Fe( Ⅲ)對Anammox 污泥脫氮效能長短期影響

郭佳文,林 興,李 祥,2,3*,黃 勇,2,劉天琪,趙魏東(.蘇州科技大學環境科學與工程學院,江蘇 蘇州 25009；2.蘇州科技大學,江蘇水處理技術與材料協同創新中心,江蘇 蘇州 25009；3.蘇州天竣環境科技有限公司,江蘇 蘇州 25009)

厭氧氨氧化(Anammox)與傳統生物脫氮相比,可減少64%的溶解氧需求,節省100%的有機碳源,降低 80%～90%的污泥量,并具有較高的脫氮效能[1-2].目前, Anammox 已經從實驗室小試階段走向工程應用階段[3].然而, Anammox 菌倍增時間長,對環境因子比較敏感(溫度,溶解氧,pH 值等)限制著其大規模的工業運用[4].

鐵是微生物生長的必需元素,幾乎參與了所有重要的新陳代謝,微生物細胞體內的呼吸作用,氧化還原反應和脫氧核糖核酸(DNA)前體的合成,是微生物生長的限制因子之一[5]. Anammox 菌在新陳代謝的過程中需要大量含酶的血紅素(超過細胞總蛋白質的20%),在合成血紅蛋白的同時需要大量吸收并存儲鐵[6],鐵的存在可促使Anammox 反應器的脫氮能力提高[7-8].Fe( Ⅱ)相比于 Fe( Ⅲ)更利于微生物的吸收利用,因此許多研究鐵在Anammox 體系中作用時均投加Fe( Ⅱ)[9].然而在模擬廢水配置的過程中,Fe( Ⅱ)極易被氧化(E0[Fe2+/Fe3+]高達+0.77V).甚至投加Fe3O4和具有更強還原性的零價鐵時,體系中的鐵都主要以Fe( Ⅲ)形式存在[10-11].因此,在模擬廢水的配置過程中投加Fe( Ⅱ)基本被氧化為Fe( Ⅲ).然而,有關Fe( Ⅱ)對Anammox 菌活性影響的研究報道中都沒有強調如何保證體系中 Fe( Ⅱ)不被氧化.所投加的Fe( Ⅱ)極可能被氧化為Fe( Ⅲ),反應器內鐵價態及濃度變化對Anammox 微生物活性影響還需進一步分析[12-13].

本研究向Anammox 體系中投加Fe( Ⅲ),通過長短期批式試驗,研究了鐵濃度及價態變化對Anammox 菌脫氮效能、污泥形態和微生物群落結構的影響,并建立Fe( Ⅲ)對Anammox 污泥活性影響的動力學模型,通過氮素轉化比的變化探討Anammox 體系中鐵對氮素的轉化的影響.

1 材料與方法

1.1 接種污泥及配水

接種污泥取自本課題組自2008 年成功馴化后長期運行至今的Anammox 種泥[1].整個培養過程中Anammox 脫氮效果良好,脫氮速率(NRR)為1.2kgN/(L·d),出水NH4+-N, NO2--N 的去除率均保持在90%以上,污泥形態基本為顆粒,粒徑主要分布在0.5～2mm,混合液揮發性懸浮固體(MLVSS)/混合液懸浮固體(MLSS)為0.7～0.8.

實驗所用廢水由人工配置.廢水主要由NH4Cl(按需配制),NaNO2(按需配制),NaHCO31000mg/L,KHCO31000mg/L, KH2PO427mg/L, CaCl2·2H2O 136mg/L, MgSO4·7H2O 200mg/L, Fe(Ⅲ )EDTA 儲備液濃度為0.03mol/L(以Fe( Ⅲ)計,按需投加),微量元素濃縮液成分為(mg/L):EDTA 5000, ZnSO4·7H2O 430, CoCl2·6H2O 240, MnCl2·4H2O 990, NaMoO4·2H2O 220, NiCl2·6H2O 190, NaSeO4·10H2O 210,H3BO414.

1.2 短期批次實驗

為使接種污泥的脫氮性能相近,提高實驗準確度,將含水的Anammox 污泥進行泥水分離.然后將分離后的顆粒污泥等分為12份,每份約5g,分別置于12個1L的血清瓶中.恒溫氣浴振蕩器32℃連續培養15h.根據脫氮效能變化,選用最接近的6 個(差值不大于5%),以進一步保證污泥等分.

