耐低溫酵母的分離鑒定及對低溫釀造米酒品質的影響

廖 娟，李嘉宇，黃杰惠，陳博慧，楊 濤,*

（1.中南林業科技大學食品科學與工程學院，湖南長沙 410004；2.稻谷及副產品國家工程研究中心，湖南長沙 410004）

米酒是一種以大米為原料的傳統酒精飲料，因其香氣濃郁、口感清爽而備受喜愛[1]。由于發酵原料以及發酵工藝的不同，米酒的風味與醬香型和濃香型白酒相比會顯得相對單調[2]。米酒大多是常溫發酵，常溫下酵母生長和代謝旺盛，酵母快速增長過程中會因代謝產生大量高級醇類物質[3]，大量高級醇會給酒體帶來苦味、且具有較強的致醉性[4]。所以目前市面上米酒普遍存在酯類含量低、高級醇含量偏高的問題，其發展受到香味組分較少、容易致醉、飲后上頭等關鍵問題的制約[5]。

低溫發酵常被用于啤酒、日本清酒及白葡萄酒的生產中，被認為可以增加和保留更多的揮發性香氣成分，從而改善發酵酒的風味[6]。Massera 等[7]發現與25 ℃下發酵相比，低溫發酵的葡萄酒具有更高的酯和更低的萜烯含量。Gamero 等[8]發現低溫發酵下生產的葡萄酒中甘油、乙基酯的產量顯著上升。Urbina 等[9]發現發酵溫度與啤酒中高級醇的含量成正比。目前米酒釀造過程中少有采用低溫發酵工藝的嘗試。為了降低米酒中高級醇的含量、增加酯類物質含量，以提高米酒香氣品質，本研究旨在利用低溫釀造改善米酒品質。

為篩選適合低溫釀造米酒的酵母菌株，本研究以從米曲中分離純化出酵母為研究對象，測定其低溫下產香情況、發酵能力、產乙醇能力和產酯能力，篩選出一株優良耐低溫產香酵母，通過菌落形態觀察并結合分子生物學鑒定篩選得到的酵母菌，并分析其生長特性和耐受性。利用篩選得到耐低溫酵母，進行低溫米酒發酵實驗，分析低溫米酒和常溫米酒的理化指標及感官評價。該研究對低溫發酵米酒的開發具有重要參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

秈米 金龍魚糧油食品股份有限公司；米曲樣品來源于廣西、四川、貴州、湖南、湖北等地的七種米曲；安琪酵母（AngelSaccharomyces cerevisiae）安琪酵母股份有限公司；孟加拉紅培養基 廣東環凱生物科技有限公司；酵母粉、蛋白胨 賽默飛世爾科技有限公司；糖化酶（100000 U/g）、α-淀粉酶（40000 U/g） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；2,3,5-三苯基氯化四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC） 上海麥克林生化科技有限公司；其余試劑均為國產分析純。

HS-10 頂空進樣器、Nexis GC-2030 氣相色譜儀日本島津公司；BA200 顯微鏡 麥克奧迪實業集團有限公司；MIR-150A 恒溫培養箱 上海SANTN公司；TD5A-WS 臺式高速離心機 湖南湘儀實驗儀器開發有限公司；UV-2600 紫外可見光分光光度計日本島津公司；A300 聚合酶鏈式反應儀 杭州朗基科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基的配制 孟加拉紅培養基（g/L）：蛋白胨 5.0，KH2PO41.0，MgSO40.5，葡萄糖10.0，氯霉素0.1，孟加拉紅0.033，瓊脂20.0，121 ℃滅菌20 min；YPD 固體培養基（g/L）；酵母膏10，蛋白胨20，葡萄糖20，瓊脂20，121°C滅菌20 min；米曲汁培養基：秈米500 g，淘洗干凈后加水沒過，浸泡5 h，上鍋蒸煮直至大米煮熟，冷卻，拌入米根霉，30 ℃培養40 h。然后加水淹沒培養物，60 ℃糖化6 h，過濾，將濾液糖度調至15°Bx，pH 調至6；米曲汁固體培養基：米曲汁培養基中加入2%的瓊脂；TTC 上層培養基（g/L）：2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）0.5，葡萄糖5，瓊脂15；TTC 下層培養基（g/L）：MgSO40.4，KH2PO41.0，酵母浸出粉1.5，蛋白胨2，葡萄糖10，瓊脂20，調節pH 至5.5。

