生物信息學分析TOP2A在肝細胞癌中表達和預后機制及其對肝癌增殖、遷移的影響*

劉有浩 欒欣怡 楊 瑩 李浩然 李宏彬

山西醫科大學汾陽學院,山西省汾陽市 032200

肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是常見的惡性消化道腫瘤之一,發病率高,手術效果欠佳,預后極差[1]。大多數肝癌患者都是在后期確診的,很大程度上耽誤了最佳治療時間,因此了解與肝癌發病有關的分子機制,并找尋有價值的肝癌生物因素標志供臨床參考診斷十分具有意義。

有研究表明拓撲異構酶(DNA)Ⅱα[Topoisomerase (DNA) Ⅱ alpha,TOP2A]可以促進癌細胞的增殖和遷移,如髓母細胞瘤[2]、肺癌細胞[3-4]、甲狀腺癌[5]及食管鱗狀細胞癌細胞[6-7],充分證實了TOP2A 作為生物標志因素影響腫瘤的發生和發展,可以作為癌癥診斷和預后的重要指標。本研究通過生物信息學方法探討TOP2A在肝癌中的表達,并且降低肝癌細胞中TOP2A的表達,觀察其對細胞增殖和遷移能力的影響,分析其在HCC發生發展中的作用機制,為患者的早期診斷提供新的思路和依據。

1 材料和方法

1.1 實驗試劑及儀器 人肝癌細胞(HepG2細胞株)、TOP2A抑制劑(銳博生物)、DMEM培養基(Gibco)、青鏈霉素(美侖)、胎牛血清(ExCell Bio)、無菌PBS緩沖液(美侖)、0.25%EDTA胰酶(美侖)、T25培養瓶(NEST)、6孔板、96孔板(NEST)、CCK-8試劑盒(博士德)、引物(生工生物)、RNA提取試劑盒(聚合美)、RNA逆轉錄試劑盒(聚合美)、SYBR Green試劑盒(聚合美)、0.2mL 8聯管(NEST)。

1.2 TOP2A在腫瘤組織和細胞系的差異表達 通過TIMER 2.0在線數據庫 (http：//timer.cistrome.org)選擇 Exploration欄目下的Gene_De,輸入基因名TOP2A后點擊submit,分析比較TOP2A在33種腫瘤組織和癌旁組織中的表達情況,癌組織和癌旁組織中TOP2A的表達差異有統計學意義用灰色背景標識。利用HPA數據庫(https：//www.proteinatlas.org/),文字框中輸入基因名TOP2A,選擇cell line,得到TOP2A在不同腫瘤細胞系和TOP2A在不同肝癌細胞中的表達結果。

1.3 TOP2A在肝癌組織和癌旁組織中的表達 利用GEPIA2數據庫(http：//gepia2.cancer-pku.cn/#index)選擇Expression DIY欄目,輸入基因名TOP2A,以log2FC<1且P<0.01為篩選條件,疾病類型選擇肝癌(LIHC),分析TOP2A在TCGA數據庫肝癌組織和癌旁組織的表達差異。GEO數據庫(http：//gepia2.cancer-pku.cn/#index)中下載GSE56267和GSE121248數據集,運用R軟件處理數據,使用Graphpad軟件比較TOP2A在肝癌組織和癌旁組織中的表達差異。

1.4 TOP2A表達與肝癌患者預后之間的關系 利用GEPIA2數據庫(http：//gepia2.cancer-pku.cn/#index)選擇Survival Analysis,輸入基因名TOP2A,疾病類型選擇肝癌(LIHC),分析TOP2A mRNA表達與患者的生存預后關系。

1.5 TOP2A基因共表達和GSEA富集分析 利用Linkedomics在線數據庫(http：//www.linkedomics.org/login.php)設置參數疾病類型：肝癌,數據類型：TCGA-LIHC,基因名稱：TOP2A,統計方法： person 相關系數,分析肝癌組織中TOP2A共表達的正負相關基因。選擇“LinkInterpreter”菜單,對該數據庫篩選出的相關基因進行KEGG 通路富集分析。