在Fe( Ⅲ)對Anammox 污泥短期影響實驗時,6個血清瓶分別加入800mL 營養液以及不同濃度的Fe( Ⅲ)(0.03, 0.06, 0.09, 0.12, 0.18mol/L),用高純氮吹脫15min 以去除瓶內上部空氣及液相溶解氧. 通過HCl 調節pH7.5,采用恒溫培養箱進行培養,攪拌轉速為130r/min,控制培養溫度32℃.進水NH4+-N,NO2--N 濃度分別為100,130mg/L.通過每間隔3h 取一次樣測定氮素的轉化,評估Fe( Ⅲ)對Anammox 污泥脫氮性能的影響.

1.3 長期實驗

采用相同的方法選取3 個性狀相似的污泥1g分別裝于500mL 的血清瓶R1, R2, R3 中進行長期實驗.每個血清瓶加入400mL 營養液以及不同濃度的Fe( Ⅲ)(表1).初始運行周期設定為1d,其中進水5min,運行1420min,沉淀5min,出水5min,換水比為100%,待脫氮效能逐步上升后再將水力停留時間縮短為 12h 的方式提高反應器總氮負荷(NLR).反應器進水均使用高純氮吹脫除氧,采用恒溫培養箱進行培養,反應攪拌轉速為130r/min,控制培養溫度35℃.

表1 兩個階段反應器進水Fe( Ⅲ)濃度(mol/L)Table 1 Fe( Ⅲ) concentration in influent water of the twostage reactor(mol/L)

1.4 分析方法

實驗中各污染物指標的監測方法均參照文獻[14]進行:NH4+-N 采用納氏試劑分光光度法;NO2--N 和 NO3--N:戴安 ICS900/AS23 離子色譜;Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ):鄰菲啰啉分光光度法及總鐵與Fe(Ⅱ)差值計算;pH:哈納pH211 型酸度計.

1.5 掃描電鏡(SEM)分析

從運行結束的R1,R2,R3 中取樣,置于2.5%戊二醛溶液中,4℃固定24h,再經過6 種濃度梯度的乙醇溶液(10%, 20%, 40%, 60%, 80%和100%)脫水處理60min,然后在真空干燥箱中干燥8h,然后對樣品進行噴金處理,最后用FEI 2500 型(美國)掃描電鏡觀察.

1.6 微生物群落結構分析

R1,R2,R3 運行結束后,取污泥樣品,分別標記為R1, R2 和R3,采用FastPrep DNA 提取試劑盒法(QBIOGENE, USA)提取DNA,并利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組 DNA,核對基因組DNA的完整性與濃度.

采用細菌16S V4-V5 區通用引物,對每個樣品進行3 個重復擴增,同一樣品擴增產物進行混合;前端引物515F(5-GTGCCAGCMGCCGCGG-3),后端引物907R(5-CCGTCAATTCMTTTRAGT TT-3);對PCR產物進行切膠純化,Qubit定量之后,等物質的量混合,用于建立測序文庫,采用illumina hiseq 進行測序和分析.

