基于生物信息學篩選與鐵死亡有關的非小細胞肺癌EGFR-TKIs耐藥DEGs*

馮 英,鄭 瑤,仇成鳳,4,譚力銘△

1.徐州醫科大學藥學院,江蘇徐州 221000;2.懷化市第二人民醫院腫瘤防治懷化市重點實驗室,湖南懷化 418000;3.吉首大學生物資源與環境科學學院,湖南吉首 416000;4.湖南醫藥學院總醫院循證醫學與臨床研究中心,湖南懷化 418000

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤,從癌細胞形態及病理角度將肺癌分為小細胞肺癌(SCLC)和非小細胞肺癌(NSCLC),其中NSCLC占80%～85%[1]。表皮生長因子受體(EGFR)是NSCLC中最常見的驅動基因之一。酪氨酸激酶抑制劑(TKIs)是治療攜帶EGFR突變的局部晚期或轉移性NSCLC患者的標準一線療法[2]。本研究使用的GSE117846數據集主要聚焦第一代EGFR-TKIs。第一代EGFR-TKIs包括厄洛替尼和吉非替尼等,大多數EGFR突變的NSCLC患者在接受第一代EGFR-TKIs治療9～13月后出現獲得性耐藥與疾病進展[3]。有研究表明,EGFR-TKIs耐藥機制主要包括原發性耐藥和獲得性耐藥,獲得性耐藥機制主要包括EGFR T790M突變、間質表皮轉化因子(MET)擴增、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)突變等,其中EGFR T790M突變約占第一代EGFR-TKIs獲得性耐藥機制的50%～60%[4]。EGFR-TKIs獲得性耐藥是一個復雜的過程,目前其確切分子機制尚不清楚。鐵死亡是一種鐵依賴非凋亡性細胞死亡,本質上是膜脂質修復酶活性衰竭、細胞內脂質過氧化物代謝紊亂、鐵依賴的脂質活性氧自由基積累導致的細胞死亡,與細胞凋亡、壞死、自噬在形態學、遺傳學和生化特性上有明顯區別,同時與癌癥的發生、發展密切相關[5]。KUKULJ等[6]研究發現鐵蛋白在NSCLC患者組織中普遍高表達,與腫瘤患者不良預后有關。相關研究表明,鐵死亡還參與某些癌癥耐藥性的發生和逆轉[7-8],調節鐵死亡可以影響抗癌藥物的療效[9]。本研究通過生物信息學分析篩選出與EGFR-TKIs耐藥相關的鐵死亡基因,旨在尋找NSCLC潛在的干預靶點及生物標志物,為NSCLC EGFR-TKIs耐藥基因表達綜合數據庫患者的治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1數據來源 在基因表達綜合數據庫(GEO)(https://www.ncbi.nlm.Nih.Gov/geo/)中下載基因表達譜數據集GSE117846。該數據集是在對耐藥細胞進行不同處理后,獲取的耐藥細胞RNA-seq基因表達譜,技術平臺為GPL21290:Illumina HiSeq 3000(Homo sapiens)。通過FerrDb數據庫(http://www.zhounan.org/ferrdb)獲取鐵死亡相關基因,包括驅動基因(370個)、抑制基因(349個)及標記基因(12個),去除非人類基因和重復基因,最后得到382個基因。NSCLC患者的腫瘤組織與正常組織的基因表達數據均來自TCGA公共數據集(https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/str-uctural-genomics/tcga),包括肺鱗癌(LUSC)患者腫瘤組織數據503例及正常組織數據52例、肺腺癌(LUAD)患者腫瘤組織數據515例及正常組織數據59例。

1.2方法

1.2.1DEGs篩選 通過GEO自帶的基因差異分析工具(GEO2R)分析GSE117846數據集中的DEGs,以P<0.05且|log2FC|≥1為篩選條件,FC表示變化倍數。利用在線工具jvenn(https://www.bioinformatics.com.cn)將從GSE117846數據集篩選出的DEGs及從FerrDb數據庫獲取的鐵死亡相關基因構建Venn圖,得到與鐵死亡相關的NSCLC EGFR-TKIs耐藥DEGs。

1.2.2DEGs的功能和通路分析 使用在線工具DAVID 2021(https:// david.ncifcrf.Gov/)進行DEGs的功能和通路分析,導入并查看DEGs的基因本體論(GO)功能和京都基因與基因組百科全書(KEGG)信號通路富集分析結果。