1.6 細胞培養及分組 HepG2細胞接種于含 10%胎牛血清的 DMEM 培養液中, 37℃、5%CO2培養箱內培養,顯微鏡下觀察細胞融合達到80%～90%,吸出培養基,并PBS洗3次,胰酶消化,重懸細胞液,調整細胞濃度為1×105,接種于6孔板中,24h后加藥換液,參照銳博轉染試劑riboFECTTM說明書進行實驗。分為兩組,陰性對照組(Control組)使用陰性對照siRNA進行轉染,實驗組使用TOP2A抑制劑(濃度為50nM)進行轉染,繼續將細胞放置于培養箱中培養,48h后提取RNA,使用QPCR檢測沉默效果。

1.7 細胞劃痕實驗 對數生長期細胞消化后重懸細胞懸液,顯微鏡下計數,以1×104個/孔接種于6孔板,置于37℃、5%CO2培養箱中培養24h,待細胞融合至80%,進行轉染,轉染24h后,用20μL槍頭比著直尺,垂直于培養板劃痕,吸出培養基,無菌PBS洗滌細胞,去除細胞碎片,置于細胞培養箱中培養,分別于0h、24h使用倒置顯微鏡觀察結果并照相, Image J軟件測量劃痕面積。設立三組平行試驗,用Graphpad軟件統計分析實驗結果。

1.8 CCK-8 法檢測細胞增殖能力 設置對照組和實驗組(分組參考材料方法1.6),將HepG2以2×103個/孔接種于96孔板,每組5個復孔,細胞培養24h,待細胞貼壁良好后吸出培養基,進行轉染,在培養箱中分別孵育0h、12h、24h三個時間點,吸出培養基,預混CCK-8與培養基1∶9比例制成溶液,每孔加入100μL的混合液,將培養板放置于37℃、5%CO2的細胞培養箱中孵育1h,使用酶標儀檢測各孔在450nm波長處的OD值,實驗至少重復3次。

1.9 統計學方法 運用GraphPad 8.0 軟件進行統計學分析和繪圖。實驗均重復3次,所有數據以均數±標準差表示,組間數據比較使用獨立樣本t檢驗,以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TOP2A在腫瘤組織和細胞系中的差異表達 利用TIMER2.0在線數據庫,對TOP2A在正常組織與腫瘤組織中的表達進行研究,結果表明與正常組織相比,腫瘤組織中TOP2A在膀胱移行細胞癌、乳腺浸潤性癌、膽管癌、結腸癌、食管癌、頭頸部鱗狀細胞癌、腎嫌色細胞癌、腎透明細胞癌、腎乳頭狀細胞癌、肝臟肝細胞癌、肺腺癌、肺鱗狀細胞癌、前列腺腺癌、直腸腺癌、胃腺癌、甲狀腺癌、子宮內膜癌中表達明顯上調,具有統計學意義(P<0.05),見圖1a。HPA數據庫結果顯示,TOP2A在膽管癌、骨癌、宮頸癌、食管癌、肝癌、白血病、肺癌、淋巴癌、睪丸癌等細胞中均有表達,見圖1b。通過進一步的分析發現TOP2A在Hep-G2、Hep3B2.1-7、Huh-7、PLC/PRF/5等肝癌細胞系中表達上升,見圖1c,充分佐證了TOP2A可能參與肝癌的發生發展進程。