2 結果與討論

2.1 短期內Fe(Ⅲ)對Anammox 污泥脫氮效能影響

批次試驗的進水NH4+-N 濃度100mg/L、NO2－-N濃度130mg/L 左右,每隔3h 取樣,觀察Fe( Ⅲ)對Anammox 脫氮效能的短期影響(圖1).不加Fe( Ⅲ)的對照組反應18h 后,出水NH4+-N,NO2－-N 濃度分別為28.64, 35.07mg/L, NRR 為0.208kg/(L·d).進水Fe( Ⅲ)濃度從 0.03mol/L 到 0.09mol/L,NRR 從0.214kg/(L·d)增長到0.238kg/(L·d),較對照組分別提升了2.5%和14.2%.隨著進水Fe( Ⅲ)濃度的繼續提升,NRR 呈逐漸降低趨勢.當進水Fe( Ⅲ)濃度達到0.18mol/L 時,NRR 降至 0.215kg/(L·d),相比于0.09mol/L 鐵環境,下降了10.75%.說明短期適量的提升Fe( Ⅲ)也可以促進Anammox 脫氮效能的提高,最適濃度為0.09mol/L.當進水Fe( Ⅲ)濃度短期內高于0.09mol/L 時, Anammox 活性被抑制.Shu 等[15]在研究Fe( Ⅱ)對Anammox 影響的批次實驗表明,0.08mol/L Fe( Ⅱ)濃度下,Anammox 菌的比活性可達到0.265d-1,并認為Fe( Ⅱ)濃度高于0.08mol/L,會對Anammox 菌活性產生抑制.而Qiao 等[16]研究表明0.09mol/L 的Fe( Ⅱ)作用下,TN 去除量比對照組(0.03mol/L Fe( Ⅱ))提升了32.8%,且0.09mol/L 為最適Fe( Ⅱ)濃度.本文與Shu 等[15]和Qiao 等[16]研究Fe( Ⅱ)對Anammox 菌活性影響的規律基本相似.

圖1 短期內Anammox 污泥脫氮效能隨Fe( Ⅲ)濃度的變化Fig.1 Short-time effect of Fe( Ⅲ) on nitrogen removal efficiency of Anammox sludge

2.2 Fe(Ⅲ)抑制Anammox 活性的動力學分析

適量的Fe(Ⅲ)對Anammox 具有促進作用,但過量的Fe(Ⅲ)會對Anammox 產生抑制.采用Haldane模型描述基質抑制動力學[17],模擬方程如下:

式中: NRR 為氮去除速率,kg/(L·d); NRRmax為最大氮去除速率,kg/(L·d);SFe為進水Fe( Ⅲ)濃度,mol/L;KFe為半速率常數,mol/L;KI為半抑制常數,mol/L.

如圖2 所示,通過Origin 9.0 對批次試驗所得的數據進行Haldane 模型擬合,所得擬合曲線的相關系數 R2為0.999.這說明Haldane 模型可以較好的描述Fe( Ⅲ)對 Anammox 的抑制動力學. NRRmax為0.316kg/(L·d),半速率常數為0.012mol/L,半抑制常數為0.449mol/L, Fe( Ⅲ)濃度為0.09mol/L 為最適宜濃度,Fe( Ⅲ)濃度超過0.09mol/L 時,隨著Fe( Ⅲ)濃度的提升,氮去除速率逐步下降.

圖2 不同Fe(Ⅲ )濃度下Anammox 脫氮效能抑制動力學曲線Fig.2 The model-fitted relationship between Fe(Ⅲ ) concentrations and nitrogen removal efficiency of Anammox using the substrate inhibition kinetics

2.3 長期內Fe(Ⅲ)對Anammox 菌脫氮性能的影響

為了進一步探討Anammox 菌對Fe( Ⅲ)的耐受性和可馴化性進行長期實驗(圖3).第1 階段, NLR保持在0.25kg/(L·d)左右,進水Fe( Ⅲ)濃度分別為0.03,0.06,0.09mol/L 時,3 個反應器的平均NRR 分別為0.123,0.128kg/(L·d)和0.147kg/(L·d).與R1 相比,R2 和R3 的NRR 分別提高了4.3%和19.9%.同時,0.09mol/L Fe( Ⅲ)下R3 平均NRR 和最大NRR 分別比0.03mol/L 的R1 提升19.9%和15.6%. Wei 等[18]分別用缺乏和充足Fe( )Ⅲ的培養基培養Nitrosomonas europaea,結果發現Fe( Ⅲ)充足時,培養基中細菌量是Fe( Ⅲ)缺乏時的1.6～3.3 倍,并且細胞中血紅素c的含量更高,說明Fe( Ⅲ)同樣可以作為微生物新陳代謝過程中微量鐵元素. Qiao 等[16]研究不同濃度Fe( Ⅱ)對Anammox 影響時也發現,投加0.06mol/L Fe( Ⅱ)和0.09mol/L Fe(Ⅱ )的實驗組的NRR 相較于對照組分別提升2.6%和7.9%,但是增幅明顯低于本實驗,表明Fe( Ⅲ)比 Fe( Ⅱ)更能刺激Anammox 系統的脫氮性能.