1.2.3蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)網絡的構建 將交集基因導入STRING 11.5 (https://string-db.org/)數據庫分析PPI,并利用CytoScape3.9.1中cytoHubba插件的最大鄰域分量(MNC)、最大團中心性(MCC)、邊緣滲透分量(EPC)和最大鄰域分量的密度(DMNC)4種算法篩選出交集基因中的關鍵基因(Hub基因)。

1.2.4表達差異和生存分析 利用ULCAN數據庫對Hub基因在NSCLC腫瘤組織和正常組織中的表達水平進行差異分析。同時,利用GEPIA2數據庫比較Hub基因表達水平在NSCLC不同分期間的差異,并繪制不同Hub基因表達水平NSCLC患者的生存曲線(以Hub基因的中位表達水平作為判斷表達水平高低的臨界值,以累積生存率作為統計指標。

1.2.5NSCLC組織來源和實時熒光定量PCR(qPCR)檢測 5對NSCLC組織及癌旁組織取自2021年懷化市第二人民醫院經病理學檢查確診的NSCLC患者手術切除組織。所有標本置于-80 ℃冷藏保存。本研究得到了懷化市第二人民醫院倫理審查委員會的批準。使用TRI試劑(Sigma公司)分別從組織樣品中提取總RNA,用Maxima H Minus第一鏈cDNA合成試劑盒(Thermo Fisher Scientific公司)合成cDNA,最終反應體積為20 μL。根據試劑盒說明,進行qPCR檢測。腫瘤蛋白P63(TP63)和內參基因GAPDH的引物序列均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。qPCR擴增條件為50 ℃ 2 min,95 ℃ 2 min,95 ℃ 15 s、55 ℃ 15 s、72 ℃ 1 min共40次循環,實驗重復3次。TP63的相對表達水平用2-ΔΔCt法進行計算。引物序列見表1。

表1 qPCR檢測的引物序列

1.2.6體外細胞實驗 將人肺癌細胞PC-9和對吉非替尼耐藥的PC-9/GR細胞用于體外細胞實驗,實驗分組處理情況如下。PC-9組:作為對照,PC-9細胞培養基中加入DMSO;PC-9+吉非替尼組:PC-9細胞培養基中加入終濃度為1 μmol/L的吉非替尼處理24 h;PC-9/GR組:PC-9/GR細胞培養基中加入終濃度為1 μmol/L的吉非替尼處理48 h。細胞分組處理完成后,去除細胞培養基,用PBS洗2遍。參考1.2.5中的方法檢測細胞中TP63的相對表達水平,實驗重復3次。

2 結 果

2.1NSCLC EGFR-TKIs耐藥的DEGs篩選 對GSE117846數據集中的6例樣本表達數據進行差異分析,篩選符合P<0.05且|log2FC|≥1 的DEGs,最終得到3 716個差異基因,其中有1 744個上調基因和1 972個下調基因,見圖1。

注:A為EGFR-TKIs耐藥DEGs火山圖,藍色圓點代表表達下調的DEGs,粉色圓點代表表達上調的DEGs,灰色圓點代表表達無明顯差異的基因;B為EGFR-TKIs耐藥DEGs熱圖,對照組加入DMSO,實驗組加入吉非替尼,紅色表示上調,藍色表示下調,ctrl.1～3表示對照組1～3號樣本,gefi.1～3表示實驗組1～3號樣本。

2.2篩選與NSCLC EGFR-TKIs耐藥及鐵死亡相關的DEGs 通過FerrDb數據庫獲得鐵死亡相關的基因共382個,與GSE117846數據集篩選所得的耐藥相關的DEGs取交集,得到60個與鐵死亡相關的NSCLC EGFR-TKIs耐藥DEGs,包括30個下調基因和30個上調基因。見圖2。

圖2 NSCLC EGFR-TKIs耐藥相關基因與鐵死亡相關基因交集圖

2.3GO功能和KEGG通路富集分析 對60個交集基因進行GO功能和KEGG通路富集分析,以P<0.05為差異有統計學意義,結果顯示與鐵死亡相關的NSCLC EGFR-TKIs耐藥DEGs主要富集的生物過程(BP)包括蛋白質ADP-核糖基化、p53類介質對DNA損傷的內在凋亡信號通路、細胞對氧化應激的反應等,主要富集的細胞成分(CC)為細胞質基質、細胞核、核小體、線粒體、細胞質等,主要富集的分子功能(MF)為蛋白ADP-核糖轉移酶活性、NAD+ADP-核糖基轉移酶活性和核苷酸轉移酶活性等。GO功能富集分析主要顯示了BP、CC和MF中10種富集最明顯的途徑(根據調整后的P值排名),見圖3A。KEGG通路富集分析顯示,與鐵死亡相關的NSCLC EGFR-TKIs耐藥DEGs主要參與鐵死亡、P53信號通路、FoxO信號通路等,同時也在肝細胞癌及癌癥中微小核糖核酸(miRNA)的相關調控中發揮作用,見圖3B。

