鄰苯二甲酸酯降解功能內生菌群的篩選及定殖效能

張 帥,王 建,馬俊超,高彥征,左翔之,凌婉婷(南京農業大學土壤有機污染控制與修復研究所,江蘇 南京 210095)

鄰苯二甲酸酯(PAEs)被廣泛應用于塑料、化妝品、油漆等行業[1-3],全球年產量高達3 億t[4].作為增塑劑,PAEs 與塑料產品之間以氫鍵或范德華力連接,隨著時間的推移,很容易通過各種途徑向環境中釋放.同時作為一種持久性和疏水性有機污染物,PAEs極易在土壤中積累[5],并通過各種途徑暴露于人體從而引發癌癥、內分泌干擾性、生殖和神經毒性等危害,嚴重威脅人體健康[6].當前,美國和歐盟已將鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)、鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)、鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)、鄰苯二甲酸丁基芐基酯(BBP)、鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)和鄰苯二甲酸二辛酯(DnOP)6 種PAEs 列為優先控制污染物[7],我國也將DMP、DBP、DnOP 定為環境優控污染物[8].

土壤中的PAEs 可被作物根系吸收并向地上部轉移,造成農作物可食部位PAEs污染.長江三角洲和珠江三角洲地區的調查結果顯示,我國蔬菜等農作物中普遍檢出 PAEs,平均含量分別為 0.536,2.84mg/kg,主要以DBP、DEHP 和DnOP 為主,其中,珠三角地區葉菜類蔬菜中DEHP 的含量遠超美國和歐盟建議的標準,嚴重威脅了人體健康[9-10].

植物內生細菌是棲息在植物組織內部,能夠促進植物生長,提高植物抗病和抗逆能力并與其互利共生的一類細菌.許多內生細菌具備有效降解有機污染物的能力[11-12].近年來,一些PAEs 降解的內生細菌如芽孢桿菌屬(Bacillus)、戈登式菌屬(Gordonia)、假單胞菌屬(Pseudomonas)等已經被分離出來[13-14].將分離獲得的功能菌株重新定殖回作物體內,可有效減低作物體內有機污染物的積累[15].然而,實際污染區往往是多種PAEs共存,單一菌株降解PAEs 的能力有限,而不同來源的PAEs 降解菌株間的復配往往會存在拮抗作用,最終影響功能內生細菌的原位定殖效能.實際污染區作物體內存在經自然馴化且功能穩定的菌群,能否將其富集馴化并通過定殖的方式實現作物體內PAEs 的直接消減,對此,國內外相關研究較少.

本研究從PAEs 污染區生長的蔬菜中富集馴化具有PAEs 降解能力的功能內生菌群,解析菌群群落組成;驗證菌群降解效能;優化菌群降解PAEs的條件;借助水培體系驗證菌群對作物體內PAEs的消減效能及促生效應,旨在為消減作物體內PAEs 污染、保障污染區農業生產安全和人群健康提供參考.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試植株 空心菜(Ipomoea aquatica Forsk.)采自被PAEs 污染的土壤中.

1.1.2 主要試劑 DMP、DEP、DBP 和BBP 購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司,純度均為99.0%.霍格蘭營養液(HNS).丙酮、正己烷、甲醇、乙腈均為色譜級.

培養基配制:LB 液體培養基(1.0L):10.0g 進口蛋白胨、5.0g 進口酵母提取物、10.0g NaCl. 無機鹽液體培養基(1.0L):1.50g(NH4)2SO4、0.50g KH2PO4、0.50g NaCl 、 1.91g K2HPO4·3H2O 、 0.20g MgSO4·7H2O.涉及到的所有培養基均在高壓滅菌鍋中121℃條件下滅菌20min.

30%甘油:超純水與丙三醇按7:3的體積比混合,滅菌后置于4℃冰箱保存.

1.2 內生菌群的篩選

空心菜經過表面消毒后,將其移入無菌研缽,剪碎,加入無菌水充分研磨.靜置5min 后,移取適量上清液至添加PAEs(5mg/L)的無機鹽液體培養基中,30℃ ,150r/min 避光振蕩培養.5d后,轉接上層培養液至新配制的添加PAEs(10mg/L)的無機鹽液體培養基中,富集馴化培養5d,之后梯度增加PAEs 的濃度并重復以上步驟.如此共富集馴化培養20d,以獲得穩定的具有高效降解PAEs 能力的功能內生菌群.最后,將獲得的菌液與30%甘油按照體積比1:1 的比例均勻混合,于-80℃冰箱保存備用.

