溫和灸對IBS 小鼠結腸Trp-kyn/5-HT 代謝的調控機制研究

馬金丹，趙 琛，朱笑吉，陳嘉宜，馬曉芃，黃 艷，王照欽，吳璐一，陳子怡，周次利，陸 嫄*，黃儒德

（1.上海市針灸經絡研究所，上海 200030；2.上海市嘉定區安亭醫院，上海 201805）

腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS）是一種以反復腹痛，伴有排便習慣改變的功能性胃腸疾病。IBS 的發病率高，造成了較大的公共衛生負擔。其病因復雜，可能和遺傳、飲食、感染、腸道微生物和心理問題有關[1]。羅馬IV 標準認為IBS 是一種典型的腦腸互動障礙，其發病與腦-腸軸具有較大關聯[2]。色氨酸（tryptophan，Trp）代謝是參與腦-腸軸的關鍵通路。研究表明，Trp 代謝與IBS 發病相關，其代謝產物可參與機體內臟痛敏過程，產生內臟痛[3]。本研究以IBS 模型小鼠為研究對象，測定艾灸干預對結腸組織Trp 相關產物含量及限速酶的表達狀況的影響，研究艾灸對IBS模型小鼠Trp代謝途徑的調節作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 本研究采用雄性清潔級C57BL/6J 小鼠，體質量（20±2）g，由上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院動物實驗中心提供[實驗動物使用許可證編號：SYXK（滬）2018-0040]。飼養環境：12 小時晝夜節律交替，室溫（20±2）℃，室內濕度50%～70%。實驗符合《關于善待實驗動物的指導性意見》（倫理編號：YYLAC-2019-032）。7 只為正常對照組，余28 只造模。正常對照組預留1 只、造模組預留4 只作模型鑒定。

1.2 試劑與儀器 2，4，6-三硝基苯磺酸（2，4，6-trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS）：Sigma-Aldrich Corporation，美國，P2297；DL-4-氯苯丙氨酸（p-chloro-phenylalanine，PCPA）：Sigma-Aldrich，美國，C8655；1-甲基-D-色氨酸（1-methyl-D-tryptophan，1-MT）：Sigma-Aldrich，美國，452483；抗色氨酸羥化酶1（anti-tryptophan hydroxylase 1， anti-TPH1）：Merck，德國，AB15570-I；抗吲哚胺2，3-雙加氧酶（anti-Indoleamine 2，3-dioxygenase，anti-IDO）：Santa Cruz， 美 國，sc-137012；RT reagent Kit：TAKARA，日本，RR047A；TB Green qPCR 試劑盒：TAKARA，日本，RR420A；LC-MS/MS AB Sciex API 4000 Qtrap，美國， Thermo Fisher；PCR 儀Veriti 96-Well Thermal Cycler（Applied Biosystems）；qPCR 儀LightCycler?480II，美國，Roche。

1.3 動物造模方法 制備IBS 小鼠模型[4]。1M TNBS原液（Sigma-Aldrich Corporation，美國，P2297）溶于30%乙醇液中制備（130 ug/mL，30% EtOH）TNBS 乙醇灌腸液。造模組小鼠提前一天予以禁食，排空消化道，5%葡萄糖溶液飲水。造模時，使用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠后，單次直腸灌注TNBS 灌腸液0.1 mL/只誘導結腸炎癥反應。正常對照組麻醉后灌注0.1 mL 生理鹽水。造模完成后，當天取正常對照及造模組各1 只，第3、7、28 天取1 只進行模型鑒定。自制小鼠腸球囊[5]，進行腹部撤回反射評分（abdominal withdrawal reflex，AWR）評估小鼠內臟痛敏程度變化。解剖并剪取遠端結腸組織作肉眼觀察，HE 染色鏡下確認無明顯炎癥潰瘍，確認造模成功。