1.2.2 酵母菌種的分離純化 根據參考文獻[10]的方法并加以修改，稱取0.1 g 米曲溶于10 mL 無菌水中，30 ℃、170 r/min 搖床培養30 min，靜置取上層菌懸液，梯度稀釋涂布于孟加拉紅瓊脂平板上，30 ℃培養24 h，挑取符合酵母菌落形態的菌株，采用平板劃線法接于YPD 固體培養基上，30 ℃培養48 h，純化得到純菌株。將純化得到的菌株接種于YPD 培養基中，150 r/min、30 ℃搖床培養24 h 得到種子液，種子液稀釋至107CFU/mL，4 ℃保存備用。

1.2.3 耐低溫產香酵母的篩選

1.2.3.1 酵母的初篩 將分離純化得到的菌株接種于米曲汁固體培養基平板上，15 ℃培養至菌落成型，通過嗅聞法[11]對酵母菌株進行香氣評價，排除其中香氣不協調、不舒適的菌落，初步篩選具有酯香、甜香、酒香等香氣的菌株進行復篩。

1.2.3.2 酵母的二級篩選 將初篩得到的菌株種子液分別以2%的接種量接種于盛有倒置杜氏小管的米曲汁培養基中，采用杜氏小管發酵法[12]，170 r/min、15 ℃搖床培養，觀察杜氏管內氣體的產生情況，記錄氣泡在杜氏小管中的高度，篩選產氣多且快的酵母進行三級篩選。

1.2.3.3 酵母的三級篩選 將二級篩選得到的菌株劃線接種于TTC 下層培養基上，15 ℃下培養至菌落成型，倒入TTC 上層培養基，15 ℃下遮光培養2～3 h，觀察培養皿上菌落的顯色情況[13]。菌落顏色越紅，菌株的產乙醇能力越強，篩選出產乙醇能力強的酵母進行四級篩選。

1.2.3.4 酵母的四級篩選 將三級篩選得到的菌株種子液分別以2%的接種量接種于米曲汁培養基中，15 ℃搖床培養15 d 后，取發酵液2 mL 進行乙酸乙酯含量的測定，采用氣相色譜法，參考黃慧芬[14]，篩選產乙酸乙酯能力最好的菌株。

1.2.4 耐低溫產香酵母的鑒定

1.2.4.1 形態學觀察 取一環純化后的菌株在YPD平板上劃線，30 ℃培養48 h，取平板進行觀察。用接種針沾取菌苔于載玻片上，滴加1 滴無菌水，蓋上蓋玻片，于光學顯微鏡下10×40 倍觀察菌株細胞形態。

1.2.4.2 分子生物學鑒定 使用真菌通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）、ITS4（5'-TCC TCCGCTTATTGATATGC-3'）擴增菌株的ITS 序列；PCR 反應體系：預混酶20 μL；引物ITS1、ITS4 各2 μL；菌液2 μL；ddH2O 15 μL。擴增條件：預變性98 ℃、2 min；變性 98 ℃、10 s；退火56 ℃、10 s；延伸72 ℃、10 s/kb，循環35 次；再延伸72 ℃、5 min；4 ℃保存。將擴增好的PCR 產物進行瓊脂糖凝膠電泳。電泳條帶送至武漢擎科生物公司測序。測序結果提交于美國國立生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）的Gen-Bank 數據庫中，采用基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）進行同源性搜索，選取同源性較高的模式菌株的ITS rRNA 基因序列，使用MEGAX 軟件中的鄰接法構建系統發育樹。