1.3 菌群生長曲線測定

于超凈臺內挑取-80℃條件下保存的菌種于LB液體培養基中,30℃、150r/min 避光振蕩培養,定時取樣測定菌液的OD600值.

1.4 菌群的降解效能測定

1.4.1 功能內生菌群菌懸液制備 于超凈臺內挑取-80℃條件下保存的菌種至5% LB 液體培養基中,30℃、150r/min 避光振蕩培養8h,離心收集菌體,用無機鹽培養液洗滌菌體2 次,再次離心后棄去上清液,收集菌體,用無機鹽培養液調整菌懸液OD600為1.0,于4℃冰箱中保存備用.

1.4.2 功能內生菌群降解效能測定 將制備好的菌懸液按照5%的比例接種到添加PAEs(5mg/L)的無機鹽液體培養基中,30℃,150r/min 避光振蕩培養,定時取樣測定剩余PAEs 含量.

1.5 菌群群落結構分析

1.5.1 樣品收集 取一定量經LB 液體培養基活化后的菌群,離心,棄去上清液,收集菌體后交由美吉生物公司進行檢測.

1.5.2 DNA 抽提和PCR 擴增 采用E.Z.N.A.?soil DNA kit(Omega Bio-tek,Norcross,GA,U.S.)試劑盒進行微生物群落總 DNA 抽提.使用通用引物338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’) 以及806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)對16SrRNA 基因V3-V4 可變區進行PCR 擴增.擴增程序如下:95℃預變3min,27個循環(95℃變性30s,55℃退火30s,72℃延伸30s)后72℃穩定延伸10min.

1.5.3 Illumina Miseq 測序 將同一樣本的PCR 產物混合后使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR 產物,利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences,Union City, CA, USA)進行回收產物純化,2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,并用Quantus? Fluorometer(Promega,USA)對回收產物進行檢測定量.

1.6 環境因子對降解的影響

取配制好的無機鹽培養基,分別設置不同pH值、鹽度、底物濃度的試驗組,按照5%的接菌量接種菌液,30℃,150r/min 避光振蕩培養,同時設置不同溫度的試驗組,7d 后取樣測定培養液中PAEs 含量.

1.7 菌群定殖及水培試驗

選取水稻為接種對象,本研究設置浸根定殖(ZR)和接種滅活菌群對照組(ZK),各接種處理的水稻暴露于含10mg/L PAEs 的Hoagland 培養液中.

接種方法如下:水稻種子經表面消毒,催苗育種7d后,選取10株長勢一致的植株,菌懸液浸泡水稻根部8h,無菌水沖洗后,將植株移入添加PAEs(10mg/L)的Hoagland 培養液中,置于晝夜溫度25℃ /20 ℃的光照培養箱中培養,15d 后采集植物樣品進行PAEs 含量和生物量等指標的測定.

1.8 植物PAEs 含量分析

稱取0.2g 制備好的植物樣品于25mL 玻璃離心管中,添加15mL 丙酮-正己烷溶液(V/V, 1:1),渦旋混勻0.5～1min,水浴超聲45min.隨后以2000r/min 離心10min.取上清液倒入活化后(10mL 正己烷分兩次淋洗)的層析柱中(層析柱上層為2g 無水硫酸鈉,下層為2g 硅膠),再次添加丙酮-正己烷溶液(V/V, 1:1),同上,重復2 次.洗脫之后分3 次添加15mL 丙酮-正己烷溶液(V/V,1:9).收集混合液并借助旋轉蒸發儀(40℃、100r/min 條件下)濃縮至干,移取2mL 甲醇潤洗定容,隨即倒入帶有0.22μm 有機相濾頭的玻璃注射器,過濾進2mL 棕色液相小瓶,使用HPLC 分析.

HPLC 條件:色譜柱為Ф4.6mm×250mm Inertsil ODS-P 液相色譜柱;流動相乙腈:水為60:40,初始流速為1mL/min,柱溫為40 ℃;檢測時間為40min,進樣量為20μL;檢測系統采用紫外檢測器,開啟波長切換模式,波長分別為205 和290nm.

1.9 數據處理與統計分析

采用Excel 2021 進行數據處理,使用Origin 2021 繪圖與降解動力學數據擬合.各組之間的數據差異采用ANOVA 分析比較(SPSS 23.0 軟件).