為了進一步探討Anammox 菌對Fe( Ⅲ)的耐受性,第31d,保持R1 進水Fe( Ⅲ) 0.03mol/L 不變,R2,R3 進水 Fe( Ⅲ) 濃度分別提升至 0.12mol/L,0.18mol/L, NLR 從0.25kg/(L·d)逐步提升至0.468kg/(L·d),3個反應器的平均NRR分別達到0.265kg/(L·d),0.304kg/(L·d)和0.303kg/(L·d).這一階段,R2, R3 的NRR 相較于R1,分別提高了14.7%, 14.6%,說明此濃度的Fe( Ⅲ)仍能促進Anammox 反應.但是NRR 增幅比第1 階段0.09mol/L Fe( Ⅲ)投加量下降了5.2%.然而此階段下,反應器的NRR 并不像第1 階段隨Fe( Ⅲ)濃度增大而呈梯度上升關系.隨著運行時間的延長, 0.18mol/L Fe( Ⅲ)濃度對Anammox 的抑制作用逐漸體現.長期培養至52d 后,R3 的NRR 基本維持不變,并有下降趨勢.而R2 的NRR 幾乎提高到與R3 一致,甚至高過了R3,最大NRR 比R3 提升了4%.Huang 等[19]研究金屬離子對Anammox 影響時,投加 0.08mol/L Fe(Ⅱ ),獲得最大 TN 轉化量1.93kg/(m3·d),繼續提高Fe( Ⅱ)濃度,TN 去除量降低,表明適宜濃度的Fe( Ⅱ)對Anammox 菌的重要性.本研究在長期實驗中獲得的最適濃度 Fe( Ⅲ)為0.09mol/L,與短期實驗一致.

3 個反應器不同時期除Fe( Ⅲ)外,還存在微量的Fe(Ⅱ),其含量與Fe( Ⅲ)投加量相對應,呈現R3>R2>R1 的趨勢,特別是第2 階段, Fe( Ⅲ)濃度差異較大時其更為明顯(圖4).Zhao 等[20]發現Anammox 細菌中存在大量的鐵還原酶,約81%的鐵還原酶位于細胞膜部分.Li 等[21]以NH4+-N 和Fe( Ⅲ)為底物,在Anammox 污泥中成功觀察到厭氧鐵氧化氨現象,即投加的Fe( )Ⅲ作為電子受體參與反應氧化NH4+-N,伴隨著NH4+-N的轉化自身還原為Fe(Ⅱ).同時,厭氧鐵氧化氨過程產生的 Fe(Ⅱ)作為微量礦物質被Anammox 菌吸收.因此,本系統中Fe(Ⅱ)的產生推測是由于厭氧鐵氧化氨現象所致,并且隨著Fe( Ⅲ)濃度的提升,這種現象更加明顯[22].

圖4 反應器內鐵離子濃度變化對比Fig.4 Comparison the Fe concentration of each reactor in two phases

2.4 不同鐵離子濃度對Anammox 過程氮轉化比的影響

在Anammox 反應過程中,氮素轉化比是其反應特性的重要評價指標,NH4+-N: NO2--N: NO3--N 理論值為1: 1.32: 0.26[23].通過研究氮素轉化比的變化,進一步分析鐵與氮素的同步轉化關系(圖5).

圖5 Fe( Ⅲ)濃度對NO2--N/NH4+-N 和NO3--N/NH4+-N 的影響Fig.5 The effect of different Fe( Ⅲ) on NO2--N/NH4+-N and NO3--N/NH4+-N