1.2.5 耐低溫產香酵母的生長曲線測定 根據參考文獻[15]的方法并加以修改，酵母種子液以2%的接種量接種至YPD 培養基中，分別于30 ℃、15 ℃，150 r/min 搖床培養。定時取樣測定OD540nm值，以時間為橫坐標，OD540nm值為縱坐標，繪制出菌株的生長曲線；同時繪制安琪釀酒酵母（AQJM）的生長曲線作為對照。

1.2.6 耐低溫產香酵母的耐受性實驗

1.2.6.1 乙醇耐受性 酵母種子液以2%的接種量接種至不同乙醇濃度（0%vol、2%vol、4%vol、6%vol、8%vol、10%vol、12%vol）的YPD 培養基，30 ℃、150 r/min 搖床培養24 h，測定OD540nm值，比較生長情況。

1.2.6.2 糖耐受性 酵母種子液以2%的接種量接種至不同葡萄糖含量（2%、10%、20%、30%、40%、50%、60%）的YPD 培養基，30 ℃、150 r/min 搖床培養24 h，測定OD540nm值，比較生長情況。

1.2.6.3 酸耐受性 酵母種子液以2%的接種量接種至不同pH（乙酸調，3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0）的YPD 培養基，30 ℃、150 r/min 搖床培養24 h，測定OD540nm值，比較生長情況。

1.2.6.4 溫度耐受性 酵母種子液以2%的接種量接種至YPD 培養基，分別于不同溫度（10、15、20、25、30、35、40 ℃）下、150 r/min 搖床培養48 h，測定OD540nm值，比較生長情況。

1.2.7 耐低溫產香酵母低溫釀造米酒實驗 根據參考文獻[16]的方法并加以修改，250 g 秈米浸泡3 h 后，按料液比1:3 秈米與水混合，用打漿機磨漿。加入10 U/g 高溫α-淀粉酶，溫度90 ℃、液化時間45 min，冷卻至室溫，加入糖化酶250 U/g，溫度60 ℃，糖化時間60 min，冷卻至室溫，以2%的接種量接種酵母XQ2-8 種子液，置于錐形瓶中封口膜密封，在15 ℃下發酵，監測其失重，當24 h 內失重＜0.02 g 時視為發酵結束，記錄其發酵時長，發酵結束后離心過濾獲得米酒，并以30 ℃下發酵獲得的米酒作為對照。

1.2.8 米酒理化指標分析及感官評價 還原糖含量的測定：采用DNS 法[17]；總酸、酒精度及pH 的測定：參照GB/T 13662-2018 黃酒中方法[18]；總酯含量的測定：采用皂化回流法[19]；總高級醇含量的測定：采用氣相色譜法，參考黃慧芬[14]；感官評價：感官評價小組由10 位經過訓練的品評師組成，實驗在食品感官品評室中進行，樣品隨機呈現。香氣、滋味、色澤、典型性4 個維度，每個維度25 分，總分為100 分，具體評分標準見表1。

1.3 數據處理

利用Excel、SPSS、GraphPad Prism 8 軟件對數據進行分析處理，使用MEGA11 軟件構建系統發育樹。實驗均進行3 次重復，結果表示為“平均值±標準偏差”。

2 結果與分析

2.1 耐低溫產香酵母的初篩

從多個米曲樣本中分離、純化后共得到69 株品質優良、性狀穩定的酵母菌，將得到的菌株接種于米曲汁固體培養基平板上，嗅聞法對各酵母菌株進行香氣評價，排除其中香氣不協調、不舒適的菌落，初步篩選得到47 株產香舒適的菌株，根據菌株樣本的米曲來源進行編號。初步篩選的目的是為了選出具有產香能力的酵母菌，由圖1 所示，本實驗篩選所得酵母的香氣類型可分為7 類，按其占比從高至低包括：酒香共15 株占比33%、淡果香共7 株占比15%、濃郁酯香共7 株占比15%、濃郁果香共6 株占比13%、酯香共5 株占比10%、清香共4 株占比8%和其他（中藥香和煙熏香）共3 株占比6%。