2 結果與討論

2.1 菌群生長曲線

如圖1(a)所示,根據細菌生長周期規律來劃分,菌群接種到LB 培養基中后,在培養前期生長緩慢,處于延滯期,菌量增幅較小.大概經過4h 后菌群進入對數生長期,菌體數量開始快速增加,10h 時菌群達到生長高峰,之后進入穩定期,此時細菌的增殖數與死亡數基本持平.處于對數生長期的菌群生長繁殖速度最快,代謝能力強,擁有最好的降解能力[16].同時,該菌群相比某些菌群繁殖速度較快[17].

圖1 菌群的生長和降解曲線Fig.1 Growth and degradation curves of bacterial consortium

2.2 菌群對PAEs 的降解效能

純培養體系下該菌群可以有效降解 4 種USEPA 優先控制PAEs.如圖1(b)所示,菌群在添加PAEs(5mg/L)的無機鹽液體培養基中培養1d 時,對4種 PAEs 的降解率都比較低,分別為 44.41%、10.27%、17.65%和11.23%.第3d 時,菌群對DMP、DEP、DBP、BBP 的降解率相比第1d 有了較大提高,分別達到了95.86%、93.89%、88.37%和38.61%.隨著培養時間的延長,PAEs的降解率維持平穩,第5d時對DMP、DEP、DBP、BBP 的降解率分別為96.33%、94.41%、93.20%和41.96%,第7d 時對4種PAEs 的降解率分別為97.08%、94.47%、98.02%和44.82%.

利用一級動力學方程對PAEs 降解曲線進行擬合,如圖2 和表1 所示,菌群對4 種PAEs 的降解均符合一級反應動力學.

表1 PAEs 的降解動力學方程Table 1 Degradation kinetic equation of PAEs

圖2 菌群降解PAEs 的準一級動力學擬合曲線Fig.2 Pseudo-first-order kinetic fitting curves for the degradation of PAEs by bacterial consortium

由于DMP、DEP、DBP 結構較簡單,具有更高的生物利用率,在降解過程中更趨于被優先利用,在降解起始的第7d,3 種PAEs 基本上被完全降解.相比之下,分子量較大的BBP 降解進展比較緩慢,降解半衰期遠大于其余3 種PAEs.可能是因為該菌群在PAEs 的代謝途徑上不能互補,造成某些中間產物無法繼續代謝,從而產生對菌群的抑制作用[18].

與單一菌株相比,菌群內部的各個菌株為降解過程提供了更多的降解基因和代謝途徑,使得菌群具有更高的污染物礦化能力[19].近年來,也有許多研究者從環境中富集馴化出具有PAEs 降解能力的菌群.呂律[20]從活性污泥中富集培養得到一組菌群LV-1,該菌群對DBP 的降解率可達到95%以上;李靜[21]從污泥中富集馴化的具有PAEs 降解能力的菌群SD-1 對DMP、DEP 和DBP 均具備降解能力,在72h 內的降解率分別為68.71%、68.46%和80%.相比之下本研究篩選出的菌群對PAEs 具備較高的降解廣譜性和高效性,在降解環境中多種共存的PAEs時具備一定優勢,應用潛力較大.

2.3 菌群的群落結構

借助16SrRNA 高通量測序技術分析了菌群的群落組成.結果(圖3)顯示,從門分類水平看,菌群中的最優勢菌門為變形菌門(Proteobacteria,76.57%),其次為擬桿菌門(Bacteroidetes,21.04%)、放線菌門(Actinobacteria,2.37%).從屬分類水平看,菌群主要由鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium,33.03%)、代爾夫特菌屬(Delftia,40.61%)、假單胞菌屬(Pseudomonas,11.70%)、無色桿菌屬(Achromobacter,3.04%)和根瘤菌屬(Rhizobium)(6.90%)組成.其中,鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium)和代爾夫特菌屬(Delftia)占比較高,此兩種菌屬已被多次報道具備PAEs 降解的能力.Neelakanteshwar 等[22]分離出一株 Delftia sp.TBKNP-05,該菌株在培養基中經過5d 的培養后對DBP(10mmol/L)的降解率可達到100%;馬永見[23]從土壤中分離出一株Sphingobacterium sp. MJ1,該菌株在 780mg/L PAEs(DMP、DBP、DEHP 各為260mg/L)的無機鹽培養基中培養3d 后對DBP 和DMP 的去除率均可達到91%以上,對DEHP 的去除率也可達到82%以上.其余幾種菌屬同樣具有PAEs降解能力,如Feng 等[24]篩選出的一株Pseudomonas sp. YJB6 經過3d 的培養可完全降解200mg/L 的DBP;Wang 等[25]篩選出一株Achromobacter sp. RX,經過96h的培養,對DEHP的降解率可達97.9%;Tang等[26]篩選出一株Rhizobium sp. LMB-1,45h 內可完全降解100mg/L 的DMP.本研究富集馴化獲得的菌群中的各占比較高菌屬均具備PAEs 降解能力,且各個菌屬之間可能存在協同代謝作用,從而增強菌群的降解廣譜性和高效性[27].值得注意的是,鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium)和代爾夫特菌屬(Delftia)在菌群中的占比高達73.64%,推測PAEs的降解過程可能由這2 種優勢菌屬主導.