1.4 分組與干預 確認模型成功后，將剩余6 只正常對照歸為正常組，余24 只造模小鼠采用隨機數字表法隨機分為模型組、艾灸組、1-MT 組和PCPA 組，每組6 只：1）正常組（n= 6）：不進行任何干預，僅做艾灸組相同的固定，腹腔注射生理鹽水。2）模型組（n=6）：同正常組。3）艾灸組（n= 6）：造模后第28 天，進行固定，行艾灸干預，共7 d，每天1 次。腹腔注射生理鹽水。4）1-MT 組（n= 6）：與艾灸治療同時開始，不進行艾灸干預，僅做與艾灸組相同的固定；配置IDO 阻斷劑1-MT 10 mg/mL 溶液，1 mL 早晚2 次皮下注射[6-7]，共7 d。5）PCPA 組（n= 6）：艾灸治療開始后第5 天，不進行艾灸治療，僅做與艾灸組相同的固定；采用TPH 阻斷劑PCPA 干預[8-9]，小鼠腹腔注射PCPA 500 mg /kg，連續3 d。

1.5 艾灸干預操作方法 在通風環境下，由受訓人員進行干預。安撫小鼠后，仰面固定于固定架，頭套遮住雙眼。參照《實驗針灸學》取小鼠雙側足三里[10]，5 mm 小艾條溫和灸干預，紅外測溫控溫（45±1）℃，每日1 次每次10 min，雙側同時施灸。

1.6 標本采集與指標檢測

1.6.1 標本采集 觀察小鼠一般情況、大便次數及性狀等。將小鼠稱重后按1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，自肛門向上2 cm處剪取2～4 cm結腸組織，縱向剖開，靠近肛門端結腸4%多聚甲醛固定后石蠟包埋，4 μm連續切片，HE 染色。其余于-80 ℃備用。

1.6.2 內臟痛敏檢測 治療前后對小鼠進行直結腸擴張刺激，測AWR 評分[5]。操作前12 h 禁食，刺激前撫摸小鼠腹部，促排糞便。小鼠清醒狀態下將球囊從肛門順直腸生理曲度插入，小鼠置于固定器內。擴張強度分別為15、30、45、60 mm Hg（1 mm Hg ≈0.133 kPa）壓力分級。每個強度測試3 次，根據小鼠行為進行評分。

1.6.3 小鼠結腸TPH1、IDO1 蛋白及mRNA 表達檢測 免疫組化法。每張隨機取3 個視野，計算平均AOD 值。

Real-Time PCR 法：冷凍結腸100 mg 研磨至成粉狀，1 mL Trizol 裂解10 min，取上清加氯仿后室溫10 min，取上清。加入異丙醇混勻，沉淀離心取上清后加入乙醇，吸取乙醇后干燥，加入nucleasefree water，55 ℃水浴溶解RNA，紫外分析濃度。配置反應液，37 ℃孵育15 min，設置兩步法PCR 標準程序。定量分析采用2-ΔΔCT法。引物設計參照Gene Bank 庫，NCBI Primer-blast 設計引物序列，上海捷瑞生物合成，見表1。

表1 TPH1、IDO1 mRNA 引物序列

1.6.4 小鼠結腸Trp-Kyn/5-HT 代謝物檢測 LC-MS/MS 法上機測試結腸Trp、Kyn、5-HTP、5-HT、5-HIAA水平。10 mg 結腸加入80%甲醇300 μL 預冷10 min 后勻漿裂解；4 ℃15 000 r/min 離心10 min；取250 μL 上清液。色譜上樣3 μL，流動相流速0.2 mL/min，洗脫液A 相為0.1%甲酸水溶液，洗脫液B 相為0.1%甲酸乙腈溶液。質譜條件：正離子模式，簾氣（CUR）40 psi，碰撞氣medium，IonsprayVoltage 5 500V，溫度500 ℃，Ionsource gas1（GS1）50 psi，Ionsourcegas2（GS2）50 psi。利用Skyline 數據處理。