圖1 酵母香氣類型分類圖Fig.1 Yeast aroma classification

2.2 耐低溫產香酵母的二級篩選

初次篩選得到的47 株有產香能力的酵母菌株采用杜氏管發酵法，以發酵過程中酵母的產氣情況來表達菌株的發酵能力[20]。初篩后得到的47 株產香酵母以及對照菌株安琪釀酒酵母（AQJM）的產氣情況見表2，有38 株酵母具有產氣能力，其中有10 株酵母菌株發酵管中杜氏小管中空氣高度高于30 mm，具有極強的產氣能力，菌株編號分別是XQ1-3、XQ2-8、XQ3-5、XQ4-2、XQ4-3、XQ5-8、XQ6-2、y-8、YRJM、N9-2，這些菌株相比于其他菌株有更強的發酵能力。因此，選擇具有較好低溫下發酵能力的10 株產香酵母進行下一步篩選。

表2 杜氏小管篩選產氣結果Table 2 Duchenne tubule screening results of gas production

2.3 耐低溫產香酵母的三級篩選

TTC 是一種顯色劑，能與酵母代謝物發生顯色反應，可以用來判斷酵母產乙醇能力的強弱[21]。觀察培養皿中菌落的顏色，產乙醇能力越強的菌株菌落呈現深紅色，產乙醇能力弱的菌株菌落呈現粉紅色或不顯色。結果如表3 所示，菌株XQ1-3、XQ4-2、XQ5-8、N9-2、XQ2-8、XQ3-5 在TTC 培養基上的顏色與對照菌株安琪釀酒酵母（AQJM）的顏色相當或更深，說明其產酒精能力與對照菌株AQJM 相當或更強。因此，選擇XQ1-3、XQ2-8、XQ3-5、XQ4-2、XQ5-8、N9-2 進行下一步篩選。

表3 酵母菌在TTC 培養基上的顯色結果Table 3 Color development results of yeast cultured on TTC medium

2.4 耐低溫產香酵母的四級篩選

產酯能力強的酵母可對米酒的感官品質起到修飾、提高作用。乙酸乙酯被廣泛認為是米酒、黃酒等以大米為原料的發酵酒的特征香氣物質[22]。乙酸乙酯能賦予發酵食品以水果香，是酒精飲料中最為常見的乙酯類香氣物質，存在于所有香型的酒類中[23]。如圖2 所示，在相同發酵條件下各酵母菌株的產乙酸乙酯能力差異較大，其中酵母XQ2-8 的產乙酸乙酯的含量最高，為41.2 mg/L。因此選擇菌株XQ2-8 進行后續實驗。

圖2 不同菌株產乙酸乙酯含量的比較Fig.2 Comparison of ethyl acetate produced by different strains

2.5 酵母XQ2-8 的鑒定

2.5.1 酵母XQ2-8 形態學觀察 將酵母XQ2-8 在YPD 平板中劃線，30 ℃培養至菌落成型，菌落形態如圖3A，菌落長勢良好，呈乳白色、質地均勻、呈圓形、邊緣整齊、濕潤黏稠易挑起；顯微鏡下細胞形態特征如圖3B，細胞呈卵圓形，出芽生殖，無鞭毛及假絲，屬酵母的典型特征。

圖3 XQ2-8 酵母的菌落形態（A）及細胞形態（B）Fig.3 Colony morphology (A) and cell morphology(B) of XQ2-8

2.5.2 酵母XQ2-8 分子生物學鑒定 對篩選到的酵母XQ2-8 進行ITS 序列測序，數據在NCBI 數據庫中登錄，序列號為OR003908，并進行BLAST 比對，用MEGA-X 軟件繪制菌株XQ2-8 基因序列相關菌株的系統發育樹，結果見圖4。菌株XQ2-8 與MH979683.1Saccharomyces cerevisiae聚在一個分支上；再結合菌落形態、鏡檢結果分析，確定菌株XQ2-8 為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