注:A為GO功能分析;B為KEGG通路富集分析。

2.4PPI網絡構建 利用STRING數據庫構建與鐵死亡相關的NSCLC EGFR-TKIs耐藥DEGs的PPI網絡,選擇綜合得分≥0.4的基因進行PPI構建。隱藏沒有相互作用的節點,最終得到共有57個節點和99條邊的PPI網絡,平均局部聚類系數0.377,PPI富集P<0.01,見圖4A。將STRING結果導入Cytoscape軟件,通過cytoHubba插件中的“MNC”“MCC”“EPC”和“DMNC”4種算法計算評分位于前10的基因,再利用jvenn篩選交集得到TP63基因,見圖4B。

注:A為交集基因的PPI網絡分析;B為Hub基因的篩選。

2.5Hub基因TP63的表達分析 ULCAN數據庫分析顯示,在LUAD組織中TP63表達水平明顯低于正常組織(P<0.01),見圖5A;在LUSC組織中TP63表達水平明顯高于正常組織(P<0.01),見圖5B。組織qPCR檢測顯示,與癌旁組織相比,TP63 mRNA在LUAD中低表達,在LUSC中高表達,差異均有統計學意義(P<0.05),與ULCAN數據庫分析得到的結果一致,見圖5C。GEPIA2數據庫分析顯示,TP63表達水平在不同分期NSCLC間比較,差異有統計學意義(F=5.04,P<0.01),見圖5D。

注:TPM表示每百萬個轉錄片段;A、B分別為TP63基因在NSCLC、LUAD、LUSC組織和癌旁組織中的表達水平,紅色為LUAD或LUSC組織,藍色為癌旁組織;C為TP63在不同NSCLC組織中的相對表達水平,與癌旁組織比較,**P<0.01,*P<0.5;D為TP63在NSCLC不同分期中的表達情況。

2.6不同TP63表達水平NSCLC患者的生存分析 GEPIA2數據庫分析顯示,TP63高表達組(235例)、低表達組(239例)LUAD患者生存預后比較,差異無統計學意義(P>0.05),見圖6A;TP63低表達組(241例)的LUSC患者生存預后較高表達組(241例)差,Log-rankχ2檢驗P<0.05,見圖6B。

注:A為TP63高/低表達的LUAD患者的生存曲線;B為TP63高/低表達的LUSC患者的生存曲線。

2.7體外細胞實驗 PC-9組TP63 mRNA相對表達水平(1.01±0.01)高于PC-9/GR組(0.05±0.01)和PC-9+吉非替尼組(0.16±0.05),差異均有統計學意義(P<0.001),與GSE117846數據庫分析的結果具有一致性。見圖7。

注:與PC-9組比較,***P<0.001;ns.表示兩組間比較差異無統計學意義。

3 討 論

目前,EGFR-TKIs是治療攜帶EGFR突變的局部晚期或轉移性NSCLC患者的標準一線療法[2]。然而,大多數EGFR突變的NSCLC患者在接受第一代EGFR-TKIs治療9～13個月后,會出現獲得性耐藥,促進疾病進展[3]。有研究表明,鐵死亡參與NSCLC EGFR-TKIs耐藥[10-11],但鐵死亡在EGFR-TKIs耐藥中的具體機制尚不清楚,靶向鐵死亡或許能為NSCLC EGFR-TKIs耐藥干預提供新的思路。因此,本研究主要通過生物信息學分析挖掘NSCLC EGFR-TKIs耐藥有關DEGs中與鐵死亡相關的潛在靶基因,為EGFR-TKIs獲得性耐藥的干預提供新的思路。