圖3 菌群的群落結構Fig.3 Bacterial community structure of the bacterial consortium

2.4 環境條件對菌群降解PAEs 的影響

2.4.1 pH值 pH值是影響微生物降解能力的重要環境因素之一.過高或者過低的pH 值均會影響微生物及其相關降解酶的活性.由圖4(a)可以看出,菌群對PAEs 的最大降解率主要集中在pH 7～8 的范圍內,降解率分別達78.30%和76.60%,在此pH 值范圍內,菌群對PAEs 的降解率無明顯差異.過酸或過堿條件會改變生物細胞膜的選擇透過性從而影響其對營養物質的吸收或改變相關降解酶活性.柴陽陽等[28]篩選出了具有DBP 降解能力的內生菌株HBT4,發現適合菌株培養的pH 值為6～8,pH 值為4 時菌株對DBP 的降解率不足10%.盡管本研究篩選的菌群在不同pH 值條件下對PAEs 的降解率存在一定差異,但整體來看菌群在pH 5～9 的范圍內對PAEs 均具備良好的降解效果,相比于一些單菌來講,該菌群降解譜較廣的同時還具備一定的耐酸堿性.

圖4 環境條件對菌群降解PAEs 的影響Fig.4 Effect of environmental conditions on the degradation by the bacterial consortium

2.4.2 溫度 溫度會影響微生物相關降解酶的活性從而影響菌體對污染物的降解能力.由圖4(b)可以看出,菌群對PAEs 的最大降解率主要集中在溫度 25～30℃的范圍內,降解率分別達 85.14%和77.91%.此溫度范圍內,菌群對PAEs 的降解率無明顯差異.當溫度在20℃和35～ 40℃范圍內時,PAEs降解率與25℃時相比顯著降低.李方方等[29]發現當培養體系溫度為20℃時,菌群LV-1 對DBP 的降解率僅在40%左右,在25～35℃范圍內時,菌群對PAEs的降解率較高,可達到80%以上.可見溫度過高或者過低均會對菌群的降解能力產生影響.較低的溫度會使細胞膜的流動性變差,PAEs 的溶解度變低,阻礙微生物對營養物質和養分的吸收;較高的溫度則會使細胞內相關酶的活性降低和核酸變性,使PAEs 降解率變低[30].相比之下,本研究篩選的菌群在較高或較低的溫度條件下對PAEs 的降解率仍可以達到60%以上,在不同溫度環境下降解PAEs 具備一定的優勢.

2.4.3 鹽度 鹽度是影響菌群降解PAEs 的關鍵因素之一.由圖4(c)可見,不同鹽度條件下菌群降解PAEs 的能力差異較明顯.隨著鹽度的增加,菌群對PAEs的降解率逐漸降低,在1%～2%范圍內降解效果較好.當鹽度在8%時,PAEs 降解率僅28.59%.周婷等[31]在研究鹽度條件對菌群ZM 降解DMP 的影響時發現,當鹽度增加到4%時,菌群對DMP 的降解率幾乎為0.可能的原因是高鹽度會使蛋白質發生變性,致使酶的活性受到抑制[32],同時高鹽度會使微生物耗氧速率變低,導致PAEs 降解率下降[33].對比之前的研究,本研究篩選的菌群在鹽度為4%時仍具備比較好的PAEs 降解能力,說明其對PAEs 降解具備較高的耐鹽性和廣泛的鹽度范圍.

