結核分枝桿菌SepF蛋白的生物信息學分析

宋娜娜 李永明 山東省青島市精神衛生中心 266034

由結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)引起的結核病(TB)是導致人類死亡的重要原因。2022年約140萬人死于TB[1]。此外,耐藥結核病例大幅度增長。Mtb感染很難治療,因為Mtb的大部分生命周期都處于非復制(NR)狀態。由于NR Mtb對抗生素作用具有高度耐受性,并且可以突變為耐藥性(DR),因此常規結核病(TB)治療無效。適當控制細胞內病原體Mtb的細胞分裂對其生長、存活、發病機制和抗生素耐藥性至關重要。然而,分枝桿菌調節其細胞周期的分裂成分和機制尚不完全清楚。細胞分裂是細菌繁殖的必要過程了解分枝桿菌的分裂機制及相關作用蛋白可能有助于TB新型疫苗的研發。有研究表明Mtb的Rv2147c基因及其編碼的SepF蛋白是一種細菌細胞分裂相關蛋白[2],參與細菌細胞分裂過程但在TB中結構和功能尚不明確。本研究利用生物信息學方法預測SepF蛋白的結構和功能,為抗結核藥物靶點選擇提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 目的基因及相關編碼信息獲取 從GenBank數據庫中獲取SepF蛋白的核酸及氨基酸序列等信息。SepF蛋白的Gene ID為887394,其蛋白序列為NP_216663.1。

1.2 方法

1.2.1 Rv2147c基因相關信息分析。Rv2147c基因序列信息從NCBI獲取,使用ORF Finger軟件分析其開放閱讀框。

1.2.2 SepF蛋白基本理化性質分析。SepF蛋白的理化特征(如分子質量、分子式、氨基酸構成、不穩定指數等)采用Expasy的Protparam預測。

1.2.3 SepF蛋白的親疏水性及信號肽、跨膜區、磷酸化位點分析。蛋白磷酸化位點是與細胞內信號傳導相關的調節生物活性的特定位點。SepF蛋白的親疏水性采用ProtScale分析;采用SignaIP6.0 Server分析信號肽;采用PSORTb分析亞細胞定位;采用DEEP TMHMM分析跨膜區;采用NetPhos3.1分析磷酸化位點。

1.2.4 SepF蛋白二級結構分析與三級結構建模。將SepF蛋白氨基酸序列輸入SOPMA軟件分析SepF蛋白的二級結構;SWISS-MODEL軟件通過分析氨基酸序列構建三級結構模型。

1.2.5 蛋白質抗原表位分析。應用IEDB軟件預測SepF蛋白的B細胞表位,預測優勢抗原表位;采用軟件預測分析T細胞抗原表位,選取HLA-A*02：01基因型>21分的優勢抗原表位進行綜合分析。

1.2.6 相互作用蛋白預測。SepF的互作蛋白利用STRING數據庫預測并對其生物學功能進行富集。

2 結果

2.1 Rv2147c基因相關信息及序列分析 Rv2147c基因的位于Mtb H37Rv的2406118-2406843,全長657bp,CG含量約占64%。SepF蛋白由218個氨基酸構成,序列號為NP_216663.1。Rv2147c含有3個ORF,最長ORF 657 bp,編碼218個氨基酸(見圖1)。

圖1 Rv2147c基因的開放閱讀框分析

2.2 SepF蛋白的理化性質 SepF蛋白由218個氨基酸構成,分子質量為25 027.83ku,等電點5.40。SepF分子式為C1095H1668N320O337S10,包含3 430個原子。預測SepF蛋白脂肪指數為49.36,不穩定指數53.74,可能為不穩定蛋白。

2.3 SepF蛋白的親疏水性及信號肽、跨膜區、磷酸化位點分析 SepF蛋白親水性系數最高得分為2.222,最低得分為-2.889,為親水性蛋白(見圖2a)。PSORTb分析結果顯示,SepF蛋白定位于胞質。使用SignaIP6.0 Server軟件預測的SepF蛋白信號肽(見圖2b),標準值D值小于閾值,表明SepF蛋白無信號肽端。TMHMM結果表明,SepF蛋白無跨膜螺旋(見圖2c),且218個氨基酸位于膜內側的可能性為1.0。NetPhos 3.1結果顯示,28個磷酸化位點(13個Serine,6個Threonine,9個tyrosine)存在于SepF蛋白(見圖2d)。