在第1 階段, R1, R2, R3 的3 氮平均轉化比分別為1:(1.129 ± 0.152):(0.165 ± 0.033), 1:(1.116 ±0.153):(0.169 ± 0.029), 1:(1.108 ± 0.164):(0.173 ±0.022).進入第2 階段,進水Fe(Ⅲ)濃度提高后,R1,R2,R3 的3 氮平均轉化比分別達到1:(1.227 ± 0.078):(0.190 ± 0.013), 1:(1.192 ± 0.068):(0.193 ± 0.014), 1:(1.188 ± 0.0.064):(0.201 ± 0.026),說明Fe( Ⅲ)濃度的提高明顯導致了NH4+-N 的過量轉化. Shu 等[15]研究Fe(Ⅱ)對Anammox 影響時發現,隨著Fe(Ⅱ)濃度從0.02mol/L 提升至0.08mol/L, NO2--N/NH4+-N 由初始的1.311±0.041 降低至1.291±0.015,認為存在厭氧鐵氨氧化作用導致NH4+-N 的過量轉化.而這種依賴Fe( Ⅲ)還原的NH4+-N 氧化現象,目前已在濕地[24]、稻田[25]等厭氧環境中發現. Sawayama 等[26]通過培養中溫厭氧發酵污泥驗證了厭氧鐵氧化氨現象,所添加鐵的形態即為Fe(III)EDTA 絡合物.Yang 等[27]在厭氧條件下利用同位素示蹤技術檢測到旱地土壤中存在鐵還原耦合氨氧化現象. Pham 等[28]和Bond 等[29]研究表明,當體系中溶解氧有限時, Aeromonas hydrophila 和Geobacter sulfurreducen 兩種菌可以在缺氧條件下利用Fe( Ⅲ)代替氧作為電子受體參與反應.相同階段內R1,R2,R3 的NO2－-N 與NH4+-N 的轉化比均呈現遞減趨勢,說明隨著Fe( Ⅲ)濃度的提升,更多的Fe(Ⅲ )作為電子受體參與氧化NH4+-N,導致轉化比隨Fe( Ⅲ)濃度提升而降低.與此同時,3 個反應器出水NO3－-N/NH4+-N 均是逐漸增大.Park 等[30]在驗證厭氧鐵氧化氨反應時發現產物中有大量的NO3－-N 生成.Li 等[21]以Fe(Ⅲ )為電子受體在Anammox 體系內,探究Fe(Ⅲ )還原氨氧化現象,發現出水NO2--N濃度始終低于1mg/L,而出水NO3－-N 約為15mg/L,NO3－-N 和N2為反應的主要產物.伴隨著鐵濃度的提升,厭氧鐵氧化氨反應受到強化,產物主要是NO3－-N,而參與該作用的功能微生物還需進一步研究.

2.5 Fe(Ⅲ)對Anammox 菌形態的影響

將經過長期運行后的3 個反應器污泥取出進行掃描電鏡分析.接種的Anammox 菌主要呈球狀,與現有文獻報道的Anammox 菌的形態結構一致(圖6(a))[31].經過長期的Fe( Ⅲ)刺激培養下顆粒表面呈均勻球狀,表面光滑,排列緊密,單個Anammox 菌的大小在0.9～1.2μm, Anammox菌體結構和形態趨于穩定(圖6(b),(c)).這表明低濃度Fe( Ⅲ)對Anammox 菌結構的形成具有促進作用.

圖6 Anammox 污泥掃描電鏡照片Fig.6 The SEM graphs of sludge samples taken from reactor

2.6 微生物群落結構分析

如表2 所示,3 個反應器的序列數在27908～31280 之間,差異不大.Chao 1, Shannon, Simpson 指數常用于表征細菌群落和物種的豐富度,其中豐富度指數Chao 1 可以估算群落中OTUs 的數目,在生態學中常用來估計物種總數,值越大代表物種總數越多.在低濃度Fe(Ⅲ)的刺激下,反應器內細菌多樣性得到提升,反應器內Chao1 值由955 上升至1023.當Fe(Ⅲ)濃度達到0.18mol/L(R3)時,Chao1 值又下降至976,說明Fe(Ⅲ)抑制作用導致細菌多樣性的減少.OTUs 的變化規律與Chao1 相一致. Simpson 指數體現了優勢物種生物量占群落生物總量的比重.該指數越大表明優勢菌群生物量占總生物量比重越大,反之則優勢菌群生物量占總生物量比重越小.Simpson 變化趨勢表明,Fe(Ⅲ)有利于Anammox菌的富集,而其濃度過高后,對Anammox 菌產生抑制,導致優勢菌群比重有所下降.