2.4.4 底物濃度 底物濃度對菌群降解PAEs 的影響如圖4(d)所示.菌群對PAEs 的最大降解率主要集中在 5～10mg/L,降解率最大可達 76.73%(5mg/L).當濃度在2mg/L 和15～20mg/L 時,菌群對PAEs 的降解率顯著降低.徐瑩[34]在研究菌株FA1對芘的降解特性時發現了類似的現象.可見底物濃度過高或者過低均會影響菌群的降解活性.這可能是由于底物濃度過低不容易引起菌群相關降解基因的表達,使其不能將底物充分利用;濃度過高則會對微生物產生毒性,影響微生物的生長和降解活性[35].

2.5 功能內生菌群定殖效能

功能內生細菌相較于其他菌株,能夠更好地適應植物體內的環境,與宿主植物形成良好的共生體系,發揮良好的降解效能.本研究中富集馴化的功能內生菌群定殖后可以顯著降低水稻體內的PAEs 含量(表2).相同培養周期內,ZR 組水稻體內DMP、DEP、DBP 和∑PAEs 的含量與ZK 組相比分別降低了41.09%、45.33%、63.06%和32.30%,BBP 含量無明顯變化.Xu 等[36]將內生菌株Bacillus subtilis strain HB-T2 定殖到卷心菜體內,發現定殖HB-T2 的卷心菜根、莖中DBP 的殘留濃度分別為未接種HB-T2卷心菜相應組織的29.3%和52.4%.

表2 水培15d 后水稻體內PAEs 的含量Table 2 Contents of PAEs in rice after 15 days of hydroponic culture

功能內生細菌定殖到植物體內后,一方面會使植物體內相關降解酶系活性發生變化進而促進植物體內有機污染物的去除.陳學斌等[37]研究發現,玉米接種菌株XB 能顯著提高玉米體內超氧化物歧化酶、過氧化氫酶及多酚氧化酶活性,緩解土壤DEHP對玉米生長的脅迫,降低玉米吸收積累DEHP;另一方面,功能內生細菌可以增加植物體內降解基因豐度.Zhang 等[38]將功能內生菌群CEB 定殖到植物體內,增加了植物體內PAHs 代謝相關功能基因的拷貝數,促進了植物體內PAHs 的去除.此外,有研究指出功能內生細菌可以以植物體內的氨基酸、葡萄糖等內源性有機物為碳源和能源物質,提高自身的共代謝能力以促進植物體內污染物的去除[39].因此,定殖功能內生細菌有望降低作物體內PAEs 的積累.對比以往針對單一PAEs 的研究,本研究篩選獲得的菌群定殖植物后能夠有效去除植物體內3 種PAEs,在實現實際污染區作物體內PAEs 的消減方面具備一定優勢,在保障PAEs 污染區農產品質量安全和人體健康方面具有較廣闊的應用前景.

此外,菌群的定殖促進了水稻的生長,提高了植株生物量(表3).定殖的促生效應在根長、株高、鮮重、干重上均比較顯著.定殖后根長和株高分別提高了13.01%和28.63%,鮮重和干重分別提高了14.91%和20.83%.功能內生菌群主要通過以下兩個途徑促進植物生長:一方面,內生細菌可以通過固氮、磷酸鹽溶解和鐵螯合等作用,促進植物對營養物質的吸收[40];另一方面,部分內生細菌還可以通過調節激素水平來促進植物生長[41].

表3 水培15d 后水稻的生物量Table 3 Biomass of rice after 15days of hydroponic incubation

3 結論

3.1 本研究富集馴化了一組具有降解4 種USEPA優控PAEs 能力的功能內生菌群,純培養體系中,7d內該菌群對DMP、DEP、DBP、BBP 的降解率分別達到97.08%、94.47%、98.02%和44.82%.

3.2 菌群在門分類水平上主要由變形菌門(Proteobacteria,76.57%)、擬桿菌門(Bacteroidetes,21.04%)和放線菌門(Actinobacteria,2.37%)組成;在屬分類水平上主要由鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium, 33.03%)、代爾夫特菌屬(Delftia,40.61%)、假單胞菌屬(Pseudomonas, 11.70%)、無色桿菌屬(Achromobacter,3.04%) 和根瘤菌屬(Rhizobium, 6.90%)組成.

3.3 菌群的最佳降解條件為:pH 7、25℃、鹽度1%、底物濃度5mg/L.

3.4 水培條件下,以浸根的方式將菌群定殖到水稻體內可以有效降低植物中PAEs 的含量,15d 內DMP、DEP、DBP 和∑PAEs 的去除率分別達到41.09%、45.33%、63.06%和32.3%,同時該菌群還能夠促進作物的生長,提高作物產量.