圖1 TOP2A在腫瘤組織和細胞系中的差異表達

2.2 TOP2A在肝癌組織和癌旁組織中的表達及肝癌患者預后的關系 通過GEPIA數據庫,研究關于TOP2A基因在160例正常組織和369例肝癌組織中的表達差異,結果顯示TOP2A在肝癌組織中的表達水平明顯高于正常組織,見圖2a。在GSE45267數據集和GSE121247數據集中對TOP2A在正常組織和肝癌組織的表達差異進行進一步的驗證,結果表明,與正常組織相比,TOP2A在肝癌組織中顯著高表達,見圖2b、c。通過此三組數據驗證TOP2A在肝癌組織和正常組織的表達情況,結果一致表明TOP2A在肝癌組織中表達均顯著上升,差異有統計學意義(P<0.001)。利用生存分析探索TOP2A不同表達對HCC患者預后的影響,通過GEPIA2數據庫對182例TOP2A高表達組和182例TOP2A低表達組HCC患者預后的情況進行分析,結果顯示TOP2A高表達組患者總生存周期明顯低于低表達組患者,差異具有統計學意義(P<0.05),見圖2d。

圖2 TOP2A在肝癌組織和癌旁組織中的表達及肝癌患者預后的關系

2.3 TOP2A基因共表達和GSEA富集分析 為了進一步探究TOP2A在肝癌中的發展機制,通過LinkedOmics 數據庫尋找肝癌中與TOP2A共表達相關基因,結果表明,19 922個基因與TOP2A表達相關,見圖3a,與TOP2A表達呈正相關的有13 571 個基因,相關性最強的前50個基因為KIF18B、BUB1B等,見圖3b,6 351個基因與TOP2A表達呈負相關,負相關性最強的前50的基因為NDUFF1、CCL14等,見圖3c。相關基因GSEA富集分析后, KEEG 通路富集分析表明,TOP2A可能參與細胞周期、DNA復制、P53信號通路、氧化磷酸化等過程,見圖3d。

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2.4 抑制TOP2A基因對細胞增殖和遷移的影響 HepG2細胞接種于含 10%胎牛血清的 DMEM 培養液中,在適宜條件下進行培養,待實驗操作結束后分成對照組和實驗組,采取不同的措施,對照組用siRNA進行轉染,實驗組加入TOP2A抑制劑,然后提取兩組的RNA,使用QPCR檢測沉默效果,發現抑制劑

a、b、c分別為TOP2A在GEPIA數據庫、GSE45267數據集、GSE121247數據集中肝癌組織和正常組織中的表達情況 d.GEPIA2數據庫中TOP2A表達與肝癌患者生存期的關系。＊P<0.05,＊＊＊＊P<0.000 1在50nM、48h的條件下,TOP2A在肝癌細胞系中的表達明顯下降,見圖4a。

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利用細胞劃痕實驗來檢測TOP2A對肝癌細胞遷移的影響,實驗結果發現,在0h時,兩組劃痕面積的大小基本一致,對于肝癌細胞遷移的影響無較大差別,但培養24h后,發現對照組劃痕面積明顯變小,實驗組劃痕面積相較于0h時并沒有明顯變化,除此之外,對照組中肝癌細胞的數量顯著增多,呈現雙層甚至三層排列,而實驗組中肝癌細胞的數量變化不大,分布較為散在,見圖4b、c。這就表明,降低TOP2A表達后肝癌細胞的遷移能力下降。

利用CCK-8對正常組和實驗組肝癌細胞的增殖進行研究,結果觀察到,在0～24h內,正常組肝癌細胞的增殖隨時間的推移逐漸上升,而實驗組肝癌細胞的增殖恰好相反,隨時間的推移而逐漸下降,且在12h和24h時,肝癌細胞增殖下降得尤為明顯,見圖4d。表明降低TOP2A使肝癌細胞的增殖明顯下降。

3 討論

肝癌作為嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤之一,其發病率和死亡率逐年明顯上升[8-9],目前雖有手術切除、藥物治療等措施,但因發現時已為肝癌中晚期而導致治療結果不佳,況且預后效果較差[10],因此深入研究肝癌的發生發展機制,探究有價值的生物因素標志對于臨床早發現、早診斷、早治療十分具有意義。TOP2A作為染色體上的上調基因,通過參與DNA的轉錄復制以及染色體的凝集分離等過程調節拓撲狀態和結構[11-12]。研究表明TOP2A 的表達常見于 S 期、G2 期和 M 期,而其表達異?？捎绊懮锕澛?在腫瘤細胞的發生、侵襲、轉移、化療耐藥等過程中有著重要作用[13-15]。本文利用生物信息學以及體外驗證實驗找尋肝癌的核心基因TOP2A并且分析其在肝癌發病以及預后過程的重要價值。

