋酶功能很大程度上依賴于其結合伴侶的刺激，而單鏈RNA 的結合能夠在很大程度上刺激EIF4A1的活性［22］。在本課題組前期研究中發現，EIF4A1和PVT1 在胃癌中表達水平上調且能相互作用，并與胃癌的進展相關［23］。但PVT1與EIF4A1通過何種機制參與胃癌發生發展，是今后研究的重要方向。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

PVT1引物（F：5-TGAGAACTGTCCTTACGTGACC-3;R：5- AGAGCACCAAGAC TGGCTCT-3），N-cadherin抗體（Proteintech），E-cadherin抗體（Affinity），Smad3抗體（Affinity），TGF-β抗體（Affinity），EIF4A1抗體（Bioss），Lipofectamine 3000（Invitrogen）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養

胃癌細胞系SGC-7901、NCI-N87、MGC-803、BGC-823和GES-1在37℃下，5%二氧化碳濃度的培養箱中，在添加90% DMEM培養液和10%胎牛血清的培養基中培養。

1.2.2 實時熒光定量PCR反應（real-time PCR）

提取細胞中的總RNA，低溫、無酶的提取環境。RNA根據逆轉錄檢測試劑盒逆轉錄為cDNA后，再按反應體系進行加樣，反應體系來源于real-time PCR試劑盒。RT-PCR反應程序設定為：程序循環40次，預熱90 ℃反應時間 5 min，95 ℃反應時間為15 s、55℃反應時間為25 s、72 ℃反應時間為10 s。計算RNA的相對表達量的方法為2-△△Ct（Fold-change）。

1.2.3 蛋白質免疫印跡（Western Blot）

提取細胞中的總蛋白，按照蛋白液體量的1/3加入4×loading buffer?；靹蚝笤?00℃下金屬浴10min。制備SDS-PAGE凝膠，電壓80V電泳30min后設定電泳電壓為110V，繼續電泳1h。電轉電壓設定為110V，電轉時間為60min。配制濃度為5%的脫脂奶粉常溫封閉2h。一抗（1∶500）孵育12h，溫度設定為4℃。3次TBST清洗（10min·次-1）。室溫下二抗孵育2h，3次TBST清洗（10min·次-1），化學發光儀下，用ECL超敏發光液曝光。

1.2.4 轉染質粒

采用pcDNA3.1載體于上海吉瑪公司構建合成人PVT1和EIF4A1過表達質粒，即pcDNA3- PVT1過表達質粒和pcDNA3- EIF4A1過表達質粒，經測序正確后使用。轉染過程為將6孔板提前一天接種胃癌細胞SGC-7901，待細胞密度達到70%～90%且均勻貼壁。

準備無菌EP管兩支，減血清的DMEM培養基100μL加入兩EP管中，一支加入6μlLipo3000；另一只加入2μg質粒與4 μLP3000 。兩者靜置10min后混合，輕輕混勻，靜置15 min。將此混合液加入提前添加0.8mL減血清 DMEM培養基的六孔板中，轉染48h后，更換普通培養基終止轉染。

1.2.5 MTT 實驗

在96孔板中每組設置5個復孔，每孔接種2 000個已轉染細胞，常規培養5 d。0h為第一次加入MTT試劑的時間，每24h將20μL MTT 試劑加入孔內，孵育 4 h在37℃下，停止培養，使得MTT與細胞生長所產生的琥珀酸脫氫酶充分反應?？字械囊后w吸棄，二甲基亞砜（DMSO）150 μL加入每孔，OD值在490nm下測定。

1.2.6 平板克隆形成實驗

在6孔板中每孔接種1 000個已轉染細胞后正常培養，每48h棄去舊培養基，添加新的培養基。培養細胞克隆生長14 d后，棄去孔內培養基終止培養。清洗細胞1次，固定液固定 30 min，染色液染色30 min，蒸餾水清洗、待干后鏡下觀察，計數細胞數超過50個的集落。

1.2.7 Transwell遷移實驗

用PBS清洗已轉染細胞，遷移小室中加入2×104個已轉染細胞，添加純DMEM培養基將小室內細胞濃度調整為2×104個/200μL。600μL完全培養基添加至24孔板下室。24h后，清洗遷移小室，固定液30min固定，染色液30 min染色，雙蒸水漂洗去除染液，晾干，鏡下觀察，計數。

1.2.8 劃痕實驗

于6孔板轉染24h后的細胞，用1 000μL槍頭劃三道均勻分布的豎線，PBS清洗去除孔內脫落的細胞，常規培養，以劃痕時間為0h，每24h在相同位置顯微鏡下拍照，軟件計算愈合面積。

1.2.9 統計學處理

使用 SPSS 25.0 統計學軟件，四組（單獨過表達PVT1、單獨過表達EIF4A1、共同過表達PVT1和EIF4A1、NC）實驗結果、real-time PCR的RNA相對表達量、Western Blot的蛋白掃描灰度值、平板克隆實驗的細胞克隆計數結果、MTT實驗的OD值、傷痕愈合實驗的愈合面積、Transwell遷移實驗的穿膜細胞數，均采用t檢驗比較，P值<0.05 具有統計學意義。