圖2 SepF蛋白的親疏水性及信號肽、跨膜區、磷酸化位點分析

2.4 SepF蛋白的二、三級結構 使用SOPMA進預測SepF蛋白二級結構(見圖3a),其中包含29.05%的Hh,8.71%的Ee,3.32%的Tt,58.92%的Cc。SepF蛋白三級結構模型(見圖3b)。

2.5 SepF蛋白相關抗原表位 應用IEDB軟件預測SepF蛋白的B細胞表位,其中序列10-22,39-149,162-163等為優勢抗原表位。采用軟件預測分析T細胞抗原表位,HLA-A*02：01其中>21分以上的有8個。

2.6 SepF相互作用蛋白 STRING數據庫預測SepF的互作蛋白,結果見圖4。包括ftsQ、ftsZ、ftsW、Rv2148c、yfiH等可與SepF蛋白相互作用富集于細胞分裂生物學過程。Rv2148c是一種非必需的保守蛋白,功能未知。在大腸桿菌中,yfiH有助于維持肽聚糖的組成,并且從大腸桿菌染色體中敲除pgeF導致絲氨酸或甘氨酸摻入細胞壁,導致對β-內酰胺類抗生素的敏感性增加。在革蘭陽性菌細胞分裂起始階段聚合的FtsZ與SepF組合形成一種稱為原環的結構。在原始環形成后,“晚期”分裂蛋白(ftsQ、ftsW等)開始組裝以促進參與細胞壁重塑的下游過程[3]。

圖4 SepF蛋白的相互作用蛋白預測

3 討論

耐多藥結核和廣泛耐藥結核的出現嚴重威脅人類和公共衛生安全。細菌對3種或3種以上“二線”抗生素的耐藥性被歸類為極度耐藥結核病(XDR-TB),迫切需要開發具有新作用機制的新型抗結核藥物,與真核細胞不同,細胞分裂在很大程度上仍未用于開發新的細菌治療目的。細胞分裂是生物發展過程中的基本環節,因此它是開發抗結核藥物的一個非常有希望的目標。

生物信息學分析顯示SepF蛋白氨基酸組成中排名前三位的都是脂肪族氨基酸,包括Arg(13.3%)、Asp(12.8%)、Ala(10.1%),有研究表明SepF可能與膜蛋白相互作用,或者SepF是一種外周膜蛋白,并且對脂質雙層本身具有親和力[4],這也表明調控SepF可能會影響Mtb膜結構的分配,從而影響Mtb自身存活或是宿主免疫機制。SepF蛋白為定位于細胞質的親水性蛋白質,含有磷酸化位點表明其與信號傳導相關。本研究預測SepF蛋白含有29.05%的Hh,說明該蛋白相對保守。SepF蛋白Cc占58.92%,說明其具有重要功能。SepF蛋白的重要功能可能為抗結核疫苗的研發提供重要的理論支持。

預測SepF的可能相互作用蛋白為包括ftsQ、ftsZ、ftsW、Rv2148c、yfiH等可與SepF蛋白相互作用富集于細胞分裂生物學過程。細胞分裂是一個復雜的多步驟過程,需要以空間和時間控制的方式有序組裝各種蛋白質。盡管在大腸桿菌中對協調細胞分裂的分子事件進行了最好的研究,但對Mtb的細胞復制過程知之甚少,Mtb是一種生長緩慢的細胞,倍增時間為24h。與大腸桿菌相比,Mtb的細胞分裂機制可能不同。有研究表明SepF在包皮分枝桿菌和枯草芽孢桿菌中參與其細胞分裂過程。保守的細胞分裂蛋白SepF在細胞中Z環的合成過程中與FtsZ形成聚合物,FtsZ是細菌中的關鍵細胞分裂蛋白,這是細胞分裂的第一階段。此外,SepF還充當Z環的膜錨。SepF過表達會阻斷包皮分枝桿菌中的細胞分裂,為什么會這樣尚不清楚。在枯草芽孢桿菌中發現SepF過量生產不會干擾Z環組裝,而是阻止負責隔膜合成的晚期分裂蛋白的組裝[5]。這表明,除了將FtsZ細絲錨定在膜上外,SepF在細胞分裂中也具有調節作用。在革蘭氏陽性菌中,FtsZ聚合物通過外周膜蛋白SepF附著在細胞膜上。一旦Z環組裝完成,所謂的晚期細胞分裂蛋白就會被招募,負責分裂隔膜的合成,例如肽聚糖糖基轉移酶FtsW。晚期蛋白質的組裝需要枯草芽孢桿菌中存在保守的跨膜蛋白FtsL、DivIC和DivIB,以及大腸桿菌中的同源蛋白FtsL、FtsB和FtsQ[6]。這些蛋白質沒有明確的催化結構域,它們可能起著結構作用,并以某種方式調節晚期細胞分裂蛋白向Z環的募集。SepF在包皮分枝桿菌和枯草芽孢桿菌中的研究表明SepF在細菌細胞分裂過程中起著重要作用,了解這一僅限于病原體且宿主中不存在的過程,可能會為開發潛在的新抗菌藥物選擇合理的靶點,為破壞蛋白質—蛋白質相互作用的新藥物的研發提供理論支持。

淋巴細胞表面受體能夠與Mtb的抗原表位結合從而發揮免疫作用,從而為疫苗開發的理論依據。通過生物信息學分析發現SepF蛋白含有大量抗原表位,為新型抗結核藥物提供了理論依據。