圖4 XQ2-8 ITS 序列系統發育樹Fig.4 ITS sequence phylogenetic tree of XQ2-8

2.6 酵母XQ2-8 的生長曲線

酵母XQ2-8 在YPD 培養基中30 ℃和15 ℃下培養的生長曲線如圖5，酵母XQ2-8 在30 ℃下培養，在0～8 h 為遲緩期，生長速率緩慢；8～20 h 為對數生長期，生長速率最大；20 h 后進入穩定期，OD540nm值基本保持在1.68。酵母XQ2-8 在15 ℃下培養，在0～1 d 為遲緩期，相比30 ℃下遲緩期延長；1～5 d為對數生長期；5 d 后進入穩定期，OD540nm值基本保持在1.65。酵母XQ2-8 在30 ℃下的生長曲線與對照菌株安琪釀酒酵母（AQJM）基本一致，但15 ℃下安琪釀酒酵母延滯期更長為2 d，2～7 d 為對數生長期，7 d 后進入穩定期，且達到穩定后的生物量也降低。在生產中延滯期短的菌株有更好的適應能力[24]，可在短時間內形成優勢，減少副產物的形成，縮短發酵周期，有利于提高發酵效率。說明酵母XQ2-8 具有耐低溫性，適用于低溫下釀造米酒。

圖5 XQ2-8 菌株在30 ℃（A）和15 ℃（B）下生長曲線Fig.5 Growth curve of strain XQ2-8 at 30 ℃ (A) and at 15 ℃ (B)

2.7 酵母XQ2-8 的耐受性分析

高濃度乙醇會抑制酵母菌細胞的生長，影響其發酵效果[25]。具有一定耐乙醇能力的酵母能夠使發酵更加完全、徹底[26]。酵母XQ2-8 對乙醇的耐受性見圖6a，隨著乙醇體積分數增加，酵母XQ2-8 的生物量逐漸降低，耐受能力逐漸減弱。在乙醇濃度為8%vol 時，酵母呈現微弱生長；在乙醇濃度＞8%vol時，酵母的生長基本停止。米酒的酒精度多為3%vol～7%vol，說明酵母XQ2-8 能夠在米酒發酵過程中正常生長。王奇盛[27]從酒醅中分離出的釀酒酵母在8%vol 的乙醇濃度下生長能力顯著降低，與本文結果一致。

葡萄糖是酵母菌發酵的營養來源，但過高的葡萄糖含量會抑制酵母菌的生長[28]。應用于生產中的酵母菌株應具備良好葡萄糖耐受能力[29]。楊寧等[30]將從白酒酒醅中分離出的酵母JM2 與安琪釀酒酵母對比，發現二者在葡萄糖含量50%的條件下基本停止生長。酵母XQ2-8 對葡萄糖的耐受性見圖6b，隨著葡萄糖含量的增加，酵母XQ2-8 的OD540nm值降低。當葡萄糖含量＞30%時，酵母的生物量明顯下降，但在葡萄糖含量為60%時，酵母XQ2-8 仍可生長。說明該菌種葡萄糖耐受性較好，可用于米酒生產發酵。

酵母菌最適生長pH 通常為4～5，發酵過程中產生的酸性物質會導致體系酸度的變化。張樂等[31]發現，釀酒酵母具有一定的酸耐受性有利于提升酵母的發酵速率。應用于生產的酵母應具備良好的耐酸性。酵母XQ2-8 對酸的耐受性見圖6c。當pH 為3.0～6.0 時，隨著pH 不斷升高，酵母XQ2-8 的生物量逐漸升高至穩定，當pH 為5.5 時菌株的生長狀況最佳，在pH 為3.0 時菌株生物量低但仍可生長，米酒的pH 在3.8～4.5 之間[32]，說明酵母XQ2-8 能夠適應米酒釀造過程中的pH 環境。陳麗花等[10]從甜酒曲中分離的多株酵母在pH3.0～11.0 之間均能生長，這與本實驗結果相似。