2 結果

2.1 胃癌細胞及正常胃黏膜細胞中PVT1及EIF4A1的表達情況

Real-time PCR和Western blot分別檢測SGC-7901、NCI-N87、MGC-803、BGC-823 4種胃癌細胞及正常胃黏膜細胞中PVT1和EIF4A1的表達量。結果顯示：SGC-7901中PVT1的表達量顯著低于GES-1細胞，而SGC-7901的EIF4A1表達量也顯著低于其他3種胃癌細胞（P＜0.05）（圖1）。因此，選擇SGC-7901開展后續實驗研究。

2.2 檢測單獨或共同過表達PVT1和EIF4A1后的過表達效率

在SGC-7901胃癌細胞中單獨或共同過表達PVT1和EIF4A1，轉染成功后采用real-time PCR和Western blot分別檢測PVT1和EIF4A1的表達量。結果顯示：單獨過表達PVT1組的PVT1在RNA水平上顯著高于NC組（P<0.05）（圖2A），單獨過表達EIF4A1組的EIF4A1在蛋白水平上顯著高于NC組（P<0.05）（圖2B，圖2C）。

共同過表達PVT1和EIF4A1組的PVT1在RNA水平上顯著高于單獨過表達PVT1組（P<0.05）（圖2A），共同過表達PVT1和EIF4A1組的EIF4A1在蛋白水平上顯著高于單獨過表達EIF4A1組（P<0.05）（圖2B，圖2C）。

2.3 單獨或共同過表達PVT1和EIF4A1對細胞增殖能力的影響

采用MTT法測定NC組、單獨過表達PVT1組、單獨過表達EIF4A1組和共同過表達PVT1和EIF4A1組的細胞活力，檢測細胞增殖能力通過平板克隆實驗。MTT實驗結果：共同過表達組OD值高于單獨過表達組和對照組（圖3A），平板克隆實驗結果：共同過表達組平板克隆形成數為492±8.72，單獨過表達PVT1組平板克隆形成數為251±1.53，單獨過表達EIF4A1組平板克隆形成數為228±1.52，對照組平板克隆形成數為205±2.08（圖3B，圖3C），以上差異均具有統計學意義（P<0.05）。

2.4 單獨或共同過表達PVT1和EIF4A1對細胞遷移能力的影響

用劃痕實驗和Transwell遷移實驗檢測單獨或共同過表達PVT1和EIF4A1后SGC-7901細胞的

遷移能力，Transwell遷移實驗結果：共同過表達組穿膜細胞數為308±29.10，單獨過表達PVT1組遷移? 細胞數為222±14.42，單獨過表達EIF4A1組的遷移細胞數為206±10.58，對照組遷移細胞數為169±18.04（圖4A，圖4B）。傷痕愈合實驗結果顯示：共同過表達組傷痕愈合速率高于單獨過表達組和對照組（圖4C，圖4D）。以上結果均具有統計學意義（P<0.05）。

A：Transwell遷移實驗結果; B：Transwell遷移實驗量化結果; C：劃痕實驗結果; D：劃痕實驗量化結果注：本圖中共同過表達組與單獨過表達組進行對比，單獨過表達組與對照組進行對比，*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001，****：P<0.000 1。圖4 細胞遷移能力檢測

2.5 單獨或共同過表達PVT1和EIF4A1后E-cadherin，N-cadherin，smad3和TGF-β蛋白表達水平

用Western Blot檢測單獨或共同過表達PVT1和EIF4A1后E-cadherin，N-cadherin，smad3和TGF-β蛋白表達水平，結果顯示：共同過表達組E-cadherin的表達量低于單獨過表達組和對照組，共同過表達組N-cadherin、smad3和TGF-β的表達量高于單獨過表達組和對照組。以上結果均具有統計學意義（P<0.05）（圖5）。

3 討論

根據最新的癌癥統計數據，癌癥死亡率近年來持續下降，但它仍然是全球第二大死亡原因［24］，基因水平的變化包括基因突變、擴增、缺失、DNA甲基化和插入突變。腫瘤發生的重要因素是抑癌基因失活和癌基因異常激活［25］?？偦蚪M中，非編碼基因占的比例約為98%，這些基因負責絕大多數腫瘤的發生［7］。LncRNA可以同時與同一空間中的多個因子結合，整合抑制效應元件和活性效應元件的信息而發揮作用。LncRNA可以充當誘餌，直接與蛋白質、信使RNAs和miRNAs結合，大量證據表明，LncRNA的誘餌功能在腫瘤的發生、發展和轉移中起著不可替代的作用［26］。