表2 反應器中微生物群落豐富度和多樣性估計值的變化Table 2 Variations of richness and diversity estimators of microbial communities in the reactor

從門水平上可知,反應器內細菌群落結構多樣性較為豐富,按照豐富度排列主要有Chloroflexi,Proteobacteria, Ignavibacteriae, Bacteroidetes,Planctomycetes, Acidobacteria 等門類(圖7a).從脫氮功能菌來看,3個反應器內Proteobacteria所占比例分別為22.6%, 28.0%和27.4%.Planctomycetes 所占比例為2.2%, 4.1%和2.5%,遠低于Proteobacteria.說明隨著Fe(Ⅲ)濃度的提升,脫氮功能微生物有明顯富集.R2 中Proteobacteria 門占比較R1 增長了23.9%,Planctomycetes 更是增長了86.4%,這說明適宜濃度的Fe(Ⅲ)對Anammox 的生長具有重要的促進作用.而當Fe(Ⅲ)濃度過高后,這兩種主要脫氮微生物的比例有所下降.

圖7 Fe(Ⅲ)對Anammox 系統微生物群落結構的影響Fig.7 Effects of Fe(Ⅲ) on microbial community structure in Anammox system

為進一步闡明Fe(Ⅲ)對Anammox 系統細菌群落的演化,在屬的水平上,選取系統中占有量超過0.1%的屬進行分析(圖7b). Proteobacteria 門中占比較高的是 Rhodoplanes 屬(11.37%～16.18%),Betaproteobacteria 屬(3.17%～3.38%),Dokdonella 屬(1.01%～1.23%).這些屬均屬于Proteobacteria 主要細菌,在廢水處理及環境樣品中常被檢測到.Rhodoplanes 屬可在厭氧黑暗環境下很好地降解有機物和一些難以生物降解的含氮雜環化合物如喹啉都能較好地被其降解[32].而Fe(Ⅲ)明顯刺激了Rhodoplanes 屬的生長,在R2 中的豐度達到16.18%,較R1 增幅達到42.3%.而Fe(Ⅲ)濃度達到0.18mol/L時對Rhodoplanes 屬產生抑制,R3 中豐度略有下降.Betaproteobacteria 屬,Dokdonella 屬則沒有明顯變化.Planctomycetes 中,檢測到Candidatus Brocadia 屬的存在,但含量沒有明顯變化,而 unclassified_Planctomycetia 的含量,呈現R2>R3>R1 的趨勢,與Fe(Ⅲ)對Anammmox 系統脫氮的作用規律一致.其他的菌屬, 諸如未被分類的 Chloroflexi,Anaerolineaceae 屬的含量在Fe(Ⅲ)濃度下提高下出現減少,原因需要進一步深入研究.

3 結論

3.1 短期結果表明,適量的 Fe( Ⅲ)可以提升Anammox 菌脫氮效能,0.09mol/L 為最適濃度.此時氮去除速率為0.238kg/(L·d),較之對照組0.208kg/(L·d),提升了14.2%.繼續提高進水Fe( Ⅲ)濃度,氮去除速率逐步下降,當Fe( Ⅲ)濃度升至0.18mol/L 時,氮去除速率降至0.215kg/(L·d),比0.09mol/L Fe( Ⅲ)下降10.75%.短期實驗擬合得到Fe( Ⅲ)對Anammox半速率常數(KFe)為0.012mol/L,半抑制常數(KI)為0.449mol/L.

3.2 長期結果表明, 0.09mol/L Fe( Ⅲ)環境下,Anammox 氮去除速率增速最快,較對照組提升19.9%. Fe( Ⅲ)濃度為0.09～0.18mol/L 時,Anammox氮去除速率可持續增加,但增幅隨Fe( Ⅲ)濃度增加而下降. NO2－-N 與NH4+-N 的轉化比在1.108 和1.227 之間波動,并隨Fe( Ⅲ)濃度的提升而降低.

3.3 隨著 Fe( Ⅲ)濃度的提高,主要脫氮門類Proteobacteria, Planctomycetes 占比明顯增長,Planctomycetes 主要屬為Candidatus Brocadia 屬和unclassified_Planctomycetia, 其 中 unclassified_Planctomycetia 的含量變化與Fe( Ⅲ)作用規律一致,而Candidatus Brocadia 屬含量沒有明顯變化.

3.4 隨著Fe( Ⅲ)濃度增加系統中Fe( Ⅱ)濃度也隨著增加,并且NH4+-N 過量轉化和NO3－-N 過量生成現象,推測存在厭氧鐵還原氨氧化現象.