溫度會直接影響酵母的生長繁殖，溫度較高，酵母生長較快容易加速衰亡，溫度較低會導致酵母生長周期變長[33]。本文旨在利用低溫發酵米酒，故對于所篩選菌株的低溫耐受性至關重要。酵母XQ2-8 對溫度的耐受性見圖6d。酵母XQ2-8 在10～35 ℃范圍內均能生長，在25 ℃條件生長情況最好，且在10 ℃下仍有一定生長能力，說明釀酒酵母XQ2-8 具有一定的低溫耐受性，能夠適用于低溫發酵米酒。

2.8 酵母XQ2-8 對低溫發酵米酒品質的影響

利用上述實驗篩選得到耐低溫酵母XQ2-8，進行低溫米酒發酵實驗，同時以30 ℃下發酵的米酒為對照組，15 ℃和30 ℃下發酵時長分別是13 d 和6 d，發酵結束后其理化指標及感官得分見表4，低溫米酒殘糖量和酒精度分別為5.61 g/L、7.81%vol，與常溫米酒無顯著差異（P＞0.05），且符合米酒標準NY/T 1885-2017《綠色食品 米酒》[34]?？偹岷?.91 g/L、總酯含量60.08 mg/L、甘油含量2.59 g/L、高級醇含量578.20 mg/L、感官評分89.47，與常溫米酒差異顯著（P＜0.05）。相比30 ℃下釀造的米酒，15 ℃下釀造的米酒總酯含量提高15.6%、甘油含量提高22.7%、高級醇含量降低17.7%，這一結果與Molina 等[35]、Beltran 等[36]對比低溫常溫下發酵葡萄酒、啤酒的結果相似。目前米酒中酯類含量相對較低，高級醇含量相對高于其他酒種，酯類含量低使米酒香味寡淡[37]，高級醇含量高使酒體呈現苦味[38]，具有較強的致醉性[39]。甘油是酵母酒精發酵過程中主要副產物之一[40]，可為酒體提供圓潤、柔滑口感，一定含量甘油可增加米酒復雜性[41]。低溫釀造使米酒中酯類、甘油含量提高，高級醇含量降低，可以改善米酒品質。

表4 米酒理化指標分析Table 4 Analysis of physicochemical indexes of rice wine

3 結論

本文以從米曲中篩選得到的69 株酵母菌株為研究對象，比較其低溫下的產香、發酵、產酒精和產酯能力，獲得1 株低溫下發酵性能優良且產香能力強的菌株XQ2-8，經鑒定為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。在低溫下菌株XQ2-8 比對照菌株生長延滯期更短、達到穩定時生物量更高，生長周期更短，具有良好的耐低溫特性；菌株XQ2-8 可在乙醇體積分數8%vol、葡萄糖含量60%、pH3.0、低溫10 ℃的條件下生長。利用菌株XQ2-8 低溫釀造米酒發現，與常溫釀造米酒相比，低溫米酒的總酯含量和甘油含量分別提高了15.6%和22.7%；總酸含量和總高級醇含量分別降低了18.0%和17.7%、感官得分提高了11.7%，說明菌株XQ2-8 低溫釀造米酒能有效改善米酒飲后上頭、風味組分少的問題，提高米酒品質。

本研究篩選了一株適用于低溫釀造米酒的優良菌株，且利用該菌株低溫釀造米酒能夠有效提高米酒的風味品質，對于開發低溫米酒釀造工藝有較強的工業應用價值。但目前低溫發酵仍然存在發酵周期長的問題，不利于大規模工業化生產。在未來，對低溫米酒釀造工藝的優化還有待深入研究。

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