1.7 統計學方法 采用SPSS 26.0 進行統計學處理。計量數據若服從正態分布且方差齊，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），自身前后對照采用配對樣本t檢驗；若數據不符合正態分布或方差不齊時用Kruskal-Wailis H檢驗分析，組間兩兩比較采用Mann-Whitney U檢驗，自身前后對照采用Wilcoxon 符號秩和檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠一般情況 正常組小鼠一般情況無異常；小鼠造模后見皮毛干枯，活動減少，飲食尚可，體質量增加減緩，大便質軟；干預后1-MT 組及PCPA 組體質量增長緩慢，艾灸組皮毛色澤、精神狀態均有不同程度改善，攝食增加。各組小鼠結腸組織肉眼觀察狀態正常。

2.2 各組小鼠結腸病理學改變 各組小鼠結腸組織學無明顯差異，黏膜上皮結構均完整，可見由單層柱狀上皮，固有層和黏膜肌層排列整齊，結構完整，未見炎癥潰瘍，見圖1。

圖1 各組小鼠結腸病理學觀察（HE，×40）

2.3 各組小鼠AWR 評分比較 各組小鼠不同強度刺激，30 mm Hg 下，治療前模型組小鼠AWR 評分均高于正常組（P＜0.05），艾灸組小鼠AWR 評分治療后較治療前明顯降低（P＜0.05），見表2。15、45、60 mm Hg 下AWR 評分無明顯差異。

表2 各組小鼠30 mm Hg 下AWR 評分比較

2.4 艾灸對小鼠結腸組織IDO1、TPH1 蛋白表達的干預 各組小鼠結腸IDO1、TPH1 蛋白表達，與正常組相比，模型組小鼠結腸組織IDO1 蛋白表達顯著增高（P＜0.05），模型組小鼠結腸組織TPH1 蛋白表達顯著增高（P＜0.05）；與模型組相比，艾灸組和1-MT組小鼠結腸組織IDO1 蛋白表達明顯下調（P＜0.05），艾灸組和PCPA 組小鼠結腸組織TPH1 蛋白明顯下調（P＜0.05），見表3，圖2，圖3。

圖2 各組小鼠結腸組織IDO1 蛋白表達（免疫組化法）

圖3 各組小鼠結腸組織TPH1 蛋白表達（免疫組化法）

表3 各組小鼠結腸IDO1、TPH1 蛋白表達比較（± s，n = 6）

表3 各組小鼠結腸IDO1、TPH1 蛋白表達比較（± s，n = 6）

注：與模型組比較，# P ＜0.05；與正常組比較，△P ＜0.05

組別 IDO1（AOD 值） TPH1（AOD 值）正常組 119.399±12.480 121.704±9.637模型組 146.230±5.925△ 142.515±15.980△艾灸組 125.435±8.411# 128.341±7.170#1-MT 組 97.537±3.160# 129.300±13.503 PCPA 組 138.695±6.143 80.792±7.612#

2.5 艾灸對小鼠結腸組織IDO1、TPH1 mRNA 表達的干預 與正常組相比，模型組結腸組織IDO1 mRNA 表達明顯升高（P＜0.05），模型組結腸組織TPH1 mRNA 表達明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，1-MT 組結腸組織IDO1 mRNA 表達明顯降 低（P＜0.05），PCPA 組結 腸 組 織TPH1 mRNA 表達明顯降低（P＜0.05），見表4。

表4 各組小鼠結腸IDO1、TPH mRNA 表達比較（n = 6）

2.6 艾灸對小鼠結腸組織Trp-Kyn/5-HT 代謝的影響

2.6.1 各組小鼠結腸組織Trp-Kyn代謝物含量比較 與正常組相比，模型小鼠Kyn/Trp 比值顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，艾灸組Kyn/Trp 比值、1-MT組Kyn 含量及Kyn/Trp 均顯著降低（P＜0.05），見表5。