本文研究中,首先通過TIMER 2.0在線數據庫,分析33組腫瘤組織和癌旁組織中TOP2A的表達情況,其次利用HPA數據庫,探索TOP2A在不同腫瘤細胞系和TOP2A在不同肝癌細胞中的表達結果,結果表明,與正常組織相比,TOP2A在大部分腫瘤組織中的表達均明顯上調(P<0.01),說明其可能作為肝癌的診斷標志物,然后進行進一步的調查,發現TOP2A在Hep-G2、Hep3B2等肝癌細胞系中的表達顯著上升,說明TOP2A有望作為肝癌的新生物標志因素。利用GEPIA2數據庫,剖析TOP2A在TCGA數據庫中369例肝癌組織和160例癌旁組織的表達差異,研究顯示,其在腫瘤組織中的表達含量遠高于正常組織,進一步論證了TOP2A參與肝癌的發生與發展。GEPIA2數據庫中選取TOP2A高表達組182例和TOP2A低表達組182例肝癌預后情況,解析了TOP2A的表達與患者生存預后的關系,發現高表達組明顯縮短了患者的生存周期,高表達與患者的預后明顯負相關。最后,利用Linkedomics在線數據庫,尋找肝癌中與TOP2A共表達相關基因,結果顯示19 922個基因與TOP2A表達相關,與TOP2A表達呈正相關的有KIF18B、BUB1B等13 571 個基因,NDUFF1、CCL14等6 351個基因與TOP2A表達呈負相關,通過TOP2A基因共表達和GSEA富集分析,KEGG通路富集證明了TOP2A可能參與細胞周期、DNA復制、P53信號通路、氧化磷酸化等過程,調控機體細胞增殖,免疫反應等過程,細胞周期的失控是腫瘤惡性轉化的標志之一,其功能失控可導致腫瘤細胞向遠處轉移[16]。通過這一系列的生物信息學方法,可以判定TOP2A可以作為評估肝癌的生物因素標志。

為進一步驗證TOP2A對肝癌的影響,利用人肝癌細胞株HepG2進行細胞培養,待培養結束后,分為正常組和實驗組,經過實驗驗證,發現在50nM、48h的條件下,TOP2A在肝癌細胞系中的表達會明顯下降,細胞劃痕實驗表明抑制TOP2A表達后肝癌細胞遷移能力顯著下降,通過CCK-8實驗來探索TOP2A對于肝癌細胞增殖的影響,觀察發現24h內,正常組中肝癌細胞的增殖上升,但實驗組中肝癌細胞的增殖下降,所以我們可以判定,TOP2A可以促進肝癌細胞的增殖。經過生物信息學和體外實驗的結果,提示TOP2A對于肝癌的發生發展有顯著的影響。

綜上所述,TOP2A在肝癌組織中高表達,參與肝癌的發生發展且與不良預后密切相關,可以作為肝癌早期診斷和預后的新生物指標,抑制TOP2A后能夠阻抑肝癌細胞的增殖和遷移[17],因此也給肝癌免疫治療提供新靶點。本研究也有一定的局限性,研究中檢測的樣本量較小,關于TOP2A是否可以作為肝癌診斷的標志性基因還應擴大樣本量并且做更深入的研究;缺乏動物實驗,未考慮肝癌細胞在體內和培養皿環境不同所造成的差異,也未考慮多種動物模型下不同肝癌細胞種類的差異。除此之外研究單單利用了在線數據庫和體外驗證實驗,還需要后期收集臨床樣本,同臨床結合驗證其在肝癌中的表達差異和相關性。本研究也為TOP2A的后續研究提供了一定的思路和依據。