本研究從NSCLC EGFR-TKI耐藥數據集GSE117846和FerrDb數據庫中篩選得到TP63,而且在體外細胞實驗中發現TP63 mRNA 表達在PC9/GR細胞中下調,與生物信息學分析結果一致。初步推斷TP63為NSCLC EGFR-TKIs耐藥相關DEGs中與鐵死亡相關的基因,但TP63在NSCLC EGFR-TKIs耐藥與鐵死亡中的作用需要進一步進行細胞功能實驗確定。TP63是P53轉錄因子家族的成員,其結構與序列與P53高度同源[12]。TP63因為啟動子的不同和3’端剪切方式的不同,可選擇性剪接產生具有不同活性的亞型,根據TP63 N端轉錄來源的不同,可分為兩種類型:較長TA異構體和較短DN異構體(DNp63和TAp63)。有研究表明,TP63在腫瘤中的作用比較復雜,主要是由于TP63的兩種異構體TAp63和ΔNp63亞型在癌癥中起相反的作用[13]。相關研究發現,TP63在食管鱗癌、膀胱癌、宮頸癌、頭頸部鱗狀細胞癌等癌癥中發揮抑癌或促癌作用[14-15]。TIOFACK等[16]研究表明,TP63基因多態性可增加乳腺癌發生的風險。TP63與上皮惡性腫瘤高度相關,尤其是鱗狀細胞癌[12,17]。同時,有研究表明,ΔNp63的異常表達與藥物的耐藥性有關,ΔNp63的異常表達會影響食道鱗狀細胞癌、乳腺癌等的化療效果[18-20]。此外,GALOZZOVA等[12]發現EGFR信號通路可能具有調控ΔNp63激活和表達的作用。目前,TP63在NSCLC EGFR-TKIs耐藥領域的研究較少,大部分是吉非替尼與TP63相關性的研究[21-22],而且吉非替尼耐藥與TP63表達之間相關性的研究結果不完全相同。楊穎等[23]的研究報道,TP63可能與PC9細胞耐藥有關,而且在PC9/GR細胞中高表達并發揮ΔNp63的促癌特性。本研究結果顯示,TP63的表達與PC9細胞耐藥有關,但TP63在PC9/GR細胞中mRNA表達下調。造成研究結果沖突的原因可能與TP63的多種亞型結構相關,具體機制需要進一步探究。

鐵在決定細胞命運的內穩態調節和疾病中起著重要作用,當鐵代謝失調時,會增加患者患癌的風險[24]。相關研究表明,EGFR可以通過鐵蛋白的再分配破壞鐵的穩態,促進肺癌的發展[25]。本研究中與鐵死亡相關的NSCLC EGFR-TKIs耐藥的GO功能和KEGG通路富集多在氧化應激反應、P53類介質對DNA損傷的內在凋亡信號通路、鐵死亡和肝細胞癌等方面。已有研究表明,ΔNp63α可通過調節谷胱甘肽的合成、利用和再生,增加細胞對氧化應激和鐵死亡的抵抗力[26]。同時,WANG[26]等證明了ΔNp63α過表達可保護細胞免受氧化劑、DNA損傷、失巢凋亡或鐵死亡誘導劑誘導的氧化應激損傷。WANG等[18]研究發現,在耐鉑卵巢癌細胞中卷曲類受體7(FZD7)的過表達可以激活致癌因子TP63,驅動谷胱甘肽代謝途徑的上調,保護細胞免受化療誘導的氧化應激,促進卵巢癌發展。GUO等[27]研究發現,在胃癌中下調FZD7可進一步抑制由TP63表達下調介導的GPX4誘導的鐵死亡。以上研究顯示,TP63可能是連接氧化應激-鐵死亡的主要基因,其可能影響NSCLC的發生、發展以及第一代EGFR-TKIs療效。但TP63的相關功能與分子機制仍需要大量基礎實驗進行研究和驗證。

綜上所述,本研究基于生物信息學分析篩選得到與鐵死亡相關的NSCLC EGFR-TKIs耐藥DEG基因為TP63,并且對這一結果進行了初步的實驗驗證,發現TP63對NSCLC的預后評估具有一定的價值,可作為EGFR-TKIs耐藥相關鐵死亡的治療靶點和LUSC預后生物標志物。然而,本研究仍存在一些局限性:一方面,GSE117846數據集中的EGFR-TKIs耐藥病例和人體組織樣本較少,本研究篩選的Hub基因還需在后續研究中通過擴大樣本量進一步驗證。另一方面,本研究僅篩選到TP63基因,并富集了一些可能的信號通路。但TP63具有多種亞型結構,本研究推測TP63參與了NSCLC中與EGFR-TKIs耐藥相關的鐵死亡,其具體的分子機制和信號通路尚不清楚,有待后續研究中進一步探索。