表5 各組小鼠結腸組織Trp-Kyn 代謝相關物質比較[M（QL， QU），n = 6] pg/mL

2.6.2 各組小鼠結腸組織Trp-5-HT 通路相關代謝物含量比較 與正常組相比，模型小鼠結腸組織5-HT 含量顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，PCPA 組5-HT/Trp 含量顯著降低（P＜0.05），見表6。

表6 各組小鼠結腸Trp-5-HT 通路代謝物含量比較[M（QL， QU），n = 6）] pg/mL

3 討論

IBS 治療包括止瀉藥、抗抑郁藥或腸道微生態調節劑等方式[11]。艾灸是借灸火的溫熱效應（艾灸溫通作用的理論探討），基于其溫經散寒、通腑止痛的功效，通過腹部所過之任脈及胃腸病所屬之足陽明胃經為介導，以達到平衡脾胃氣機升降之效。前期研究結果表明，艾灸可顯著改善IBS 患者腹痛腹脹等癥狀[12]，其鎮痛效應研究結果也已證實[13]。艾灸可能通過調節免疫功能、5-羥色胺以及腸道微生物群等途徑改善IBS[14]，然而尚不清楚艾灸對于IBS 中Trp 代謝的影響。

本實驗中選取的足三里是胃腸疾病的首選穴之一，對“腹痛”“泄瀉”“便秘”等疾病的古代文獻進行數據顯示足三里度值最高，與其他穴位連通性好[15]。研究表明，TRPV1 的激活溫度大于43℃。本課題組研究顯示，以艾灸干預內臟痛模型小鼠，（45±1）℃可增加其足三里局部穴區nTRPV1熒光表達，而（37±1）℃nTRPV1 熒光表達未見增多[16]。

慢性內臟痛是一個中樞外周共同作用產生的病理現象[17-18]，隔藥灸、溫和灸均對慢性炎性內臟痛大鼠有良好的鎮痛作用[19-20]。艾灸可改善痛覺過敏大鼠結腸相關鎮痛物質濃度，提高痛閾值[21]。其痛敏改變是多種物質及通路共同作用的結果[22]。胃腸道局部病變會導致外周穴區到結腸組織中的腸嗜鉻細胞和肥大細胞活化，釋放5-HT[23]降低下丘腦異常升高的P物質、5-羥色胺等含量，可提高痛閾[24]。本研究提示正常與模型小鼠間AWR 評分有差異，模型小鼠存在內臟痛敏現象，艾灸可改善IBS 模型小鼠內臟痛敏程度。

慢性疼痛過程中存在Trp 的代謝紊亂，內臟痛為IBS 的主要癥狀，犬尿氨酸是Trp 參與神經功能調節的重要途徑，亦是內臟疼痛的關鍵[25]。Trp 分解代謝物如Kyn、KA、3-HK 和QA 等具有神經活性，Kyn 代謝物可能通過QA 和KA 調節神經元的興奮性，從而影響神經系統的正常功能。慢性收縮損傷模型小鼠海馬和脊髓中IDO 表達升高，Kyn/Trp 比值升高，5-HT/Trp 比值降低，5-HT/5-HIAA 比值降低[26]。除疼痛等胃腸道癥狀外，IBS 的共病如情緒障礙等與Kyn 濃度改變也有一定相關性，Kyn/Trp 升高，IDO 活性的增強，導致IBS 精神病共病患者重度抑郁現象[27]。IBS患者5-HIAA 水平和5-HIAA/5-HT 比值較健康對照組降低[28]。5-HT 在腸粘膜與5-HT 受體結合。研究表明IBS 模型動物存在內臟高敏感，且血清5-HT、5-HIAA含量均顯著升高，艾灸可通過減少IBS 模型大鼠血清5-HT、5-HIAA 含量改善內臟敏感性[29]，與本研究結果相似，提示IBS 模型小鼠內存在內臟高敏感現象，且存在TPH、IDO 蛋白及mRNA 的過表達，Trp-Kyn途徑限速酶IDO 活性增強。溫和灸治療可下調IBS 模型小鼠體內TPH、IDO蛋白的過表達，降低IDO酶活性。