在本研究中發現，LncRNA PVT1 很有可能是胃癌中刺激激活EIF4A1的RNA伴侶，激活的EIF4A1促進下游轉移相關蛋白的表達，從而從多基因表達變異的角度促進癌細胞的遷移侵襲。我們通過在低表達PVT1和EIF4A1的胃癌細胞中單獨或共同過表達PVT1和EIF4A1的表達情況，發現單獨過表達PVT1或EIF4A1的胃癌細胞相較于未過表達的胃癌細胞，明顯提升了細胞的遷移和增殖能力，Western blot結果顯示：N-cadherin、TGF-β和 smad3蛋白表達升高，E-cadherin蛋白降低。說明單獨過表達PVT1或EIF4A1能夠促進胃癌細胞增殖與遷移。而共同過表達PVT1和EIF4A1后，結果顯示共同過表達組相較于單獨過表達組能夠進一步提升胃癌細胞的增殖與遷移的功能，Western blot結果也顯示：相較于單獨過表達PVT1或EIF4A1，N-cadherin、TGF-β和smad3蛋白表達進一步升高，E-cadherin蛋白進一步降低，說明PVT1和EIF4A1能夠協同更進一步促進胃癌細胞的增殖與遷移作用。這可能是因為兩個因子能夠調控共同的下游基因或蛋白，前文中已經提到PVT1常通過與c-Myc相互作用促進癌癥的發展。Ren等［13］發現，PVT1的表達與c-Myc有關，并且它們具有相同的表達趨勢。在敲低PVT1的胃癌細胞中，c-Myc的表達也下調。而c-Myc在胃癌的發生發展中是一個重要的分子。Zhao等［27］發現，在胰腺癌中，c-Myc基因表達的調控高度依賴于EIF4A1。EIF4A1缺失可顯著降低c-Myc和EMT標記物的表達水平。過表達的EIF4A1通過c-Myc/miR-9軸促進EMT相關蛋白N-cadherin蛋白表達上升，E-cadherin蛋白表達下降。此外，EIF4A1或c-Myc的缺失顯著降低了EMT的水平和體內外的轉移，反之亦然。c-Myc可能是為癌細胞提供成功轉移所需的必要特征的因素之一，廣泛參與EMT過程。Cowling和他的同事進行的實驗表明，c-Myc可以直接下調乳腺癌細胞株中的E-cadherin，E-cadherin的下調是EMT的主要指標［28］ 。

骨橋蛋白（Osteopontin，OPN）是一種受MYC正向調節的細胞因子和整合素結合配體，有研究表明，在乳腺癌中，OPN通過誘導EMT促進轉錄因子的表達而促進癌細胞脫離和血管內侵入，這些轉錄因子包括Twist、Snail、Slug和MMPs［29］。MMP2被報道能夠裂解潛伏期相關的TGF-β，釋放活性的TGF-β。MMP2在小窩蛋白缺失的小鼠中過度表達，這導致與TGF-β激活相關的侵襲性乳腺腫瘤表型增加［30］。本研究結果顯示，TGF-β在單獨過表達PVT1或EIF4A1的表達量高于NC組，共同過表達PVT1和EIF4A1的TGF-β表達量顯著高于單獨過表達組。說明PVT1和EIF4A1能夠單獨或協同促進TGF-β的表達。據此我們推測PVT1和EIF4A1能夠共同促進c-Myc的表達，進而促進MMP2的表達，最終影響TGF-β使其表達增加。

Smads是一組將細胞外信號直接傳遞到細胞核的蛋白質。smad3主要介導TGF-β亞家族成員的信號轉導，共同調節因子Smad4是TGF-β和骨形態發生蛋白信號通路的中樞調節因子。smad3已經被證明在許多類型的癌癥過度增加，并可能在腫瘤的發生發展中中起致癌作用。例如，Yamazaki等［31］證明smad3可以促進胰腺癌細胞的侵襲和遷移。TGF-α/smad3信號的激活可以誘導宮頸癌細胞系的遷移和侵襲，提示smad3在宮頸癌轉移中起重要作用。PVT1能夠降低miR-140-5p的表達，而smad3可能是miR-140-5p的下游靶點，因此我們認為PVT1能夠通過降低miR-140-5p的表達而促進smad3的表達情況。而EIF4A1調控smad3的機制目前尚未明確，今后仍需繼續探索。

綜上，本研究發現單獨或共同過表達PVT1和EIF4A1能夠促進胃癌細胞的增殖與遷移能力，說明了PVT1和EIF4A1有很大的潛力共同作為胃癌的治療靶點。這與前人的觀點不謀而合［34］。而根據本實驗結果，我們推測：在胃癌細胞中，PVT1和EIF4A1互作后通過共同影響下游因子c-Myc，促進轉錄因子MMP2的表達，進而增強TGF-β/smads信號通路中相關蛋白的表達。同時，PVT1也可通過miR-140-5p直接影響TGF-β/smads信號通路中smad3的表達。以上機制進而導致EMT的發生以及EMT相關蛋白如N-cadherin的表達，同時降低上皮細胞相關蛋白E-cadherin的表達，增強胃癌細胞增殖與遷移的能力。然而PVT1和EIF4A1是否會通過以上機制持續影響EMT進程，亦或受到其他哪些分子或因子影響表達，仍是今后需要探索的方向。

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（責任編輯：編輯唐慧）